Korelasi Pergerakan Gigi Dengan Perubahan Kadar TGF-β2 Pada Pemakaian Elastomer Separator Ortodonti Chapter III VI
43
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Jenis dan Desain Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian analitik dengan jenis eksperimental kuasi yang
dilakukan pada pasien yang akan mendapatkan perawatan ortodonti menggunakan
piranti ortodonti cekat untuk melihat perubahan kadar TGF-β2 saat dilakukan
pemasangan separator pada sisi tekanan.
3.2 Tempat dan waktu penelitian
3.2.1 Tempat Penelitian
Pemasangan separator, pengambilan CSG, dan pengukuran besar ruangan
dilakukan di praktek dokter gigi swasta di Bogor. Pemeriksaan kadar TGF-β2 dengan
menggunakan uji ELISA akan dilakukan di Laboratorium Biologi Oral Fakultas
Kedokteran Gigi UI.
3.2.2Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei 2015 hingga September 2015.
3.3 Populasi dan Sampel penelitian
3.3.1 Populasi Penelitian
Universitas Sumatera Utara
44
Populasi penelitian adalah semua pasien yang akan dirawat menggunakan
piranti ortodonti cekat selama periode penelitian yang disesuaikan dengan kriteria
inklusi dan eksklusi.
3.3.2 Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini adalah cairan sulkus gingiva molar pertama atas
yang akan dipasangkan separator. Jumlah sampel yang diperiksa ditentukan dengan
rumus beda mean pada satu populasi :
N1 = N2 = 2 �(�� + ��)��
Keterangan :
�1 − �2
n1 = n2
= jumlah
sampel pada masing-masing kelompok
Zα
= deviat baku normal untuk α = 5% Zα = 1,645
Zβ
= deviat baku normal untuk β = 20% Zβ= 0,842
S
= simpangan baku
X1
= rata-rata kadar TGF-β2 pada kontrol
X2
= rata-rata kadar TGF-β2 setelah pemberian daya
Berdasarkan perhitungan rumus besar sampel maka sampel yang diperlukan sebanyak
minimal 12 sampel.
Sampel yang dipilih pada penelitian ini ditentukan oleh kriteria sebagai berikut :
Kriteria Inklusi:
1. Usia 20-30 tahun
Universitas Sumatera Utara
45
2. Kebersihan mulut baik dan jaringan periodontal dalam keadaan sehat dengan
kedalaman probing tidak lebih dari 3mm
3. Molar pertama dalam keadaan baik, tidak rotasi, tidak terdapat karies
interproksimal pada molar pertama dan premolar kedua, terdapat kontak
proksimal yang baik, dan dapat dipasangkan separator pada sisi mesial
4. Keadaan umum baik
5. Bersedia ikut serta dalam penelitian sampai selesai
Kriteria eksklusi:
1. Menderita penyakit sistemik kelainan metabolisme tulang
2. Sedang dalam pengobatan menggunakan obat anti-inflamasi
3. Sedang mengkonsumsi suplemen kalsium dan vitamin D
3.4 Variabel Penelitian
3.4.1 Variabel bebas:
Variabel bebas pada penelitian ini adalah tekanan mekanis yang dihasilkan
olehelastomer separator.
3.4.2 Variabel tergantung:
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar TGF-β2 CSG pada
sisi tertekan atau sisi distal molar pertama atas yang akan diukur dengan
menggunakan ELISA dan pergerakan gigi yang dilihat dari besar ruangan yang
terbentuk diantara mesial molar pertama dengan distal premolar kedua akibat
pemasangan separator.
Universitas Sumatera Utara
46
3.4.3 Variabel kendali:
Variabel yang dikendalikan pada penelitian ini adalah :
1. Usia pasien 20-30 tahun.
2. Daya yang dihasilkan oleh elastomerseparator
3. Kesehatan jaringan periodontal
4. Waktu pengambilan cairan sulkus gingiva adalah sebelum dilakukan
aktivasi, 48 jam, dan 72 jam setelah pemasangan elastomer separator.
5. Waktu pengukuran besar ruangan yang terbentuk antara mesial molar
pertama dan distal premolar kedua akibat pemasangan elastomer separator
adalah pada 48 jam dan 72 jam setelah pemasangan.
