9. LAPORAN PRAKTIKUM Penentuan Kadar Klo (1)
LAPORAN PRAKTIKUM
ANATOMI FISIOLOGI TUMBUHAN
Penentuan Kadar Klorofil Secara Spektroskopi
NAMA
: NIA WIDYARSIH
NIM
: F05112062
KELAS B REG A
PRODI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS TANJUNGPURA
PONTIANAK
2014
ABSTRAK
Fotosintesis hanya dapat berlangsung jika ada klorofil. Hal ini dapat kita
lihat pada spektrum absorbsi. Bentuk spektrum absorbsi klorofil tidak banyak
berbeda dengan spektrum absorbsi fotosintesis. Cahaya merah dan biru
merupakan dua jenis cahaya yang efektif dalam fotosintesis. Untuk memperoleh
spektrum absorbsi, pertama pigmen klorofil di ekstraksi, kemudian dengan
spektrofotometer di tentukan nilai absorbannya pada panjang gelombang tertentu.
Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di dalam
kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan sintesis
molekul makanan dalam kloroplas. Klorofil merupakan molekul organik yang
kompleks. Didalam tumbuhan terdapat 2 jenis klorofil yaitu klorofil a dan b.
Klorofil a merupakan klorofil yang paling efektif dalam proses fotosintesis karena
memiliki warna biru-hijau yang merupakan warna yang paling efektif dalam
fotosintesis. Daun setengah tua memiliki kadar klorofil yang lebih tinggi
dibandingkan daun dewasa dan muda karena pada daun setengah tua ini memiliki
jaringan yang telah sempurna, sehingga penyerapan cahaya dan air menjadi lebih
efektif. Berdasarkan hal tersebut, tujuan utama dari percobaan ini adalah untuk
mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan spektrofotometer. Untuk
keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam
penggunaan spektrofotometer ini. Spektrofotometer yang akan digunakan dalam
percobaan
ini
adalah
BAUSCH
&
LOMB
SPECTRONIC
20
SPECTROPHOTOMETER.
Kata kunci : Daun muda, Daun Setengah Tua, Daun Tua, Fotosintesis,Klorofil,
Klorofil a dan b, Spektrofotometer
PENDAHULUAN
Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di
dalam kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan
sitesis molekul makanan dalam kloroplas. Kloroplas ditemukan terutama dalam
sel mesofil, yaitu jaringan yang terdapat di bagian dalam daun. Karbon dioksida
masuk ke dalam daun, dan oksigen keluar, melalui pori mikroskopik yang di sebut
stomata (Campbell, dkk, 2002).
Klorofil adalah pigmen hijau fotosintetis yang terdapat dalam tanaman,
Algae dan Cynobacteria. nama "chlorophyll" berasal dari bahasa Yunani kuno:
choloros = green (hijau), and phyllon= leaf (daun). Fungsi krolofil pada tanaman
adalah menyerap energi dari sinar matahari untuk digunakan dalam proses
fotosintetis yaitu suatu proses biokimia dimana tanaman mensintesis karbohidrat
(gula menjadi pati), dari gas karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar
matahari (Subandi, 2008).
Klorofil merupakan zat hijau daun yang terdapat pada semua tumbuhan
hijau yang berfotosintesis. Berdasarkan penelitian, klorofil ternyata tidak hanya
berperan sebagai pigmen fotosintesis. Proses fotosintesis membutuhkan klorofil,
maka klorofil umumnya disintesis pada daun untuk menangkap cahaya matahari
yang jumlahnya berbeda pada tiap spesies tergantung dari faktor lingkungan dan
genetiknya. Faktor-faktor yang mempengaruhi sintesis klorofil meliputi: cahaya,
gula atau karbohidrat, air, temperatur, faktor genetik dan unsur-unsur nitrogen,
magnesium, besi, mangan, Cu, Zn, sulfur, dan oksigen.
Faktor utama pembentuk klorofil adalah nitrogen (N). Unsur N merupakan
unsur hara makro. Unsur ini diperlukan oleh tanaman dalam jumlah banyak.
Unsur N diperlukan oleh tanaman, salah satunya sebagai penyusun klorofil.
Tanaman yang kekurangan unsur N akan menunjukkan gejala antara lain klorosis
pada daun. Tanaman tidak dapat menggunakan N2 secara langsung. Gas N2
tersebut harus difiksasi oleh bakteri menjadi amonia (NH3) (Hendriyani dan
Setiari, 2009).
Klorofil pada tumbuhan ada dua macam, yaitu klorofil a dan klorofil b.
perbedaan kecil antara struktur kedua klorofil pada sel keduanya terikat pada
protein. Sedangkan perbedaan utama antar klorofil dan heme ialah karena adanya
atom magnesium (sebagai pengganti besi) di tengah cincin profirin, serta samping
hidrokarbon yang panjang, yaitu rantai fitol (Santoso, 2004).
Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a
terdapat sekitar 75% dari total klorofil. Kandungan klorofil pada tanaman adalah
sekitar 1% basis kering. Dalam daun klorofil banyak terdapat bersama-sama
dengan protein dan lemak yang bergabung satu dengan yang lain. Dengan lipid,
klorofil berikatan melalui gugus fitol-nya sedangkan dengan protein melalui
gugus hidrofobik dari cincin porifin-nya. Rumus empiris klorofil adalah
C55H72O5N4Mg (klorofil a) dan C55H70O6N4Mg (klorofil b) (Subandi, 2008).
