Bahan dan Zat kimia Berbahaya - PEMISAHAN DAN FRAKSINASI MINYAK
PEMISAHAN DAN FRAKSINASI MINYAK Aquilaria malaccensis
MENGGUNAKAN EKSTRAKSI CAIR SUPER KRITIS DAN PENGUJIAN
SITOTOKSIK DARI EKSTRAK MINYAK
A. Persiapan Bahan
Gas CO2 dengan kemurnian 99 g/kg yang disimpan dalam silinder gas
pada suhu di bawah -5°C. Kulit batang pohon gaharu (Aquilaria malaccensis).
Garis sel kanker manusia HCT116. Media kultur sel, serum janin sapi,
penisilin dan larutan Streptomisin. MTT(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5,difeniltetrazolium bromide,senyawa tetrazolium kuning dan dimetil sulfoksida
(DMSO).
B. Metode
1. Ekstraksi super kritis
Kulit batang segar disiapkan bersih dan terinfeksi dengan bagian
endofit. Selanjutnya dipotong kecil-kecil dan dikeringkan dalam oven
pada suhu 50°C semalam. Sampel digiling menggunakan penggiling
analitis. Serbuk yang telah digiling kemudian dilewatkan melalui saringan
untuk mendapatkan ukuran partikel ≤ 500μm. Ekstraksi CO2 superkritis
dilakukan dengan menggunakan sistem ekstraksi SFE. Sekitar 2 g sampel
ditempatkan dalam bejana dan diekstraksi pada suhu 40°C dan 50°C
dengan tekanan berkisar antara 20,7; 27,6 dan 34,5 MPa dengan
menggunakan laju alir CO2 ≤ 1 mL/menit selama 60 menit. Minyak
dikumpulkan dalam botol vial. Jumlah minyak dihitung dengan kenaikan
berat pada akhir proses ekstraksi dan disimpan pada suhu -20°C. Minyak
gaharu difraksinasi menggunakan ekstraksi superkritis pada suhu 50°C,
tekana 34,5 MPa, laju alir CO 2 ≤ 1 mL/menit dan ukuran partikel ≤ 500
μm menjadi 3 fraksi menggunakan waktu dinamis dari 10 menit untuk
masing-masing fraksi.
2. Uji sititoksisitas
Sitotoksisitas minyak gaharu pada sel tumor diukur MTT (Mikrokultur
Tetrazolium) assay. Sebuah lempeng ditambahkan 300 mL medium
yangmengandung 1x10-3- sel HCT dalam suspense dan diinkubasi selama
setidaknya 24 jam sebelum pengobatan. Sel-sel diperlakukan dengan
sampel minya yang telah diekstraksi superkritis pada konsentrasi 25
μg/mL. DMSO digunakan sebagai kontrol negatif dan suramin sebagai
kontrol positif. Semua sampel yang diuji dilakukan dalam rangkap tiga
dan dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Setelah 48 jam inkubasi dalam
5% CO pada 37°C, garam tetrazolium ditambahkan sebagai indikator
sitotoksisitas untuk kelangsungan hidup sel. Pada pembacaan absorbansi
tercatat panjang gelombang sebesar 590 nm dan panjang gelombang 650
nm. Nilai dinyatakan sebagai persentase dari rata-rata viabilitas sel relative
terhadap kultur yang tidak diobati. Percobaan yang sama diulang dengan
menggunakan fraksi minyak pada konsentrasi yang sama dari 25 μg/mL
dan pada 2,5; 5; 10; 15; 20 dan 25 μg/mL dan diinkubasi selama 48 jam
dalam 5% CO2 pada 37oC dalam rangka menentukan nilai IC50 masingmasing.
C. Hasil dan Diskusi
Pengaruh suhu dan tekanan pada hasil ekstraksi
dari A. Malaccensis
dengan CO2 superkritis diperiksa pada uji ini dan juga ujisitotoksisitas dari
bahan yang diekstraksi. Parameter ekstraksi yang diuji untuk mendalami
kondisi ekstraksi yang memberikan hasil minyak tertinggi dari A.
Malaccensis. Parameter ini adalah: suu (40 dan 50°C); tekanan (20,7; 27,6 dan
34,5 MPa). Ukuran sampel tetap (≤500μm) dan laju alir CO 2 (≤1 mL/menit).