3.4.4 Variabel tak terkendali:
Variabel tak terkendali pada penelitian ini adalah kepadatan tulang alveolar,
kekuatan daya kunyah subyek penelitian, dan kerapatan interproksimal awal.
3.5 Definisi Operasional
Definisi operasional, cara ukur, hasil ukur, dan alat ukur dari masingmasing variabel penelitian dijelaskan pada tabel 3.1
Universitas Sumatera Utara
47
Tabel 3.1 Definisi Operasional, Alat Ukur, dan Skala Ukur dari Variabel Bebas dan
Tergantung dari Penelitian
Definisi
Alat
Satuan
Skala
ukur
Ukur
Ukur
Tekanan
mekanik
Respon yang
diberikan
olehseparator yang
diregangkan
sejauh 14mm
untuk
menghasilkan
pergerakan.
Kadar TGF- Kadar TGF-β2
β2
yang diambil dari
cairan sulkus
gingiva pada
bagian distal molar
yang akan
digerakkan pada
subyek penelitian,
diukur pada 0, 48
dan 72 jam.
Besar
Ruangan yang
ruangan
terjadi diantara
yang
molar pertama
terbentuk
dengan premolar
antara molar kedua akibat
pertama
pemasangan
dengan
separator, diukur
premolar
pada 48 dan 72
kedua
jam
Pergerakan
Besar ruangan
gigi
yang terbentuk
dibagi waktu
pengamatan
ELISA
pg/mL
Numerik
Leaf
gauge
mm
Numerik
Leaf
gauge
mm/hari
Numerik
Universitas Sumatera Utara
48
3.6Bahan dan Alat Penelitian
3.6.1 Bahan:
1. Cairan sulkus gingiva pada sisi tekanan dari subyek penelitian
2. Phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4 (Gibco) (Gambar 3.1)
3. Kapas (cotton roll)
4. Kit ELISA (Gambar 3.2)
5. Paper point no. 15 (Gambar 3.3)
Gambar 3.1. Phosphate Buffer Saline(PBS) Gambar 3.2. Kit ELISA human TGF-β2
Gambar 3.3 Paper point no. 15
3.6.2 Alat
1. Kaca mulut untuk menyingkap pipi dan bibir
2. Pinset untuk mengambil dan meletakkan paper point
Universitas Sumatera Utara
49
3. Separator (American Ortho catalog no. 854-250)
4. Tabung Eppendorf 1,5mL sebagai media penyimpanan CSG yang telah
diambil dengan paper point
5. Mikropipet dan mikropipet multichannel (Gambar 3.4)
6. Leaf Gauge dengan akurasi 0,1 mm (Dentsply) (Gambar 3.5)
Gambar 3.4. Mikropipet dan mikropipet multichannel
Gambar 3.5 Leaf gauge (Dentsply)
3.7 Pelaksanaan Penelitian
Molar pertama atas dilakukan pemasangan elastomer separator pada sisi
mesial (Gambar 3.6). Separator dimasukkan pada titik kontak interproksimal antara
premolar kedua dengan molar pertama dengan menggunakan universal separation
Universitas Sumatera Utara
50
plier. Setiap separator dilakukan perenggangan yang sama yaitu sejauh 14 mm. Kadar
TGF-β2 diperiksa dengan mengukur peningkatan kadar TGF-β2 pada cairan sulkus
gingiva yang diambil menggunakan paper point pada sisi distal yang mengalami
tekanan. CSG diambil sebelum pemberian daya, setelah itu dilakukan pengambilan
sampel di tempat yang sama 48 jam setelahnya dan diulang 72 jam kemudian. Paper
point dimasukkan pada sulkus gingiva sebelah distal molar, dengan menggunakan
metode intracrevicular superficial. Cairan sulkus gingiva ini kemudian diuji dengan
menggunakan metode ELISA.