Antara klorofil a dan klorofil b mempunyai struktur dan fungsi yang
berbeda, dimana klorofil a di samping bias menyerap energi cahaya, klorofil ini
juga bias merubah energi cahaya dan tidak bisa merubahnya menjadi energi kimia
dan energi itu akan ditransfer dari klorofil b ke klorofil a. Klorofil b ini tidak larut
dalam etanol tai dapat larut dalam ester, dan kedua jenis klorofil ini larut dalam
senyawa aseton (Devlin, 1975).
Ketika tingkat radiasi tinggi, biasanya kloroplas tersusun berbaris di
sepanjang dinding radial sel, menjadi terlindung satu sama lain dari kerusakan
akibat cahaya. Dalam cahaya redup dan sering dalam gelap, kloroplas terpsah
menjadi dua kelompok yang tersebar di sepanjang dinding di sisi terdekat dan
terjauh dari sumber cahaya; dengan demikian, memaksimumkan penyerapan
cahaya. Pergerakan plastid ini, yang bergantung pada arah cahaya dan juga tingkat
iradiansi, merupakan contoh adanya fototaksis.
Pada semua spesies, kloroplas itu sendiri tidak menyerap cahaya yang
mengakibatkan fototaksis; sebaliknya, cahaya yang diserap di tampat lain di
dalam sel menyebabkan pergerakan kloroplas melalui efeknya pada aliran
sitoplasma, dan efek itu berasal dari interaksi antara mikrofilamen dan
mikrotubul. Secara ekologis, pergerakan kloroplas tampak penting, terutama
untuk meningkatkan penyerapan cahaya pada iradiansi rendah dan untuk
mengurangi penyerapan ketika iradiansi tinggi sekali, yang mungkin akan
menyebabkan solariasi atau perusakan lainnya oleh cahaya (Salisbury dan Ross,
1995).
Peningkatan kandungan klorofil a dan b menyebabkan kemampuan dalam
menangkap energi radiasi cahaya klon toleran lebih efisien dibandingkan dengan
klon peka, sehingga fotosintesis klon toleran lebih tinggi dibandingkan dengan
klon peka. Klorofil a dan b berperan dalam proses fotosintesis tanaman. Klorofil b
berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya. Peningkatan
kandungan klorofil b yang pada kondisi ternaungi berkaitan dengan peningkatan
protein klorofil sehingga akan meningkatkan efisiensi fungsi antena fotosintetik
pada Light Harvesting Complex II (LHC II). Penyesuaian tanaman terhadap
radiasi yang rendah juga dicirikan dengan membesarnya antena untuk fotosistem
II. Membesarnya antena untuk fotosistem II akan meningkatkan efisiensi
pemanenan cahaya (Hidema et al., 1992).
Klorofil b berfungsi sebagai antena yang mengumpulkan cahaya untuk
kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi
cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat
digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis (Taiz dan Zeiger, 1991).
Sejak tipe-tipe atom atau molekul yang sedikit berbeda pada tingkat
energinya, yang substansi menyerap cahaya dengan suatu karakteristik panjang
gelombang yang berbeda. Ini biasanya ditunjukkan selama penyerapan sinar pada
tiap gelombangnya. Sebagai contoh, klorofil a sangat kuat pada panjang
gelombang 660 nm pada sinar merah dan paling rendah pada panjang gelombang
430 nm pada sinar biru. Ketika gelombang itu berpindah maka sinar yang ada di
sebelah kiri adalah sinar hijau yang bisa kita lihat (Guiltmond and Hopkins,
1983).
Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer akan menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang energi secara relatif. Jika energi tersebut ditransmisikan maka
akan ditangkap oleh klorofil yang terlarut tersebut. Pada fotometer filter sinar dari
panjang gelombang yang diinginkan akan diperoleh dengan berbagai filter yang
punya spesifikasi melewati banyaknya panjang gelombang tertentu. (Noggle dan
Fritz, 1979).
Dari semua radiasi matahari yang dipancarkan, hanya panjang gelombang
tertentu yang dimanfaatkan tumbuhan untuk proses fotosintesis, yaitu panjang
gelombang yang berada pada kisaran cahaya tampak (380-700 nm). Cahaya
tampak terbagi atas cahaya merah (610 - 700 nm), hijau kuning (510 - 600 nm),
biru (410 - 500 nm) dan violet (< 400 nm). Masing-masing jenis cahaya berbeda
pengaruhnya terhadap fotosintesis. Hal ini terkait pada sifat pigmen penangkap
cahaya yang bekerja dalam fotosintesis. Pigmen yang terdapat pada membran
grana menyerap cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Pigmen yang
berbeda menyerap cahaya pada panjang gelombang yang berbeda (Pratama,
2009).
Alat Spektrofotometer sangat mahal, sehingga hanya sedikit tempat yang
memilikinya. Penggunaan alat penunjang seperti cuvet, pemakaiannya juga harus
dengan hati-hati. Untuk itulah, tujuan utama dari percobaan ini adalah untuk
mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan Spektrofotometer. Untuk
keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam
penggunaan Spektrofotometer ini. Spektrofotometer yang akan digunakan dalam
percobaan ini adalah Spektrophotometer UV-1800 V merk Rayleigh.
METODELOGI
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah bayam (Amaranthus sp),
aseton 60% dan 80%. Dan alat yang digunakan berupa mortar dan alu, gelas ukur,
labu ukur, tabung reaksi, spektrofotometer Genesys 10.