Ukuran sampel ditetapkan ≤500 μg/mL berdasarkan pada uji terdahulu. Telah
diketahui bahwa pengurangan ukuran matriks partikel akan meningkatkan
hasil ekstraksi. Selain itu, penurunan ukuran partikel pada ekstraksi cairan
superkritis akan menciptakan luas permukaan sehingga lebih mengarah untuk
meningkatkan hasil ekstraksi. Laju alir memiliki pengaruh yang kuat pada
efisiensi ekstraksi dalam ekstraksi superkritis. Semakin lambat kecepatan
fluida, semakin dalam menembus matriks yang dapat meningkatkan hasil
ekstraksi secara positif. Dalam uji ini, hasil ekstraksi superkritis menunjukkan
bahwa hasil ekstraksi meningkat dengan meningkatnya tekanan dan suhu. Uji
lain juga melaporkan bahwa peningkatan suhu dan tekanan akan
meningkatkan hasil ekstraksi superkritis. Bagaimanapun, kenaikan suhu akan
meningkatkan ekstraksi secara signifikan. Minyak hasil ekstraksi tertinggi
adalah 3,66 g/100g sampel yang diperoleh pada 50 º C; 34,5 MPa dengan
waktu dinamis 30 menit. Meningkatkan suhu 40-50 º C akan mengakibatkan
peningkatan hasil ekstraksi. Namun, hasil ekstraksi lebih tinggi pada semua
tekanan dan pada suhu 50 º C. Sementara menurunkan suhu membutuhkan
kebutuhan tekanan ekstraksi yang lebih tinggi untuk mengekstrak hasil lebih.
Dalam penelitian ini ditemukan bahwa pada 40 º C hasil ekstraksi tertinggi
adalah 2,3 g/100g pada tekanan 34,5 MPa, sedangkan ekstrak terendah adalah
1,7 g/100 g sampel pada 40 º C dengan tekanan 20,7 MPa. Hal ini disebabkan
oleh penurunan densitas CO2 bersamaan dengan meningkatnya suhu pada
tekanan konstan, yang menyebabkan peningkatan uap zat terlarut dan
peningkatan kualitas ekstraksi. Data ini konsisten dengan penelitian lain yang
telah
dilaporkan
yang
menunjukkan
bahwa
peningkatan
temperatur
meningkatkan hasil ekstraksi pada tekanan konstan.
Hasil ekstraksi meningkat secara signifikan dengan meningkatnya tekanan
pada suhu yang lebih tinggi. Hasil ekstraksi tertinggi adalah 3,66 g sampel
oil/100g pada tekanan 34,5 MPa pada 50º C dengan laju alir CO 2 ≤ 1ml/menit,
ukuran partikel ≤ 500 μm selama 30 menit. Ditemukan bahwa peningkatan
tekanan pada suhu konstan akan meningkatkan densitas CO2 yang
menghasilkan peningkatan kelarutan komponen minyak dan peningkatan hasil
ekstraksi.
Properti
sitotoksik
dari
ekstrak
minyak
A.Malaccensis
menggunakan ekstraksi superkritis diselidiki dengan menggunakan sel kanker
usus besar manusia HCT-116. Hasil percobaan menunjukkan bahwa semua
ekstrak superkritis sampel A. Malaccensis adalah sitotoksik pada sel kanker
usus besar HCT116 menggunakan konsentrasi 25 ug/ml ekstrak minyak.
Namun, suhu menunjukkan pengaruh yang signifikan pada ekstrak sampel dan
peningkatan properti sitotoksik. Telah ditemukan bahwa semua ekstrak sampel
pada suhu 50 º C memiliki potensi sitotoksik dibandingkan ekstrak sampel
pada 40 º C pada tekanan konstan. Sampel sitotoksik yang paling berpotensi
adalah ekstrak sampel pada suhu 50 º C dan tekanan 20,7 MPa yang
menghambat 99% pertumbuhan sel kanker usus besar pada konsentrasi 25 ug /
ml. Perbedaan dalam aktivitas memberikan kontribusi untuk meningkatkan
suhu pada tekanan konstan akan menurunkan densitas CO2 yang mengarah
pada peningkatkan uap zat terlarut, peningkatkan kelarutan dan peningkatkan
selektivitas senyawa yang diekstrak. Namun demikian, tekanan superkritis
memiliki efek beragam pada sifat sitotoksisitas ekstrak minyak dari A.