Gambar 3.6. Pemasangan separator pada sisi mesial molar pertama
3.7.1Cara Pengambilan CSG
Pengambilan CSG dilakukan dengan menggunakan modifikasi dari metode Barbieri
dkk15. Caranya adalah sebagai berikut :
1. Sebelum dilakukan pengambilan CSG, subyek penelitian diminta untuk berkumur.
Universitas Sumatera Utara
51
2. Permukaan gigi yang akan diambil cairannya dibersihkan dari plak, kemudian
dikeringkan dengan udara dan dijaga agar tetap kering dengan pemasangan cotton
roll.
3. Paper point dimasukkan ke dalam sulkus gingiva sebelah distal molar pertama
sedalam 1 mm dan didiamkan selama 5 menit (Gambar 3.7) . Paper point dikeluarkan
dari celah gusi dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi
phosphate buffer saline (PBS) yang berisi 1M PSMF sebanyak 350 μl (Gambar 3.8)
dan kemudian langsung disimpan pada suhu -80°C.
4. Paper point yang terkontaminasi darah sewaktu pengambilan cairan sulkus gingiva
tidak digunakan sebagai sampel.
Gambar 3.7. Pengambilan CSG pada sisi distal molar pertama atas
Universitas Sumatera Utara
52
Gambar 3.8. Paper point yang dimasukkan kedalam tabung
Eppendorf berisi PMSF dan PBS
3.7.2 Pengukuran Kadar TGF-β2
Cairan sulkus gingiva yang telah terkumpul pada paper point disimpan pada
suhu -80° sampai pada waktu pemeriksaan. Pemeriksaan menggunakan metode
Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA). Antibodi yang terikat pada
microplate yang digunakan pada penelitian ini adalah antibodi monoklonal.
Urutan pengerjaan ELISA adalah sebagai berikut :
a. Siapkan semua reagen yang diperlukan sesuai dengan standar kerja
b. Sampel disentrifugasi 12000x9 rpm selama 10 menit
c. Sampel dipisahkan antara bagian serum dengan plasma hingga yang tersisa
adalah sampel dalam bentuk serum yang memiliki kandungan TGF-β2
Universitas Sumatera Utara
53
d. Sampel dalam bentuk serum kemudian divortex, dilakukan preparasi sesuai
dengan petunjuk yang terdapat pada kit ELISA, dan kemudian disimpan pada
suhu -80° C
e. Pada hari pengerjaannya, sampel dikeluarkan dari lemari pendingin dan
dicairkan pada suhu ruang tanpa alat bantu dan kemudian divortex selama
10 detik setiap sampel
f. Masukkan 10 µl dari setiap larutan sampel dan larutan standar ke dalam
sumur microplate dan dilakukan duplikasi
g. Tutup dengan lapisan adhesif dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 jam,
letakkan pada microplate shaker dengan kecepatan 100 rpm
h. Buka lapisan adhesif, kosongkan setiap sumur, bilas dengan wash buffer
volume 250 µl sebanyak 3 kali pembilasan. Setelah selesai pembilasan,
ketukkan microplate ke atas handuk untuk membuang sisa bahan
i. Tambahkan biotin conjugate sebanyak 100 µl ke dalam setiap sumur
j. Tutup kembali dengan lapisan adhesif, inkubasi pada suhu ruang selama 2 jam
k. Kosongkan sumur dan cuci dengan wash buffer sebanyak 3 kali
l. Tambahkan 100 µl streptavidin-HRP pada setiap sumur
m. Tutup dengan lapisan adhesif dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu
ruang
n. Kosongkan dan bilas dengan wash buffer
o. Tambahkan 100 µl substrate solution pada setiap sumur
Universitas Sumatera Utara
54
p. Inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit
q. Tambahkan 50 µl stop solution pada setiap sumur
r. Perubahan warna menandakan TGF-β2 sudah melekat pada dasar sumur
s. Lakukan pembacaan hasil TGF-β2 dengan ELISA reader pada panjang
gelombang utama 490 ηm dan 620 ηm sebagai panjang gelombang referensi.
