PEWARNAAN GRAM LABORATORIUM MIKROBIOLOGI id

PEWARNAAN GRAM
LAPORAN UTAMA
Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat kelulusan
Praktikum Mikrobiologi Pangan Jurusan Teknologi Pangan
Oleh :
Nama
NRP
Meja
Kelompok
Asisten

:
:
:
:
:

Nugraha Susanto
113020068
5 (Lima)
D

Astrie Wijayanthi

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI PANGAN
JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS PASUNDAN
BANDUNG
2012

LEMBAR PENGESAHAN
PEWARNAAN GRAM
Laporan ini telah diperiksa dan disetujui untuk memenuhi
Persyaratan Kelulusan Praktikum Mikrobiologi Pangan,
Jurusan Teknologi Pangan, Fakultas Teknik,
Universitas Pasundan, Bandung 2012

Menyetujui,

Astry Wijayanti
Koordinator Laboratorium

Sekaligus
Asisten Pembimbing

Rianti Herdiyanti
Asisten Laporan

KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur hanyalah bagi Allah SWT, Dzat
Yang Maha Kuasa, dan Maha Mengetahui yang selalu
memberikan
sehingga

karunia

penulis

dan

dapat

rahmat-Nya
menyelesaikan

kepada

penulis,

laporan

utama

praktikum mikrobiologi pangan ini.
Laporan utama ini disusun untuk memenuhi salah satu
persyaratan kelulusan praktikum mikrobiologi pangan di
Laboratorium

Mikrobiologi

Pangan,

Jurusan

Teknologi

Pangan, Fakultas Teknik, Universitas Pasundan Bandung.
Laporan utama ini disusun berdasarkan percobaan yang telah
penulis laksanakan selama ini di Laboratorium Mikrobiologi
Pangan.
Dalam penyusunan laporan utama ini, penulis banyak
sekali motivasi dari berbagai pihak dalam menyelesaikan
laporan ini. Oleh karena itu pada kesempatan ini, penulis ingin
menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya
kepada :
1. Kedua orang tua yang tidak henti-hentinya mendoakan dan
memberikan semangat kepada penulis dalam menjalani
perkuliahan dan praktikum ini.
2. Neneng Suliasih, Ir, MP. dan Dr. H. Dede Zaenal Arief, Ir,
M.Sc. selaku koordinator Laboratorium Mikrobiologi Pangan.

1

3. Dr. H. Dede Zaenal Arief, Ir, M.Sc. selaku koordinator
Laboratorium Mikrobiologi Pangan sekalius dosen mata kuliah
mikrobiologi pangan.
4.Astrie Wijayanthie, selaku koordinator asisten Laboratorium
Mikrobiologi Pangan dan asisten penulis.
6. Seluruh Asisten Laboratorium Mikrobiologi Pangan, yaitu
Teh Farrah, Teh Seli, Teh Vega, dan Teh Natasya, Teh Rosi,
dan Kang Firman serta Teh Rianti sekaligus asisten laporan
penulis, terima kasih atas bimbingannya selama praktikum.
6. Teman-teman dekat saya Aditya Bayu Devangga, Nazir
Siddiq dan Egi Priadi Dwitama dan Yunus Septiawan.
7. Teman-teman angkatan 2011 “Chocolatech’11” yang telah
bersama-sama melalui masa pahit dan manis dan juga
memberikan dukungan kepada penulis dalam menyusun
laporan utama ini.
9. Teman-teman sekelompok Bayu, Mutiani dan Nafisah yang
selalu kompak dalam praktikum.
10. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan satu
persatu, yang telah membantu penulis selama prkatikum, dan

juga pada saat menyusun laporan utama ini.
Dengan segala kerendahan hati, penulis menyadari
bahwa “tiada gading yang tak retak, tiada gelombang tanpa
ombak”, untuk itu segala kesalahan merupakan kelemahan
dan kekurangan penulis dan penulis menyadari laporan utama
ini masih jauh dari kata sempurna karena kesempurnaan
hanyalah milik sang Khalik. Segala kritik dan saran yang

2

membangun sangat penulis harapkan untuk koreksi bagi
penyusunan

laporan

sehingga

ada

peningkatan

untuk

selanjutnya.
Akhir kata semoga laporan utama ini bisa bermanfaat
bagi semua pihak teman-teman Jurusan Teknologi Pangan
pada umumnya dan penulis khususnya. Semoga Allah SWT
senantiasa memberikan petunjuk dan perlindungan pada kita
semua.