Untuk percobaan pengukuran kadar klorofil dilakukan percobaan
mengukur kadar klorofil dari suatu tanaman yang umurnya berbeda-beda. Untuk
memperoleh umur yang berbeda ini diambil patokan :
1. Daun umur muda diambil daunnya pada pucuk
2. Daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari pucuk
3. Daun dewasa diambil daun nomor 5 ke bawah
Untuk membandingkan kadar klorofil dari daun-daun tadi digunakan cara
pengukuran yang dilakukan oleh Arnon (1949) yaitu, 1 gram daun yang masih
segar dirajang kecil-kecil. Rajangan diekstrak dengan aseton 60% sebanyak 100
mL, dengan cara menggerusnya didalam mortal selama 5 menit. Diyakinkan
bahwa semua pigmen klorofil dari daun telah keluar seluruhnya dan hal ini dapat
dilihat dari ampasnya yang berwarna putih. Ekstrak klorofil disaring dengan
saringan Buchner dan selanjutnya dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml.
Penambahan aseton 80% hanya diperlukan apabila volume ekstrak dalam labu
ukur belum mencapai batas 100 ml. Dengan menggunakan cuvet, Optica Dencity
(OD) diukur dari ekstrak dengan menggunakan panjang gelombang 663 nm dan
645 nm. Konsentrasi klorofil dapat dihitung dengan rumus Arnon (1949) dengan
membandingkan OD pada 663 nm dan 645 nm dalam sel yang tebalnya 1 cm
dengan menggunakan koefisien absorbsi spesifik yang telah ditentukan oleh Mac
Kinner (1941) sebagai berikut :
Klorifil total (mg/l)
= 20,2 D645 + 0.02 D663
Klorofil a
= 12,7 D663 + 2,69 D645
Klorofil b
= 22,9 D645 + 0,02 D663
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berikut adalah hasil pengamatan praktikum menggunakan spektofotometer
1.
no
indeks
mode
1
0
2
3
4
0
0
0
.
1.
Klorofil a
6,58889
Abs
Abs
Abs
0.472
0.594
0.615
0.221
0.218
0.240
Jenis klorofil
Klorofil b
Klorofil total
5,07034
4,47364
Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun setengah tua
No
.
1.
3.
B
645 nm
0.000
Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun muda
No
2.
Abs
A
663 nm
0.000
Klorofil a
8,13022
Jenis klorofil
Klorofil b
Klorofil total
5,00408
4,41548
Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun dewasa
No
.
1.
Klorofil a
8,4561
Jenis klorofil
Klorofil b
Klorofil total
5,5083
4,84603
Pada praktikum kali ini untuk penentuan kadar klorofil menggunakan daun bayam
(Amaranthus spinosus) dengan umur yang berbeda yaitu daun umur muda yaitu
daun yang diambil pada pucuk, daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari
pucuk, dan daun dewasa yaitu daun nomor 5 kebawah. Masing-masing daun
tersebut diekstrak dan ekstrak tersebut dibiarkan selama 1 minggu. Setelah
diekstrak, terlihat jelas perbedaan warna ekstrak dari daun yang berbeda usianya.
Untuk warna ekstrak tercerah didapat pada daun setengah tua.
Selanjutnya dilakukan penentuan kadar klorofil dengan menggunakan alat yang
disebut dengan spektrofotometer. Harga alat ini sangat mahal sehingga dalam
penggunaannya perlu dilakukan secara hati-hati.
Untuk menggunakan alat tersebut pertama isi akuades pada cuvet yang nantinya
akan dijadikan sebagai blanko, kemudian diletakkan pada spektofotometer dengan
hati-hati dan selanjutnya ditekan tombol zero untuk mengkalibrasi alat tersebut.
Selanjutnya isi cuvet lainnya dengan ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus)
yang ada. Masukkan 1 cuvet berisi ekstrak daun bayam ditempat cuvet berisi
akuades diletakkan sebelumnya sedangkan cuvet berisi akuades dipindahkan pada
posisi diatas cuvet berisi ekstrak daun bayam. Lalu spektofotometer kembali
dikalibrasi. Setelah pengkalibrasian selesai, maka dipilih panjang gelombang yang
diinginkan yang tertera pada monitor spektrofotometer. Klorofil yang terkandung
pada ekstrak daun bayam tersebut selanjutnya akan ditembakkan sesuai dengan
panjang gelombang yang telah dipilih dan nantinya akan terlihat nilai kadar
klorofil dari ekstrak daun bayam yang diukur pada monitor.
Prinsip kerjanya adalah menentukan kadar klorofil dengan spektrum
cahaya (panjang gelombang) tertentu yang dipancarkan ke molekul klorofil
didalam alat tersebut. Senyawa tertentu hanya menyerap foton yang bersesuaian
dengan panjang gelombang tertentu dan oleh karena itu setiap pigmen memiliki
spektrum absorbsinya yang unik. Klorofil a dan klorofil b karena memiliki
absorbsi spektrumnya yang kuat pada kisaran panjang gelaobang 600-700 nm.
Klorofil-a (C55H72O5N4Mg) yang berwarna hijau tua dan klorofil-b
(C55H70O6N4Mg) yang berwarna hijau muda. Klorofil-a dan b paling kuat
menyerap cahaya di bagian merah (600-700 nm), sedangkan yang paling sedikit
cahaya hijau (500-600 nm).