3.7.3 Pengukuran Pergerakan Gigi
Pergerakan gigi diukur dengan cara mengukur besar ruangan yang terjadi
antara premolar kedua dan molar pertama pada 48 jam dan 72 jam. Pengukuran besar
ruangan dilakukan menurut metode Malagan dkk
11
. Besar ruangan yang terjadi
antara premolar kedua dengan molar pertama dicatat pada 48 jam dan 72 jam setelah
pemasangan separator. Subyek dipanggil setelah 48 jam, kemudian separator
dilepaskan secara hati-hati dengan menggunakan sonde. Dilakukan pengeringan pada
area interproksimal premolar kedua dengan molar pertama, kemudian besarnya
ruangan diukur dengan menggunakan leaf gauge(Gambar 3.9). Setelah dilakukan
pengukuran besar ruangan, separator yang sama dimasukkan kembali pada tempat
sebelumnya. Keseluruhan prosedur ini kemudian diulang kembali pada 24 jam
berikutnya. Subyek diminta untuk tidak memakan makanan yang keras selama
periode penelitian untuk mencegah terlepasnya separator.
Universitas Sumatera Utara
55
Gambar 3.9. Pengukuran besar ruangan dengan menggunakan leaf gauge
3.8 Analisis Data
Data akan dianalisa secara deskriptif untuk mendapatkan nilai rata-rata dan
simpangan baku. Kemudian akan dilakukan dengan uji normalitas data menggunakan
Saphiro-Wilk test. Perbedaan perubahan kadar TGF-β2 diuji dengan menggunakan uji
Wilcoxon signed rank. Hubungan pergerakan gigi dengan perubahan kadar TGF-β
diuji dengan menggunakan uji korelasi Spearman.
Universitas Sumatera Utara
56
BAB 4
HASIL PENELITIAN
Subyek pada penelitian ini adalah pasien ortodonti yang akan dilakukan
separasi pada gigi molar pertama dengan menggunakan elastomer separator.
Sedangkan sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah cairan sulkus gingiva.
Cairan sulkus gingiva diambil dari sisi distal gigi molar pertama yang akan
dipasangkan separator.
Kadar TGF-β2 (pg/μL) pada cairan sulkus gingiva diukur dengan
menggunakan metode ELISA. Pembacaan Optical Density (OD)yang dihasilkan dari
perubahan warna dilakukan dengan menggunakan ELISA reader pada 450 ηm
sebagai panjang gelombang utama dan 490 ηm sebagai panjang gelombang referensi.
Gambar 4.1 menunjukkan grafik perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu
pengamatan.
Kadar
TGFβ2
(pg/μ
L)
Waktu pengamatan (jam)
Gambar 4.1. Grafik perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu pengamatan.
Universitas Sumatera Utara
57
Berdasarkan Gambar 4.1, terlihat bahwa kadar TGF-β2 pada 48 jam setelah
pemasangan separator mengalami sedikit peningkatan dan kemudian meningkat tajam
pada 72 jam setelah pemasangan separator. Peningkatan besar ruangan yang
dihasilkan oleh elastomer separator pada setiap waktu pengamatan terdapat pada
Gambar 4.2 Pada jam ke 48, rerata besar ruangan yang dihasilkan adalah 0,19 mm,
sedangkan pada jam ke 72, rerata besar ruangan yang dihasilkan oleh elastomer
separator adalah sebesar 0,283 mm.
0,3
Besa0,3
0,25
r
0,2
0,2
ruan0,15
0,1
gan 0,1
0,05
(mm
0 0
)
0
48
72
Waktu pengamatan (jam)
Gambar 4.2. Besar ruangan yang dihasilkan oleh separator.
Seluruh data diuji normalitas dengan menggunakan uji Saphiro-Wilk, dan
didapat bahwa data tidak terdistribusi normal. Karena data tidak terdistribusi normal,
maka untuk mengetahui perbedaan perubahan kadar dan besar ruangan antar waktu
pengamatan dilakukan dengan uji Friedman, dengan derajat kemaknaan 0,05. Tabel
4.1 menunjukkan perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu pengamatan.
Perubahan rerata besar ruangan selama waktu pengamatan terdapat pada Tabel 4.2.
Universitas Sumatera Utara
58
Tabel 4.1. Perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu pengamatan.