Bandung, Desember 2012

Penulis

3

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR.........................................................................i
DAFTAR ISI.....................................................................................iv
DAFTAR GAMBAR.........................................................................v

DAFTAR TABEL.............................................................................vi
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................vii
INTISARI.......................................................................................viii
ABSTRACT......................................................................................ix
I PENDAHULUAN...........................................................................1

1.1. Latar Belakang Percobaan.....................................1
1.2. Tujuan Percobaan..................................................2
1.3. Prinsip Percobaan..................................................2
II BAHAN, ALAT, DAN METODE PERCOBAAN.....................3

3.1. Bahan yang Digunakan.........................................3
3.2. Alat yang Digunakan.............................................3
3.3. Metode Percobaan.................................................3
III HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN......................6

3.1 Hasil Pengamatan...................................................6
3.2 Pembahasan............................................................7
IV KESIMPULAN DAN SARAN..................................................19

5.1 Kesimpulan...........................................................19
5.2 Saran.....................................................................19
DAFTAR PUSTAKA......................................................................20

DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Metode Pewarnaan Gram………………………......5
Gambar 2. Dinding Sel Bakteri…………………………………12

5

DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hasil Pengamatan Pewarnaan Gram………………6
Tabel 2. Sifat Bakteri Berdasarkan Gramnya………………...11
Tabel 3 . Struktur Bakteri.....................................................12

6

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Pemakaian Mikroskop........................................21
Lampiran 2. Pemakaian Mikroskop........................................22

Lampiran 3. Pewarnaan Gram...............................................24
Lampiran 4. Pewarnaan Negatif.............................................25
Lampiran 5. Penetapan Jumlah Sel Hidup dan Sel Mati........26
Lampiran 6. Penetapan Jumlah Sel Total..............................27
Lampiran 7. Pembentukan Spora...........................................28
Lampiran 8. Tetesan Bergantung...........................................30
Lampiran 9. Biakan Lapuk......................................................31
Lampiran 10. Peragian Gula..................................................33
Lampiran 11. Isolasi Cawan Tuang dan Cawan Gores..........34
Lampiran 12. Sterilisasi Alat dan Bahan................................37
Lampiran 13. Pemeriksaan Air...............................................39
Lampiran 14. Pembiakan Serratia marcescens.....................44
Lampiran 15. Pembentukan AMK..........................................46
Lampiran 16. Pembentukkan Indol dari Pepton.....................47
Lampiran 17. Zat Anti Mikroba...............................................48
Lampiran 18. Uji Mutu Makan (UMM)....................................50
Lampiran 19. Pembentukkan H2S..........................................56
Lampiran 20. Perubahan Air Susu.........................................57
Lampiran 21. Pembentukkan Gas..........................................59
Lampiran 22. Penguraian Enzim oleh bakteri........................60

vii

INTISARI
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan yang didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel dan banyak
sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Pewarnaan ini
berguna untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yakni bakteri gram positif dan gram negatif.
Tujuan percobaan pewarnaan gram untuk menegtahui atau
memperjelas bentuk-bentuk sel bakteri yang kebanyakan bersifat
transfaran sehingga dapat dilihat dengan jelas dan untuk
membedakan morfologi dan struktur atau bagian-bagian sel bakteri
gram positif dan gram negatif. Prinsip percobaan pewarnaan gram
berdasarkan pewarnan langsung sehingga sel bakteri terwarnai dan
terlihat jelas dan berdasarkan pewarnaan diferensial yaitu pewarnaan
yang mengacu pada sifat permeabelitas dinding sel masing-masing
bakteri terhadap molekul-molekul zat warna.
Berdasarkan hasil pengamatan, pada percobaan pewarnaan
gram bakteri Staphylococcus aureus termasuk bakteri gram positif
sedangkan bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram negatif.