Dari pengukuran kadar klorofil menggunakan alat Spektrofotometer,
ternyata kadar klorofil pada daun tua memang lebih banyak yaitu 4,8603 mg/l
dibandingkan dengan daun muda yaitu 4,47364 mg/l dan daun setengah tua yaitu
4,41548 mg/l.
Adapun rumus yang digunakan untuk menghitung klorofil total yaitu:
Klorofil Total (mg/l) = 20,2 D645 + 0,02 D663
Diperolehnya hasil tersebut dapat dikarenakan pada daun bayam berusia
setengah tua memiliki kadar klorofil yang paling maksimal karena pada usia ini
daun melakukan proses fotosintesis secara aktif sedangkan pada daun muda
diperoleh hasil kadar klorofil terendah dikarenakan kadar klorofil yang terbentuk
masih sedikit dan masih dalam proses pembentukan, selanjutnya pada daun
dewasa kadar klorofilnya sudah sedikit berkurang dibandingkan dengan daun
setengah tua. Hal ini dapat terjadi karena rusaknya klorofil yang ada.
Dari hasil percobaan juga diperoleh hasil bahwa dari ketiga ekstrak daun bayam
dengan umur yang berbeda diperoleh kadar klorofil a lebih tinggi dibandingkan
dengan kadar klorofil b. Hal ini sesuai dengan pernyataan Subandi (2008) bahwa
Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat
sekitar 75 % dari total klorofil.
Untuk menghitung klorofil a dan klorofil b menggunakan rumus:
Klorofil a
= 12,7 D663 + 2,69 D645
Klorofil b
= 22,9 D645 + 0,02 D663
Jadi setelah melakukan praktikum ini praktikan dapat mengetahui dan
menggunakan spektofotometer sesuai prosedur yang benar dalam satu diantara
kegunaanya yaitu penentuan kadar klorofil.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum Penentuan Kadar Klorofil secara
Spektoskopi maka dapat disimpulkan bahwa kadar klorofil total tertinggi
didapatkan pada ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) yang berusia
setengah tua sebesar 4,41548 mg/l. Sedangkan pada daun dewasa 4,8603 mg/l dan
daun muda hanya 4,47364 mg/l
Selanjutnya diperoleh bahwa kadar klorofil a pada semua ekstrak daun
bayam (Amaranthus spinosus) lebih tinggi nilainya dibandingkan dengan kadar
klorofil b.
Pengukuran jumlah klorofil dapat dengan dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer
BAUSCH
&
LOMB
SPECTRONIC
20
SPECTOPHOTOMETER dan dibutuhkan keterampilan dan pengetahuan khusus
dalam penggunaannya. Pada daun yang masih muda konsentrasi klorofil masih
rendah, sedangkan daun setengah tua sangat tinggi dan menurun drastis pada
daun dewasa akibat penuaan. Tingginya konsentrasi klorofil menunjukkan
tingginya penyerapan energi cahaya oleh daun itu sendiri. Semakain tinggi
penyerapan cahaya pada daun maka semakin maksimal kinerja dalam proses
fotosintesisnya.
.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell dkk. 2002 Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Devlin, Robert M. 1975. Plant Physiology Third Edition. New York: D. Van Nostrand.
Djukti dan Purwoko, Bambang Sapta. 2003. Pengaruh Naungan Paranet Terhadap Sifat
Toleransi Tanaman Talas (Colocasia esculenta (L.) Schott). Ilmu Pertanian, Vol.
10 No. 2, 2003: 17-25.
Hendriyani, Ika Susanti dan Setiari, Nintya. 2009. Kandungan Klorofil dan Pertumbuhan
Kacang Panjang (Vigna sinensis) pada Tingkat Penyediaan Air yang Berbeda. J.
Sains & Mat. Vol 17 No. 3, Juli 2009: 145-150.
Hidema J, Makino A, Kurita Y, Mae T, Ohjima K. 1992. Changes in the Level of
Chlorophyll and Light-harvesting Chlorophyll a/b Protein PS II in Rice Leaves
Agent Under Different Irradiances from Full Expansion Through Senescense.
Plant Cell Physiol 33(8): 1209-1214.
Lakitan. 2007. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada.
Noggle, Ray, R dan Fritzs, J. George. 1979. Introductor Plant Physiology. New Delhi:
Mall of India Private Ilmited.
Pratama,
Tomi
Anugrah.
2009.
Fotosintesis.
(online).
(http://thetom022.files.wordpress.com/2009/06/fotosintesis.pdf., diakses tanggal
10 juli 2014).
Salisbury, Frank B. dan Ross, Cleon W. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Bandung: Penerbit
ITB.
Santoso. 2004. Fisiologi Tumbuhan. Bengkulu: Universitas Muhammadiyah Bengkulu.
Subandi, Aan. 2008. Metabolisme. (online). (http://metabolisme.blogspot.com/2007/09,
diakses tanggal 10 juli 2014).
Suyitno. 2006. Penuntun Praktikum Fisiologi Tumbuhan Lanjut. Yogyakarta: UNY.
Taiz L and Zeiger E. 1991. Plant Physiology. Tokyo: The Benyamin/Cumming
Publishing Company Inc.