TGF-β2 pada 0 jam
TGF-β2 pada 48 jam
TGF-β2 pada 72 jam
*p
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Jenis dan Desain Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian analitik dengan jenis eksperimental kuasi yang
dilakukan pada pasien yang akan mendapatkan perawatan ortodonti menggunakan
piranti ortodonti cekat untuk melihat perubahan kadar TGF-β2 saat dilakukan
pemasangan separator pada sisi tekanan.
3.2 Tempat dan waktu penelitian
3.2.1 Tempat Penelitian
Pemasangan separator, pengambilan CSG, dan pengukuran besar ruangan
dilakukan di praktek dokter gigi swasta di Bogor. Pemeriksaan kadar TGF-β2 dengan
menggunakan uji ELISA akan dilakukan di Laboratorium Biologi Oral Fakultas
Kedokteran Gigi UI.
3.2.2Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Mei 2015 hingga September 2015.
3.3 Populasi dan Sampel penelitian
3.3.1 Populasi Penelitian
Universitas Sumatera Utara
44
Populasi penelitian adalah semua pasien yang akan dirawat menggunakan
piranti ortodonti cekat selama periode penelitian yang disesuaikan dengan kriteria
inklusi dan eksklusi.
3.3.2 Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini adalah cairan sulkus gingiva molar pertama atas
yang akan dipasangkan separator. Jumlah sampel yang diperiksa ditentukan dengan
rumus beda mean pada satu populasi :
N1 = N2 = 2 �(�� + ��)��
Keterangan :
�1 − �2
n1 = n2
= jumlah
sampel pada masing-masing kelompok
Zα
= deviat baku normal untuk α = 5% Zα = 1,645
Zβ
= deviat baku normal untuk β = 20% Zβ= 0,842
S
= simpangan baku
X1
= rata-rata kadar TGF-β2 pada kontrol
X2
= rata-rata kadar TGF-β2 setelah pemberian daya
Berdasarkan perhitungan rumus besar sampel maka sampel yang diperlukan sebanyak
minimal 12 sampel.
Sampel yang dipilih pada penelitian ini ditentukan oleh kriteria sebagai berikut :
Kriteria Inklusi:
1. Usia 20-30 tahun
Universitas Sumatera Utara
45
2. Kebersihan mulut baik dan jaringan periodontal dalam keadaan sehat dengan
kedalaman probing tidak lebih dari 3mm
3. Molar pertama dalam keadaan baik, tidak rotasi, tidak terdapat karies
interproksimal pada molar pertama dan premolar kedua, terdapat kontak
proksimal yang baik, dan dapat dipasangkan separator pada sisi mesial
4. Keadaan umum baik
5. Bersedia ikut serta dalam penelitian sampai selesai
Kriteria eksklusi:
1. Menderita penyakit sistemik kelainan metabolisme tulang
2. Sedang dalam pengobatan menggunakan obat anti-inflamasi
3. Sedang mengkonsumsi suplemen kalsium dan vitamin D
3.4 Variabel Penelitian
3.4.1 Variabel bebas:
Variabel bebas pada penelitian ini adalah tekanan mekanis yang dihasilkan
olehelastomer separator.
3.4.2 Variabel tergantung:
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar TGF-β2 CSG pada
sisi tertekan atau sisi distal molar pertama atas yang akan diukur dengan
menggunakan ELISA dan pergerakan gigi yang dilihat dari besar ruangan yang
terbentuk diantara mesial molar pertama dengan distal premolar kedua akibat
pemasangan separator.
Universitas Sumatera Utara
46
3.4.3 Variabel kendali:
Variabel yang dikendalikan pada penelitian ini adalah :
1. Usia pasien 20-30 tahun.
2. Daya yang dihasilkan oleh elastomerseparator
3. Kesehatan jaringan periodontal
4. Waktu pengambilan cairan sulkus gingiva adalah sebelum dilakukan
aktivasi, 48 jam, dan 72 jam setelah pemasangan elastomer separator.
5. Waktu pengukuran besar ruangan yang terbentuk antara mesial molar
pertama dan distal premolar kedua akibat pemasangan elastomer separator
adalah pada 48 jam dan 72 jam setelah pemasangan.