8

ABSTRACT
Gram staining is based on thick or thin layer of peptidoglycan in
the cell wall and the extent of the layer of fat on the bacterial cell
membrane. Staining is useful to differentiate bacterial species into
two large groups, the gram-positive and gram-negative.
Gram staining experiments aim to clarify know or bacterial cells
forms the largely transfaran can be seen clearly and to distinguish
the morphology and structure of cells or parts of gram-positive and
gram-negative. The principle of gram staining experiments by collorer
directly so that bacteria cells stained and visible and based on the
differential staining refers to staining permeabelitas properties of
each cell wall of bacteria to the dye molecules.
Based on observation, the bacteria Staphylococcus aureus,
including gram-positive bacteria, while the bacteria Escherichia coli
including gram-negative bacteria.

9

I PENDAHULUAN
Bab ini menguraikan mengenai : (1) Latar Belakang
Percobaan, (2) Tujuan Percobaan, dan (3) Prinsip Percobaan.
1.1. Latar Belakang Percobaan
Mikrobiologi merupakan suatu ilmu yang mempelajari
kehidupan mahkluk yang bersifat mikroskopik yang disebut
mikroorganisme

atau

jasad

renik

yaitu

mahkluk

yang

mempunyai ukuran sel sangat kecil dimana setiap selnya
hanya dapat dilihat dengan bantuan mikroskop (Fardiaz,
1992).
Mikrobiologi pangan merupakan ilmu yang mepelajari
pola interaksi antara mikroba dengan bahan pangan baik
secara keseluruhan maupun komponen bahan pangan secara
sendiri-sendiri. Oleh karena itu pada hakikatnya ilmu ini
mempelajari masalah ekologi mikroba sebagai satu sistem,
dimana komponen – komponen bahan pangan dan sel-sel
mikroba sebagai sub-sistemnya yang berintraksi secara
kompleks (Ali, 2012).
Satu sel jasad mikroba merupakan satu kesatuan hidup
dimana satu sel tersebut mengerjakan seluruh fungsi hidup
jasad, oleh karena itu satu sel mikroba dianggap sebagai satu
jasad sedangkan satu sel jasad tingkat tinggi merupakan satu
kesatuan struktur dimana sel dari jasad tingkat tinggi ini hanya

1

mengerjakan fungsi sesuai dengan jaringan dimana sel
tersebut berada
Pewarnaan

(Ali, 2011).
gram

merupakan pewarnaan

yang

didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan
pada dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada
membran

sel

bakteri. Pewarnaan

ini

berguna

untuk

membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
bakteri gram positif dan gram negatif (Wikipedia, 2010).
1.2. Tujuan Percobaan
Tujuan percobaan pewarnaan gram untuk menegtahui
atau memperjelas bentuk-bentuk sel bakteri yang kebanyakan
bersifat transfaran dapat dilihat dengan jelas dan untuk
membedakan morfologi dan struktur atau bagian-bagian sel
bakteri gram positif dan gram negatif.
1.3. Prinsip Percobaan
Prinsip

percobaan

pewarnaan

gram

berdasarkan

pewarnan langsung sehingga sel bakteri terwarnai dan terlihat
jelas dan berdasarkan pewarnaan diferensial yaitu pewarnaan
yang mengacu pada sifat permeabelitas dinding sel masingmasing bakteri terhadap molekul-molekul zat warna.