ANATOMI FISIOLOGI TUMBUHAN
Penentuan Kadar Klorofil Secara Spektroskopi
NAMA
: NIA WIDYARSIH
NIM
: F05112062
KELAS B REG A
PRODI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS TANJUNGPURA
PONTIANAK
2014
ABSTRAK
Fotosintesis hanya dapat berlangsung jika ada klorofil. Hal ini dapat kita
lihat pada spektrum absorbsi. Bentuk spektrum absorbsi klorofil tidak banyak
berbeda dengan spektrum absorbsi fotosintesis. Cahaya merah dan biru
merupakan dua jenis cahaya yang efektif dalam fotosintesis. Untuk memperoleh
spektrum absorbsi, pertama pigmen klorofil di ekstraksi, kemudian dengan
spektrofotometer di tentukan nilai absorbannya pada panjang gelombang tertentu.
Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di dalam
kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan sintesis
molekul makanan dalam kloroplas. Klorofil merupakan molekul organik yang
kompleks. Didalam tumbuhan terdapat 2 jenis klorofil yaitu klorofil a dan b.
Klorofil a merupakan klorofil yang paling efektif dalam proses fotosintesis karena
memiliki warna biru-hijau yang merupakan warna yang paling efektif dalam
fotosintesis. Daun setengah tua memiliki kadar klorofil yang lebih tinggi
dibandingkan daun dewasa dan muda karena pada daun setengah tua ini memiliki
jaringan yang telah sempurna, sehingga penyerapan cahaya dan air menjadi lebih
efektif. Berdasarkan hal tersebut, tujuan utama dari percobaan ini adalah untuk
mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan spektrofotometer. Untuk
keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam
penggunaan spektrofotometer ini. Spektrofotometer yang akan digunakan dalam
percobaan
ini
adalah
BAUSCH
&
LOMB
SPECTRONIC
20
SPECTROPHOTOMETER.
Kata kunci : Daun muda, Daun Setengah Tua, Daun Tua, Fotosintesis,Klorofil,
Klorofil a dan b, Spektrofotometer
PENDAHULUAN
Warna daun berasal dari klorofil, pigmen warna hijau yang terdapat di
dalam kloroplas. Energi cahaya yang diserap klorofil inilah yang menggerakkan
sitesis molekul makanan dalam kloroplas. Kloroplas ditemukan terutama dalam
sel mesofil, yaitu jaringan yang terdapat di bagian dalam daun. Karbon dioksida
masuk ke dalam daun, dan oksigen keluar, melalui pori mikroskopik yang di sebut
stomata (Campbell, dkk, 2002).
Klorofil adalah pigmen hijau fotosintetis yang terdapat dalam tanaman,
Algae dan Cynobacteria. nama "chlorophyll" berasal dari bahasa Yunani kuno:
choloros = green (hijau), and phyllon= leaf (daun). Fungsi krolofil pada tanaman
adalah menyerap energi dari sinar matahari untuk digunakan dalam proses
fotosintetis yaitu suatu proses biokimia dimana tanaman mensintesis karbohidrat
(gula menjadi pati), dari gas karbon dioksida dan air dengan bantuan sinar
matahari (Subandi, 2008).
Klorofil merupakan zat hijau daun yang terdapat pada semua tumbuhan
hijau yang berfotosintesis. Berdasarkan penelitian, klorofil ternyata tidak hanya
berperan sebagai pigmen fotosintesis. Proses fotosintesis membutuhkan klorofil,
maka klorofil umumnya disintesis pada daun untuk menangkap cahaya matahari
yang jumlahnya berbeda pada tiap spesies tergantung dari faktor lingkungan dan
genetiknya. Faktor-faktor yang mempengaruhi sintesis klorofil meliputi: cahaya,
gula atau karbohidrat, air, temperatur, faktor genetik dan unsur-unsur nitrogen,
magnesium, besi, mangan, Cu, Zn, sulfur, dan oksigen.
Faktor utama pembentuk klorofil adalah nitrogen (N). Unsur N merupakan
unsur hara makro. Unsur ini diperlukan oleh tanaman dalam jumlah banyak.
Unsur N diperlukan oleh tanaman, salah satunya sebagai penyusun klorofil.
Tanaman yang kekurangan unsur N akan menunjukkan gejala antara lain klorosis
pada daun. Tanaman tidak dapat menggunakan N2 secara langsung. Gas N2
tersebut harus difiksasi oleh bakteri menjadi amonia (NH3) (Hendriyani dan
Setiari, 2009).
Klorofil pada tumbuhan ada dua macam, yaitu klorofil a dan klorofil b.
perbedaan kecil antara struktur kedua klorofil pada sel keduanya terikat pada
protein. Sedangkan perbedaan utama antar klorofil dan heme ialah karena adanya
atom magnesium (sebagai pengganti besi) di tengah cincin profirin, serta samping
hidrokarbon yang panjang, yaitu rantai fitol (Santoso, 2004).
Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a
terdapat sekitar 75% dari total klorofil. Kandungan klorofil pada tanaman adalah
sekitar 1% basis kering. Dalam daun klorofil banyak terdapat bersama-sama
dengan protein dan lemak yang bergabung satu dengan yang lain. Dengan lipid,
klorofil berikatan melalui gugus fitol-nya sedangkan dengan protein melalui
gugus hidrofobik dari cincin porifin-nya. Rumus empiris klorofil adalah
C55H72O5N4Mg (klorofil a) dan C55H70O6N4Mg (klorofil b) (Subandi, 2008).
Antara klorofil a dan klorofil b mempunyai struktur dan fungsi yang
berbeda, dimana klorofil a di samping bias menyerap energi cahaya, klorofil ini
juga bias merubah energi cahaya dan tidak bisa merubahnya menjadi energi kimia
dan energi itu akan ditransfer dari klorofil b ke klorofil a. Klorofil b ini tidak larut
dalam etanol tai dapat larut dalam ester, dan kedua jenis klorofil ini larut dalam
senyawa aseton (Devlin, 1975).