Malaccensis. Ditemukan bahwa pada suhu konstan 40 º C dan peningkatkan
tekanan 20,7-34,5 MPa telah meningkatkan sifat sitotoksik sampel lebih dari
50%. Ditemukan bahwa ekstrak sampel pada tekanan 20,7 MPa menghambat
pertumbuhan sel kanker usus sebesar 41% dan meningkat menjadi 84%
dengan menggunakan sampel pada tekanan 34,5 MPa pada suhu konstan 40º
C. Sebaliknya, ditemukan bahwa ekstrak sitotoksik tertinggi diperoleh pada
tekanan terendah dari 20,7 MPa dan 50 º C dengan 99% tingkat penghambatan
pertumbuhan sel. Penambahan tekanan mengakibatkan penurunan properti
sitotoksik dari ekstrak sampel. Ditemukan bahwa penghambatan pertumbuhan
sel kanker berkurang dari 99% untuk ekstrak sampel pada 20,7 MPa sampai
94% untuk ekstrak sampel pada tekanan 27,6 dan 34,5 MPa.
Sampel yang paling sitotoksik kemudian difraksinasi menjadi tiga fraksi
menggunakan ekstraksi superkritis dengan waktu ekstraksi 10 menit. Tiga
fraksi kemudian diuji oleh MTT assay untuk menyelidiki fraksi paling
sitotoksik. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fraksi yang diperoleh dari
10 menit pertama (F1) dari minyak A. malaccensis, (50 º C; 20,7 MPa dan laju
alir CO2 ≤ 1 ml/menit; ukuran partikel ≤ 500 μm) memiliki aktivitas sitotoksik
tertinggi terhadap sel kanker usus besar HCT 116. Ditemukan, bahwa
menggunakan konsentrasi 25 μg/ml minyak A. malaccensis, pertumbuhan sel
kanker usus dihambat sebanyak 94%, 16% dan 14% menggunakan fraksi F1,
F2 dan F3 masing-masing. IC50 untu fraksi F1 yang paling sitotoksik adalah
3,5 μg/ml yang merupakan jumlah obat yang dapat membunuh 50% dari selsel.
MENGGUNAKAN EKSTRAKSI CAIR SUPER KRITIS DAN PENGUJIAN
SITOTOKSIK DARI EKSTRAK MINYAK
A. Persiapan Bahan
Gas CO2 dengan kemurnian 99 g/kg yang disimpan dalam silinder gas
pada suhu di bawah -5°C. Kulit batang pohon gaharu (Aquilaria malaccensis).
Garis sel kanker manusia HCT116. Media kultur sel, serum janin sapi,
penisilin dan larutan Streptomisin. MTT(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5,difeniltetrazolium bromide,senyawa tetrazolium kuning dan dimetil sulfoksida
(DMSO).
B. Metode
1. Ekstraksi super kritis
Kulit batang segar disiapkan bersih dan terinfeksi dengan bagian
endofit. Selanjutnya dipotong kecil-kecil dan dikeringkan dalam oven
pada suhu 50°C semalam. Sampel digiling menggunakan penggiling
analitis. Serbuk yang telah digiling kemudian dilewatkan melalui saringan
untuk mendapatkan ukuran partikel ≤ 500μm. Ekstraksi CO2 superkritis
dilakukan dengan menggunakan sistem ekstraksi SFE. Sekitar 2 g sampel
ditempatkan dalam bejana dan diekstraksi pada suhu 40°C dan 50°C
dengan tekanan berkisar antara 20,7; 27,6 dan 34,5 MPa dengan
menggunakan laju alir CO2 ≤ 1 mL/menit selama 60 menit. Minyak
dikumpulkan dalam botol vial. Jumlah minyak dihitung dengan kenaikan
berat pada akhir proses ekstraksi dan disimpan pada suhu -20°C. Minyak
gaharu difraksinasi menggunakan ekstraksi superkritis pada suhu 50°C,
tekana 34,5 MPa, laju alir CO 2 ≤ 1 mL/menit dan ukuran partikel ≤ 500
μm menjadi 3 fraksi menggunakan waktu dinamis dari 10 menit untuk
masing-masing fraksi.