2

II BAHAN, ALAT, DAN METODE PERCOBAAN
Bab

ini

menguraikan

mengenai:

(1)

Bahan

yang

Digunakan, (2) Alat yang Digunakan, dan (3) Metode
Percobaan.
3.1. Bahan yang Digunakan
Bahan–bahan
pewarnaan gram

yang

digunakan

dalam

percobaan

adalah suspensi Staphylococcus aureus

suspensi Escherichia coli, alkohol 70% dan alkohol 96%
sedangkan sebagai bahan pewarnanya adalah KKV (Kristal
Karbon Violet) , lugol dan fuchin basa.
3.2. Alat yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan pewarnaan
gram

adalah mikroskop, cover glass, tabung reaksi, pipet

tetes, jarum oase dan pembakar spirtus.
3.3. Metode Percobaan
Bersihkan kaca objek dengan alkohol 70% dengan
menggunakan
kemudian

kapas

fiksasi

maupun

kaca

objek

tisu

setalah

dengan

dibersihkan

tujuan

untuk

menghilangkan lemak yang akan mengganggu terhadap
pengamatan, langkah selanjurtnya pijarkan jarum oase, ambil
suspensi Staphylococcus aureus dan suspensi Escherichia
coli teteskan kelensa objek dan fiksasi, berikan 1 – 2 tetes
KKV (Kristal Karbon Violet) dan diamkan selama tiga menit

3

4
kemudian beri satu tetes lugol dan diamkan selama 45 detik,
setelah 45 detik bilas dengan alcohol 96% serta keringkan
dengan mengggunakan kertas saring, selanjutnya beri 1 – 2
tetes fucshin basa diamkan tiga menit lalu keringkan dengan
kertas saring, amati dengan menggunakan mikroskop dengan
pembesaran 100x dan 400x.

Bersihkan kaca objek dengan
alkohol 70 % dan Fiksasi.

Pijarkan jarum oase

Ambil suspensi
Staphylococcus aureus dan
suspensi Escherichia coli

5

Fiksasi

Beri 1-2 tetes KKV diamkan 3
menit kemudian beri 1 tetes lugol
diamkan 45 detik.

Bilas dengan alkohol 96%
diamkan 1 menit keringkan
dengan kertas saring.

Beri 1-2 tetes fucshin basa
diamkan 3 menit lalu
keringkan dengan kertas
saring.

Amati dengan pembesaran 100x dan 400x

6
Gambar 1. Metode Pewarnaan Gram.

III HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Bab ini menguraikan mengenai : (1) Hasil Pengamatan,
dan (2) Pembahasan.
3.1 Hasil Pengamatan
Tabel 1. Hasil Pengamatan Pewarnaan Gram
Gambar

Keterangan
Nama Bakteri : Staphylococcus
aureus

400X

Bentuk

: Coccus (bulat)

Susunan

: Monococcus

Warna

: Ungu

Gram

: Positif

Zat warna
: KKV (Kristal
Karbon Violet)
Nama Bakteri : Escherchia coli
Bentuk

: Batang (bacil)

Susunan

: Monobacil

Warna

: Merah Muda

Zat Warna

: Fuchsin basa

Gram

: Negatif

400X
Sumber : ( Nugraha Susanto, Meja 5, Kelompok D, 2012).

6

7

3.2 Pembahasan
Berdasarkan

hasil

pengamatan,

pada

percobaan

pewarnaan gram terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan
bakteri

Escherichia

Staphylococcus

coli

aureus

didapatkan

termasuk

bahwa

bakteri

gram

bakteri
positif

sedangkan bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram
negatif ( Fardiaz, 1992).
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :
pewarnaan diferensial (gram), pewarnaan sederhana, dan
pewarnaan khusus (Fitria, 2009).
1. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode
empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua
kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif,
berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode
ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark
Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan
teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri
gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan gram, bakteri gram
positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif
tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal

8
(counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat
semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau
merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding
sel mereka (Fitria, 2009).
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negatif
mempertahankan

zat

warna

adalah
metil

bakteri
ungu

yang

pada

tidak

metode

pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara
bakteri gram negative tidak (Aditya, 2010).
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan
zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan gram.
Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah
mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna
merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri
ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri (Aditya, 2010)
2. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan
yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena
hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai
organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi
dengan

pewarnaan-pewarnaan

sederhana

karena

sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat

9
warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya
bersifat

alkolin.