3.4.4 Variabel tak terkendali:
Variabel tak terkendali pada penelitian ini adalah kepadatan tulang alveolar,
kekuatan daya kunyah subyek penelitian, dan kerapatan interproksimal awal.
3.5 Definisi Operasional
Definisi operasional, cara ukur, hasil ukur, dan alat ukur dari masingmasing variabel penelitian dijelaskan pada tabel 3.1
Universitas Sumatera Utara
47
Tabel 3.1 Definisi Operasional, Alat Ukur, dan Skala Ukur dari Variabel Bebas dan
Tergantung dari Penelitian
Definisi
Alat
Satuan
Skala
ukur
Ukur
Ukur
Tekanan
mekanik
Respon yang
diberikan
olehseparator yang
diregangkan
sejauh 14mm
untuk
menghasilkan
pergerakan.
Kadar TGF- Kadar TGF-β2
β2
yang diambil dari
cairan sulkus
gingiva pada
bagian distal molar
yang akan
digerakkan pada
subyek penelitian,
diukur pada 0, 48
dan 72 jam.
Besar
Ruangan yang
ruangan
terjadi diantara
yang
molar pertama
terbentuk
dengan premolar
antara molar kedua akibat
pertama
pemasangan
dengan
separator, diukur
premolar
pada 48 dan 72
kedua
jam
Pergerakan
Besar ruangan
gigi
yang terbentuk
dibagi waktu
pengamatan
ELISA
pg/mL
Numerik
Leaf
gauge
mm
Numerik
Leaf
gauge
mm/hari
Numerik
Universitas Sumatera Utara
48
3.6Bahan dan Alat Penelitian
3.6.1 Bahan:
1. Cairan sulkus gingiva pada sisi tekanan dari subyek penelitian
2. Phosphate buffer saline (PBS) pH 7,4 (Gibco) (Gambar 3.1)
3. Kapas (cotton roll)
4. Kit ELISA (Gambar 3.2)
5. Paper point no. 15 (Gambar 3.3)
Gambar 3.1. Phosphate Buffer Saline(PBS) Gambar 3.2. Kit ELISA human TGF-β2
Gambar 3.3 Paper point no. 15
3.6.2 Alat
1. Kaca mulut untuk menyingkap pipi dan bibir
2. Pinset untuk mengambil dan meletakkan paper point
Universitas Sumatera Utara
49
3. Separator (American Ortho catalog no. 854-250)
4. Tabung Eppendorf 1,5mL sebagai media penyimpanan CSG yang telah
diambil dengan paper point
5. Mikropipet dan mikropipet multichannel (Gambar 3.4)
6. Leaf Gauge dengan akurasi 0,1 mm (Dentsply) (Gambar 3.5)
Gambar 3.4. Mikropipet dan mikropipet multichannel
Gambar 3.5 Leaf gauge (Dentsply)
3.7 Pelaksanaan Penelitian
Molar pertama atas dilakukan pemasangan elastomer separator pada sisi
mesial (Gambar 3.6). Separator dimasukkan pada titik kontak interproksimal antara
premolar kedua dengan molar pertama dengan menggunakan universal separation
Universitas Sumatera Utara
50
plier. Setiap separator dilakukan perenggangan yang sama yaitu sejauh 14 mm. Kadar
TGF-β2 diperiksa dengan mengukur peningkatan kadar TGF-β2 pada cairan sulkus
gingiva yang diambil menggunakan paper point pada sisi distal yang mengalami
tekanan. CSG diambil sebelum pemberian daya, setelah itu dilakukan pengambilan
sampel di tempat yang sama 48 jam setelahnya dan diulang 72 jam kemudian. Paper
point dimasukkan pada sulkus gingiva sebelah distal molar, dengan menggunakan
metode intracrevicular superficial. Cairan sulkus gingiva ini kemudian diuji dengan
menggunakan metode ELISA.
Gambar 3.6. Pemasangan separator pada sisi mesial molar pertama
3.7.1Cara Pengambilan CSG
Pengambilan CSG dilakukan dengan menggunakan modifikasi dari metode Barbieri
dkk15. Caranya adalah sebagai berikut :
1. Sebelum dilakukan pengambilan CSG, subyek penelitian diminta untuk berkumur.
Universitas Sumatera Utara
51
2. Permukaan gigi yang akan diambil cairannya dibersihkan dari plak, kemudian
dikeringkan dengan udara dan dijaga agar tetap kering dengan pemasangan cotton
roll.