2. Uji sititoksisitas
Sitotoksisitas minyak gaharu pada sel tumor diukur MTT (Mikrokultur
Tetrazolium) assay. Sebuah lempeng ditambahkan 300 mL medium
yangmengandung 1x10-3- sel HCT dalam suspense dan diinkubasi selama
setidaknya 24 jam sebelum pengobatan. Sel-sel diperlakukan dengan
sampel minya yang telah diekstraksi superkritis pada konsentrasi 25
μg/mL. DMSO digunakan sebagai kontrol negatif dan suramin sebagai
kontrol positif. Semua sampel yang diuji dilakukan dalam rangkap tiga
dan dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Setelah 48 jam inkubasi dalam
5% CO pada 37°C, garam tetrazolium ditambahkan sebagai indikator
sitotoksisitas untuk kelangsungan hidup sel. Pada pembacaan absorbansi
tercatat panjang gelombang sebesar 590 nm dan panjang gelombang 650
nm. Nilai dinyatakan sebagai persentase dari rata-rata viabilitas sel relative
terhadap kultur yang tidak diobati. Percobaan yang sama diulang dengan
menggunakan fraksi minyak pada konsentrasi yang sama dari 25 μg/mL
dan pada 2,5; 5; 10; 15; 20 dan 25 μg/mL dan diinkubasi selama 48 jam
dalam 5% CO2 pada 37oC dalam rangka menentukan nilai IC50 masingmasing.
C. Hasil dan Diskusi
Pengaruh suhu dan tekanan pada hasil ekstraksi
dari A. Malaccensis
dengan CO2 superkritis diperiksa pada uji ini dan juga ujisitotoksisitas dari
bahan yang diekstraksi. Parameter ekstraksi yang diuji untuk mendalami
kondisi ekstraksi yang memberikan hasil minyak tertinggi dari A.
Malaccensis. Parameter ini adalah: suu (40 dan 50°C); tekanan (20,7; 27,6 dan
34,5 MPa). Ukuran sampel tetap (≤500μm) dan laju alir CO 2 (≤1 mL/menit).
Ukuran sampel ditetapkan ≤500 μg/mL berdasarkan pada uji terdahulu. Telah
diketahui bahwa pengurangan ukuran matriks partikel akan meningkatkan
hasil ekstraksi. Selain itu, penurunan ukuran partikel pada ekstraksi cairan
superkritis akan menciptakan luas permukaan sehingga lebih mengarah untuk
meningkatkan hasil ekstraksi. Laju alir memiliki pengaruh yang kuat pada
efisiensi ekstraksi dalam ekstraksi superkritis. Semakin lambat kecepatan
fluida, semakin dalam menembus matriks yang dapat meningkatkan hasil
ekstraksi secara positif. Dalam uji ini, hasil ekstraksi superkritis menunjukkan
bahwa hasil ekstraksi meningkat dengan meningkatnya tekanan dan suhu. Uji
lain juga melaporkan bahwa peningkatan suhu dan tekanan akan
meningkatkan hasil ekstraksi superkritis. Bagaimanapun, kenaikan suhu akan
meningkatkan ekstraksi secara signifikan. Minyak hasil ekstraksi tertinggi
adalah 3,66 g/100g sampel yang diperoleh pada 50 º C; 34,5 MPa dengan
waktu dinamis 30 menit. Meningkatkan suhu 40-50 º C akan mengakibatkan
peningkatan hasil ekstraksi. Namun, hasil ekstraksi lebih tinggi pada semua
tekanan dan pada suhu 50 º C. Sementara menurunkan suhu membutuhkan
kebutuhan tekanan ekstraksi yang lebih tinggi untuk mengekstrak hasil lebih.
Dalam penelitian ini ditemukan bahwa pada 40 º C hasil ekstraksi tertinggi
adalah 2,3 g/100g pada tekanan 34,5 MPa, sedangkan ekstrak terendah adalah
1,7 g/100 g sampel pada 40 º C dengan tekanan 20,7 MPa. Hal ini disebabkan
oleh penurunan densitas CO2 bersamaan dengan meningkatnya suhu pada
tekanan konstan, yang menyebabkan peningkatan uap zat terlarut dan
peningkatan kualitas ekstraksi. Data ini konsisten dengan penelitian lain yang
telah
dilaporkan
yang
menunjukkan
bahwa
peningkatan
temperatur
meningkatkan hasil ekstraksi pada tekanan konstan.