Dengan

pewarnaan

sederhana

dapat

mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna
basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah
metilen biru, kristal violet, dan karbol fuchsin yang mana
pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis
pewarnaan (Fitria, 2009).
a. Pewarnaan Asam, pewarnaan asam merupakan pewarnaan
yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang
dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air
furksin (Aditya, 2010).
b. Pewarnaan Basa, pewarnaan basa atau negatif merupakan
metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai
latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran
sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina
(Aditya, 2010).
3. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk
mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti
bagian spora, kapsul, flagel . Contoh pewarnaan khusus :
Pewarnaan

endospora

Desulfomaculatum,

anggota

dari

dan Bacillus adalah

genus Clostridium,
bakteri

yang

memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora

10
merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga
metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam
tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi,
dan bahan kimia. Tujuan dari pewarnaan ini adalah untuk
membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga
pembedaannya tampak jelas. Endospora

dapat dilihat di

bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak
sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika
dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan
dengan badan inklusi (Aditya, 2010).
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan
untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif.
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal
violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah
mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat
warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan
sewaktu diberi zat pewarna air fucshin atau safranin akan
tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Lay,
1994).
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel.
Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan
tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan
safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah
pewarnaan

dengan

kristal

violet,

pori-pori

dinding

sel

11
menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding
sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika
waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram
negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu
pendek (Fitria, 2009).

Sifat

Bakteri

garam

positif

Bakteri

gram

negatif

Komposisi

Kandungan

lipid

Kandungan

lipid

dinding sel

rendah (1-4%)

tinggi

Ketahanan

Lebih sensitif

Lebih tahan

Lebih dihambat

Kurang dihambat

Kebanyakan

Relatif sederhana

terhadap
penisilin
Penghambatan
oleh

pewarna

basa (VK)
Kebutuhan nutrisi

spesies

relatif

kompleks
Ketahanaa

Lebih tahan

Kurang tahan

terhadap
perlakuan fisik
Tabel 2. Sifat Bakteri Berdasarkan Gramnya.
(Fitria, 2009).

12

Gambar 2. Dinding Sel Bakteri
Tabel 3 . Struktur Bakteri
N
O
1

Struktur

Capsul

Fungsi

Komposisi

Pelindung, perekat

Karbohidrat

antar sel, cadangan

(gula

karbohidrat

sederhana,
amino, asam
gula)

2

Fagella

Alat gerak

Protein

13

3

Pilli

Transfer material gen

Protein

4

Cell wall

Pelindung sel, pemberi

Mukokomplek

murein

bentuk pada sel

s

Cytoplasmi

Pengatur transfor

Protein, lipid,

c

nutrisi pada sisa

asam nukleat

membrane

metabolisme

Ribosom

Tempat polipeptidasi

5

6

RNA, Protein

protein
7

Nukleus

Lokasi gen

Posforprotein
dan lipoprotein

8

Volutin

Cadangan posfat

DNA

(Ali, 2011 ).
Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara
lain : kristal karbon violet (KKV), lugol ,safranin dan fuchin
basa.
1. Kristal Karbon Violet (KKV)
Kristal karbon violet (KKV) adalah pewarna triarylmethane.
Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode

14
gram klasifikasi bakteri. Crystal violet memiliki sifat sifat anti
bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting
sebagai antiseptik topikal (Sutedjo,1991).
2. Lugol
Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol,
merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air. Larutan
yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan,
dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen
untuk deteksi sedangkan di dalam laboratorium digunakan
sebagai pewarnaan biasanya digunakan dalam pewarnaan
gram sebagai pengintensifan warna bakteri baik gram positif
maupun gram negatif (Dwidjoseputro,1998).
3. Safranin
Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam
histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain
dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruh inti
sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram
stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan,
musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki
struktur kimia ada juga trimetil safranin kedua senyawa
berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi
dan

kebanyakan

prosedur

safranin

tidak

membedakan

diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering
mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga
digunakan sebagai indikator redoks dalam kimia analitik
(Sutedjo,1991).