3. Paper point dimasukkan ke dalam sulkus gingiva sebelah distal molar pertama
sedalam 1 mm dan didiamkan selama 5 menit (Gambar 3.7) . Paper point dikeluarkan
dari celah gusi dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi
phosphate buffer saline (PBS) yang berisi 1M PSMF sebanyak 350 μl (Gambar 3.8)
dan kemudian langsung disimpan pada suhu -80°C.
4. Paper point yang terkontaminasi darah sewaktu pengambilan cairan sulkus gingiva
tidak digunakan sebagai sampel.
Gambar 3.7. Pengambilan CSG pada sisi distal molar pertama atas
Universitas Sumatera Utara
52
Gambar 3.8. Paper point yang dimasukkan kedalam tabung
Eppendorf berisi PMSF dan PBS
3.7.2 Pengukuran Kadar TGF-β2
Cairan sulkus gingiva yang telah terkumpul pada paper point disimpan pada
suhu -80° sampai pada waktu pemeriksaan. Pemeriksaan menggunakan metode
Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA). Antibodi yang terikat pada
microplate yang digunakan pada penelitian ini adalah antibodi monoklonal.
Urutan pengerjaan ELISA adalah sebagai berikut :
a. Siapkan semua reagen yang diperlukan sesuai dengan standar kerja
b. Sampel disentrifugasi 12000x9 rpm selama 10 menit
c. Sampel dipisahkan antara bagian serum dengan plasma hingga yang tersisa
adalah sampel dalam bentuk serum yang memiliki kandungan TGF-β2
Universitas Sumatera Utara
53
d. Sampel dalam bentuk serum kemudian divortex, dilakukan preparasi sesuai
dengan petunjuk yang terdapat pada kit ELISA, dan kemudian disimpan pada
suhu -80° C
e. Pada hari pengerjaannya, sampel dikeluarkan dari lemari pendingin dan
dicairkan pada suhu ruang tanpa alat bantu dan kemudian divortex selama
10 detik setiap sampel
f. Masukkan 10 µl dari setiap larutan sampel dan larutan standar ke dalam
sumur microplate dan dilakukan duplikasi
g. Tutup dengan lapisan adhesif dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 jam,
letakkan pada microplate shaker dengan kecepatan 100 rpm
h. Buka lapisan adhesif, kosongkan setiap sumur, bilas dengan wash buffer
volume 250 µl sebanyak 3 kali pembilasan. Setelah selesai pembilasan,
ketukkan microplate ke atas handuk untuk membuang sisa bahan
i. Tambahkan biotin conjugate sebanyak 100 µl ke dalam setiap sumur
j. Tutup kembali dengan lapisan adhesif, inkubasi pada suhu ruang selama 2 jam
k. Kosongkan sumur dan cuci dengan wash buffer sebanyak 3 kali
l. Tambahkan 100 µl streptavidin-HRP pada setiap sumur
m. Tutup dengan lapisan adhesif dan diinkubasi selama 20 menit pada suhu
ruang
n. Kosongkan dan bilas dengan wash buffer
o. Tambahkan 100 µl substrate solution pada setiap sumur
Universitas Sumatera Utara
54
p. Inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit
q. Tambahkan 50 µl stop solution pada setiap sumur
r. Perubahan warna menandakan TGF-β2 sudah melekat pada dasar sumur
s. Lakukan pembacaan hasil TGF-β2 dengan ELISA reader pada panjang
gelombang utama 490 ηm dan 620 ηm sebagai panjang gelombang referensi.