Ketika tingkat radiasi tinggi, biasanya kloroplas tersusun berbaris di
sepanjang dinding radial sel, menjadi terlindung satu sama lain dari kerusakan
akibat cahaya. Dalam cahaya redup dan sering dalam gelap, kloroplas terpsah
menjadi dua kelompok yang tersebar di sepanjang dinding di sisi terdekat dan
terjauh dari sumber cahaya; dengan demikian, memaksimumkan penyerapan
cahaya. Pergerakan plastid ini, yang bergantung pada arah cahaya dan juga tingkat
iradiansi, merupakan contoh adanya fototaksis.
Pada semua spesies, kloroplas itu sendiri tidak menyerap cahaya yang
mengakibatkan fototaksis; sebaliknya, cahaya yang diserap di tampat lain di
dalam sel menyebabkan pergerakan kloroplas melalui efeknya pada aliran
sitoplasma, dan efek itu berasal dari interaksi antara mikrofilamen dan
mikrotubul. Secara ekologis, pergerakan kloroplas tampak penting, terutama
untuk meningkatkan penyerapan cahaya pada iradiansi rendah dan untuk
mengurangi penyerapan ketika iradiansi tinggi sekali, yang mungkin akan
menyebabkan solariasi atau perusakan lainnya oleh cahaya (Salisbury dan Ross,
1995).
Peningkatan kandungan klorofil a dan b menyebabkan kemampuan dalam
menangkap energi radiasi cahaya klon toleran lebih efisien dibandingkan dengan
klon peka, sehingga fotosintesis klon toleran lebih tinggi dibandingkan dengan
klon peka. Klorofil a dan b berperan dalam proses fotosintesis tanaman. Klorofil b
berfungsi sebagai antena fotosintetik yang mengumpulkan cahaya. Peningkatan
kandungan klorofil b yang pada kondisi ternaungi berkaitan dengan peningkatan
protein klorofil sehingga akan meningkatkan efisiensi fungsi antena fotosintetik
pada Light Harvesting Complex II (LHC II). Penyesuaian tanaman terhadap
radiasi yang rendah juga dicirikan dengan membesarnya antena untuk fotosistem
II. Membesarnya antena untuk fotosistem II akan meningkatkan efisiensi
pemanenan cahaya (Hidema et al., 1992).
Klorofil b berfungsi sebagai antena yang mengumpulkan cahaya untuk
kemudian ditransfer ke pusat reaksi. Pusat reaksi tersusun dari klorofil a. Energi
cahaya akan diubah menjadi energi kimia di pusat reaksi yang kemudian dapat
digunakan untuk proses reduksi dalam fotosintesis (Taiz dan Zeiger, 1991).
Sejak tipe-tipe atom atau molekul yang sedikit berbeda pada tingkat
energinya, yang substansi menyerap cahaya dengan suatu karakteristik panjang
gelombang yang berbeda. Ini biasanya ditunjukkan selama penyerapan sinar pada
tiap gelombangnya. Sebagai contoh, klorofil a sangat kuat pada panjang
gelombang 660 nm pada sinar merah dan paling rendah pada panjang gelombang
430 nm pada sinar biru. Ketika gelombang itu berpindah maka sinar yang ada di
sebelah kiri adalah sinar hijau yang bisa kita lihat (Guiltmond and Hopkins,
1983).
Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spektrofotometer dan fotometer akan menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang energi secara relatif. Jika energi tersebut ditransmisikan maka
akan ditangkap oleh klorofil yang terlarut tersebut. Pada fotometer filter sinar dari
panjang gelombang yang diinginkan akan diperoleh dengan berbagai filter yang
punya spesifikasi melewati banyaknya panjang gelombang tertentu. (Noggle dan
Fritz, 1979).
Dari semua radiasi matahari yang dipancarkan, hanya panjang gelombang
tertentu yang dimanfaatkan tumbuhan untuk proses fotosintesis, yaitu panjang
gelombang yang berada pada kisaran cahaya tampak (380-700 nm). Cahaya
tampak terbagi atas cahaya merah (610 - 700 nm), hijau kuning (510 - 600 nm),
biru (410 - 500 nm) dan violet (< 400 nm). Masing-masing jenis cahaya berbeda
pengaruhnya terhadap fotosintesis. Hal ini terkait pada sifat pigmen penangkap
cahaya yang bekerja dalam fotosintesis. Pigmen yang terdapat pada membran
grana menyerap cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Pigmen yang
berbeda menyerap cahaya pada panjang gelombang yang berbeda (Pratama,
2009).
Alat Spektrofotometer sangat mahal, sehingga hanya sedikit tempat yang
memilikinya. Penggunaan alat penunjang seperti cuvet, pemakaiannya juga harus
dengan hati-hati. Untuk itulah, tujuan utama dari percobaan ini adalah untuk
mempelajari dan memberikan latihan cara penggunaan Spektrofotometer. Untuk
keperluan ini, penentuan kadar klorofil adalah salah satu contoh dalam
penggunaan Spektrofotometer ini. Spektrofotometer yang akan digunakan dalam
percobaan ini adalah Spektrophotometer UV-1800 V merk Rayleigh.
METODELOGI
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah bayam (Amaranthus sp),
aseton 60% dan 80%. Dan alat yang digunakan berupa mortar dan alu, gelas ukur,
labu ukur, tabung reaksi, spektrofotometer Genesys 10.