Hasil ekstraksi meningkat secara signifikan dengan meningkatnya tekanan
pada suhu yang lebih tinggi. Hasil ekstraksi tertinggi adalah 3,66 g sampel
oil/100g pada tekanan 34,5 MPa pada 50º C dengan laju alir CO 2 ≤ 1ml/menit,
ukuran partikel ≤ 500 μm selama 30 menit. Ditemukan bahwa peningkatan
tekanan pada suhu konstan akan meningkatkan densitas CO2 yang
menghasilkan peningkatan kelarutan komponen minyak dan peningkatan hasil
ekstraksi.
Properti
sitotoksik
dari
ekstrak
minyak
A.Malaccensis
menggunakan ekstraksi superkritis diselidiki dengan menggunakan sel kanker
usus besar manusia HCT-116. Hasil percobaan menunjukkan bahwa semua
ekstrak superkritis sampel A. Malaccensis adalah sitotoksik pada sel kanker
usus besar HCT116 menggunakan konsentrasi 25 ug/ml ekstrak minyak.
Namun, suhu menunjukkan pengaruh yang signifikan pada ekstrak sampel dan
peningkatan properti sitotoksik. Telah ditemukan bahwa semua ekstrak sampel
pada suhu 50 º C memiliki potensi sitotoksik dibandingkan ekstrak sampel
pada 40 º C pada tekanan konstan. Sampel sitotoksik yang paling berpotensi
adalah ekstrak sampel pada suhu 50 º C dan tekanan 20,7 MPa yang
menghambat 99% pertumbuhan sel kanker usus besar pada konsentrasi 25 ug /
ml. Perbedaan dalam aktivitas memberikan kontribusi untuk meningkatkan
suhu pada tekanan konstan akan menurunkan densitas CO2 yang mengarah
pada peningkatkan uap zat terlarut, peningkatkan kelarutan dan peningkatkan
selektivitas senyawa yang diekstrak. Namun demikian, tekanan superkritis
memiliki efek beragam pada sifat sitotoksisitas ekstrak minyak dari A.
Malaccensis. Ditemukan bahwa pada suhu konstan 40 º C dan peningkatkan
tekanan 20,7-34,5 MPa telah meningkatkan sifat sitotoksik sampel lebih dari
50%. Ditemukan bahwa ekstrak sampel pada tekanan 20,7 MPa menghambat
pertumbuhan sel kanker usus sebesar 41% dan meningkat menjadi 84%
dengan menggunakan sampel pada tekanan 34,5 MPa pada suhu konstan 40º
C. Sebaliknya, ditemukan bahwa ekstrak sitotoksik tertinggi diperoleh pada
tekanan terendah dari 20,7 MPa dan 50 º C dengan 99% tingkat penghambatan
pertumbuhan sel. Penambahan tekanan mengakibatkan penurunan properti
sitotoksik dari ekstrak sampel. Ditemukan bahwa penghambatan pertumbuhan
sel kanker berkurang dari 99% untuk ekstrak sampel pada 20,7 MPa sampai
94% untuk ekstrak sampel pada tekanan 27,6 dan 34,5 MPa.
Sampel yang paling sitotoksik kemudian difraksinasi menjadi tiga fraksi
menggunakan ekstraksi superkritis dengan waktu ekstraksi 10 menit. Tiga
fraksi kemudian diuji oleh MTT assay untuk menyelidiki fraksi paling
sitotoksik. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa fraksi yang diperoleh dari
10 menit pertama (F1) dari minyak A. malaccensis, (50 º C; 20,7 MPa dan laju
alir CO2 ≤ 1 ml/menit; ukuran partikel ≤ 500 μm) memiliki aktivitas sitotoksik
tertinggi terhadap sel kanker usus besar HCT 116. Ditemukan, bahwa
menggunakan konsentrasi 25 μg/ml minyak A. malaccensis, pertumbuhan sel
kanker usus dihambat sebanyak 94%, 16% dan 14% menggunakan fraksi F1,
F2 dan F3 masing-masing. IC50 untu fraksi F1 yang paling sitotoksik adalah
3,5 μg/ml yang merupakan jumlah obat yang dapat membunuh 50% dari selsel.