3.7.3 Pengukuran Pergerakan Gigi
Pergerakan gigi diukur dengan cara mengukur besar ruangan yang terjadi
antara premolar kedua dan molar pertama pada 48 jam dan 72 jam. Pengukuran besar
ruangan dilakukan menurut metode Malagan dkk
11
. Besar ruangan yang terjadi
antara premolar kedua dengan molar pertama dicatat pada 48 jam dan 72 jam setelah
pemasangan separator. Subyek dipanggil setelah 48 jam, kemudian separator
dilepaskan secara hati-hati dengan menggunakan sonde. Dilakukan pengeringan pada
area interproksimal premolar kedua dengan molar pertama, kemudian besarnya
ruangan diukur dengan menggunakan leaf gauge(Gambar 3.9). Setelah dilakukan
pengukuran besar ruangan, separator yang sama dimasukkan kembali pada tempat
sebelumnya. Keseluruhan prosedur ini kemudian diulang kembali pada 24 jam
berikutnya. Subyek diminta untuk tidak memakan makanan yang keras selama
periode penelitian untuk mencegah terlepasnya separator.
Universitas Sumatera Utara
55
Gambar 3.9. Pengukuran besar ruangan dengan menggunakan leaf gauge
3.8 Analisis Data
Data akan dianalisa secara deskriptif untuk mendapatkan nilai rata-rata dan
simpangan baku. Kemudian akan dilakukan dengan uji normalitas data menggunakan
Saphiro-Wilk test. Perbedaan perubahan kadar TGF-β2 diuji dengan menggunakan uji
Wilcoxon signed rank. Hubungan pergerakan gigi dengan perubahan kadar TGF-β
diuji dengan menggunakan uji korelasi Spearman.
Universitas Sumatera Utara
56
BAB 4
HASIL PENELITIAN
Subyek pada penelitian ini adalah pasien ortodonti yang akan dilakukan
separasi pada gigi molar pertama dengan menggunakan elastomer separator.
Sedangkan sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah cairan sulkus gingiva.
Cairan sulkus gingiva diambil dari sisi distal gigi molar pertama yang akan
dipasangkan separator.
Kadar TGF-β2 (pg/μL) pada cairan sulkus gingiva diukur dengan
menggunakan metode ELISA. Pembacaan Optical Density (OD)yang dihasilkan dari
perubahan warna dilakukan dengan menggunakan ELISA reader pada 450 ηm
sebagai panjang gelombang utama dan 490 ηm sebagai panjang gelombang referensi.
Gambar 4.1 menunjukkan grafik perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu
pengamatan.
Kadar
TGFβ2
(pg/μ
L)
Waktu pengamatan (jam)
Gambar 4.1. Grafik perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu pengamatan.
Universitas Sumatera Utara
57
Berdasarkan Gambar 4.1, terlihat bahwa kadar TGF-β2 pada 48 jam setelah
pemasangan separator mengalami sedikit peningkatan dan kemudian meningkat tajam
pada 72 jam setelah pemasangan separator. Peningkatan besar ruangan yang
dihasilkan oleh elastomer separator pada setiap waktu pengamatan terdapat pada
Gambar 4.2 Pada jam ke 48, rerata besar ruangan yang dihasilkan adalah 0,19 mm,
sedangkan pada jam ke 72, rerata besar ruangan yang dihasilkan oleh elastomer
separator adalah sebesar 0,283 mm.
0,3
Besa0,3
0,25
r
0,2
0,2
ruan0,15
0,1
gan 0,1
0,05
(mm
0 0
)
0
48
72
Waktu pengamatan (jam)
Gambar 4.2. Besar ruangan yang dihasilkan oleh separator.
Seluruh data diuji normalitas dengan menggunakan uji Saphiro-Wilk, dan
didapat bahwa data tidak terdistribusi normal. Karena data tidak terdistribusi normal,
maka untuk mengetahui perbedaan perubahan kadar dan besar ruangan antar waktu
pengamatan dilakukan dengan uji Friedman, dengan derajat kemaknaan 0,05. Tabel
4.1 menunjukkan perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu pengamatan.
Perubahan rerata besar ruangan selama waktu pengamatan terdapat pada Tabel 4.2.
Universitas Sumatera Utara
58
Tabel 4.1. Perubahan rerata kadar TGF-β2 selama waktu pengamatan.
TGF-β2 pada 0 jam
TGF-β2 pada 48 jam
TGF-β2 pada 72 jam
*p