Untuk percobaan pengukuran kadar klorofil dilakukan percobaan
mengukur kadar klorofil dari suatu tanaman yang umurnya berbeda-beda. Untuk
memperoleh umur yang berbeda ini diambil patokan :
1. Daun umur muda diambil daunnya pada pucuk
2. Daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari pucuk
3. Daun dewasa diambil daun nomor 5 ke bawah
Untuk membandingkan kadar klorofil dari daun-daun tadi digunakan cara
pengukuran yang dilakukan oleh Arnon (1949) yaitu, 1 gram daun yang masih
segar dirajang kecil-kecil. Rajangan diekstrak dengan aseton 60% sebanyak 100
mL, dengan cara menggerusnya didalam mortal selama 5 menit. Diyakinkan
bahwa semua pigmen klorofil dari daun telah keluar seluruhnya dan hal ini dapat
dilihat dari ampasnya yang berwarna putih. Ekstrak klorofil disaring dengan
saringan Buchner dan selanjutnya dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml.
Penambahan aseton 80% hanya diperlukan apabila volume ekstrak dalam labu
ukur belum mencapai batas 100 ml. Dengan menggunakan cuvet, Optica Dencity
(OD) diukur dari ekstrak dengan menggunakan panjang gelombang 663 nm dan
645 nm. Konsentrasi klorofil dapat dihitung dengan rumus Arnon (1949) dengan
membandingkan OD pada 663 nm dan 645 nm dalam sel yang tebalnya 1 cm
dengan menggunakan koefisien absorbsi spesifik yang telah ditentukan oleh Mac
Kinner (1941) sebagai berikut :
Klorifil total (mg/l)
= 20,2 D645 + 0.02 D663
Klorofil a
= 12,7 D663 + 2,69 D645
Klorofil b
= 22,9 D645 + 0,02 D663
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berikut adalah hasil pengamatan praktikum menggunakan spektofotometer
1.
no
indeks
mode
1
0
2
3
4
0
0
0
.
1.
Klorofil a
6,58889
Abs
Abs
Abs
0.472
0.594
0.615
0.221
0.218
0.240
Jenis klorofil
Klorofil b
Klorofil total
5,07034
4,47364
Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun setengah tua
No
.
1.
3.
B
645 nm
0.000
Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun muda
No
2.
Abs
A
663 nm
0.000
Klorofil a
8,13022
Jenis klorofil
Klorofil b
Klorofil total
5,00408
4,41548
Hasil pengamatan untuk kadar klorofil daun dewasa
No
.
1.
Klorofil a
8,4561
Jenis klorofil
Klorofil b
Klorofil total
5,5083
4,84603
Pada praktikum kali ini untuk penentuan kadar klorofil menggunakan daun bayam
(Amaranthus spinosus) dengan umur yang berbeda yaitu daun umur muda yaitu
daun yang diambil pada pucuk, daun setengah tua diambil daun nomor 3 dari
pucuk, dan daun dewasa yaitu daun nomor 5 kebawah. Masing-masing daun
tersebut diekstrak dan ekstrak tersebut dibiarkan selama 1 minggu. Setelah
diekstrak, terlihat jelas perbedaan warna ekstrak dari daun yang berbeda usianya.
Untuk warna ekstrak tercerah didapat pada daun setengah tua.
Selanjutnya dilakukan penentuan kadar klorofil dengan menggunakan alat yang
disebut dengan spektrofotometer. Harga alat ini sangat mahal sehingga dalam
penggunaannya perlu dilakukan secara hati-hati.
Untuk menggunakan alat tersebut pertama isi akuades pada cuvet yang nantinya
akan dijadikan sebagai blanko, kemudian diletakkan pada spektofotometer dengan
hati-hati dan selanjutnya ditekan tombol zero untuk mengkalibrasi alat tersebut.
Selanjutnya isi cuvet lainnya dengan ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus)
yang ada. Masukkan 1 cuvet berisi ekstrak daun bayam ditempat cuvet berisi
akuades diletakkan sebelumnya sedangkan cuvet berisi akuades dipindahkan pada
posisi diatas cuvet berisi ekstrak daun bayam. Lalu spektofotometer kembali
dikalibrasi. Setelah pengkalibrasian selesai, maka dipilih panjang gelombang yang
diinginkan yang tertera pada monitor spektrofotometer. Klorofil yang terkandung
pada ekstrak daun bayam tersebut selanjutnya akan ditembakkan sesuai dengan
panjang gelombang yang telah dipilih dan nantinya akan terlihat nilai kadar
klorofil dari ekstrak daun bayam yang diukur pada monitor.
Prinsip kerjanya adalah menentukan kadar klorofil dengan spektrum
cahaya (panjang gelombang) tertentu yang dipancarkan ke molekul klorofil
didalam alat tersebut. Senyawa tertentu hanya menyerap foton yang bersesuaian
dengan panjang gelombang tertentu dan oleh karena itu setiap pigmen memiliki
spektrum absorbsinya yang unik. Klorofil a dan klorofil b karena memiliki
absorbsi spektrumnya yang kuat pada kisaran panjang gelaobang 600-700 nm.
Klorofil-a (C55H72O5N4Mg) yang berwarna hijau tua dan klorofil-b
(C55H70O6N4Mg) yang berwarna hijau muda. Klorofil-a dan b paling kuat
menyerap cahaya di bagian merah (600-700 nm), sedangkan yang paling sedikit
cahaya hijau (500-600 nm).
Dari pengukuran kadar klorofil menggunakan alat Spektrofotometer,
ternyata kadar klorofil pada daun tua memang lebih banyak yaitu 4,8603 mg/l
dibandingkan dengan daun muda yaitu 4,47364 mg/l dan daun setengah tua yaitu
4,41548 mg/l.
Adapun rumus yang digunakan untuk menghitung klorofil total yaitu:
Klorofil Total (mg/l) = 20,2 D645 + 0,02 D663
Diperolehnya hasil tersebut dapat dikarenakan pada daun bayam berusia
setengah tua memiliki kadar klorofil yang paling maksimal karena pada usia ini
daun melakukan proses fotosintesis secara aktif sedangkan pada daun muda
diperoleh hasil kadar klorofil terendah dikarenakan kadar klorofil yang terbentuk
masih sedikit dan masih dalam proses pembentukan, selanjutnya pada daun
dewasa kadar klorofilnya sudah sedikit berkurang dibandingkan dengan daun
setengah tua. Hal ini dapat terjadi karena rusaknya klorofil yang ada.
Dari hasil percobaan juga diperoleh hasil bahwa dari ketiga ekstrak daun bayam
dengan umur yang berbeda diperoleh kadar klorofil a lebih tinggi dibandingkan
dengan kadar klorofil b. Hal ini sesuai dengan pernyataan Subandi (2008) bahwa
Semua tanaman hijau mengandung klorofil a dan krolofil b. Krolofil a terdapat
sekitar 75 % dari total klorofil.
Untuk menghitung klorofil a dan klorofil b menggunakan rumus:
Klorofil a
= 12,7 D663 + 2,69 D645
Klorofil b
= 22,9 D645 + 0,02 D663
Jadi setelah melakukan praktikum ini praktikan dapat mengetahui dan
menggunakan spektofotometer sesuai prosedur yang benar dalam satu diantara
kegunaanya yaitu penentuan kadar klorofil.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum Penentuan Kadar Klorofil secara
Spektoskopi maka dapat disimpulkan bahwa kadar klorofil total tertinggi
didapatkan pada ekstrak daun bayam (Amaranthus spinosus) yang berusia
setengah tua sebesar 4,41548 mg/l. Sedangkan pada daun dewasa 4,8603 mg/l dan
daun muda hanya 4,47364 mg/l
Selanjutnya diperoleh bahwa kadar klorofil a pada semua ekstrak daun
bayam (Amaranthus spinosus) lebih tinggi nilainya dibandingkan dengan kadar
klorofil b.
Pengukuran jumlah klorofil dapat dengan dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer
BAUSCH
&
LOMB
SPECTRONIC
20
SPECTOPHOTOMETER dan dibutuhkan keterampilan dan pengetahuan khusus
dalam penggunaannya. Pada daun yang masih muda konsentrasi klorofil masih
rendah, sedangkan daun setengah tua sangat tinggi dan menurun drastis pada
daun dewasa akibat penuaan. Tingginya konsentrasi klorofil menunjukkan
tingginya penyerapan energi cahaya oleh daun itu sendiri. Semakain tinggi
penyerapan cahaya pada daun maka semakin maksimal kinerja dalam proses
fotosintesisnya.
.
DAFTAR PUSTAKA
Campbell dkk. 2002 Biologi Edisi Kelima Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Devlin, Robert M. 1975. Plant Physiology Third Edition. New York: D. Van Nostrand.
Djukti dan Purwoko, Bambang Sapta. 2003. Pengaruh Naungan Paranet Terhadap Sifat
Toleransi Tanaman Talas (Colocasia esculenta (L.) Schott). Ilmu Pertanian, Vol.
10 No. 2, 2003: 17-25.
Hendriyani, Ika Susanti dan Setiari, Nintya. 2009. Kandungan Klorofil dan Pertumbuhan
Kacang Panjang (Vigna sinensis) pada Tingkat Penyediaan Air yang Berbeda. J.
Sains & Mat. Vol 17 No. 3, Juli 2009: 145-150.
Hidema J, Makino A, Kurita Y, Mae T, Ohjima K. 1992. Changes in the Level of
Chlorophyll and Light-harvesting Chlorophyll a/b Protein PS II in Rice Leaves
Agent Under Different Irradiances from Full Expansion Through Senescense.
Plant Cell Physiol 33(8): 1209-1214.
Lakitan. 2007. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. Jakarta: PT. Raja Grafindo Persada.
Noggle, Ray, R dan Fritzs, J. George. 1979. Introductor Plant Physiology. New Delhi:
Mall of India Private Ilmited.
Pratama,
Tomi
Anugrah.
2009.
Fotosintesis.
(online).
(http://thetom022.files.wordpress.com/2009/06/fotosintesis.pdf., diakses tanggal
10 juli 2014).
Salisbury, Frank B. dan Ross, Cleon W. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Bandung: Penerbit
ITB.
Santoso. 2004. Fisiologi Tumbuhan. Bengkulu: Universitas Muhammadiyah Bengkulu.
Subandi, Aan. 2008. Metabolisme. (online). (http://metabolisme.blogspot.com/2007/09,
diakses tanggal 10 juli 2014).
Suyitno. 2006. Penuntun Praktikum Fisiologi Tumbuhan Lanjut. Yogyakarta: UNY.
Taiz L and Zeiger E. 1991. Plant Physiology. Tokyo: The Benyamin/Cumming
Publishing Company Inc.