15
4.

Fucshin Basa
Fucshin basa merupakan campuaran fuchsin fenol dan

dasar yang digunakan dalam prosedur pewarnaan bakteri. Hal
ini umumnya digunakan dalam pewarnaan mikrobakteria
karena memiliki ketertarikan untuk asam mycolic yang
ditemukan di dinding sel mikroba, fuchsin basa juga
digunakan sebagai antiseptik tropikal (Lay,1994).
Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam
empat tahap yaitu:
a. Pemberian

cat

warna

utama

(karbon

kristal

violet)

berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan
lugol.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol 96%.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna fucshin basa
Mekanisme pewarnaan gram dimulai dari fiksasi ke-2,
dengan tujuan untuk membuka pori-pori dari dinding sel
bakteri sehingga bakteri gram positif maupun negatif

akan

dapat menyerap warna.
Kristal karbon violet ini merupakan pewarna primer
(utama) yang akan memberi warna pada mikroorganisme.
Kristal violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan
sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan
seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat
berwarna (ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram
positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan

16
respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel
bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram
negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan
dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan
selama tiga menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat
melekat sempurna pada dinding sel bakteri (Fitria, 2009).
Pewarna lugol yang berfungsi memfiksasi pewarna
primer

yang

diserap

mengintensifkan

warna

mikroorganisme
utama.

Pemberian

target

atau

lugol

pada

pewarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan
warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara
dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,
sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme
gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang
dari sel. Lugol

yang diteteskan didiamkan selama 1 menit

bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi
semakin lebih kuat (Fitria, 2009).
Selanjutnya, pemberian tetes demi tetes alkohol 96%
diteteskan di atas gelas benda tersebut kemudian didiamkan
selama satu menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Alkohol 96% merupakan
solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau
melunturkan

kelebihan

zat

warna

pada

sel

bakteri

(mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung
pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat

17
mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan
bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar,
maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pewarnaan
gram ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan
yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau
bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan

terekstraksi

lipid

sehingga

memperbesar

permeabilitas dinding sel (Fitria, 2009).
Pada pembasuhan menggunakan alcohol 96% terjadi
reaksi, reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%.
Gram Positif : lipid > + alkohol 96%

pori dinding

sel yang terbentuk besar, protein dinding sel terdehidrasi, pori
tidak tertutup (kompleks kristal violet-lugol tercuci).
Fucshin basa merupakan pewarna tandingan atau
pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah
perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, fucshin basa
memberikan warna pada mikroorganisme non target serta
menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan fucshin
basa masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada
bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan

18
perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding
sel dan membran menurun sehingga pewarna fucshin basa
tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu (Fitria, 2009).
Aplikasi dibidang pangan pada percobaan pewarnaan
gram diantaranya untuk mengetahui ada tidaknya bakteri
Escherichia coli dan bakteri Staphylococcus aureus dalam
bahan pangan yang dapat mengganggu ketahanan pangan
dan keamanan pangan karena bakteri Escherichia coli dan
bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri pathogen.

19

IV KESIMPULAN DAN SARAN
Bab ini menguraikan mengenai: (1) Kesimpukan
dan (2) Saran.
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan

hasil

pengamatan,

pada

percobaan

pewarnaan gram terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan
bakteri

Escherichia

Staphylococcus

coli

aureus

didapatkan

termasuk

bahwa

bakteri

gram

bakteri
positif

sedangkan bakteri Escherichia coli termasuk bakteri gram
negatif.
5.2 Saran
Pengamatan pewarnaan gram diperlukan ketelatenan
dan ketelitian dalam pelaksanaan step demi stepnya karena
jika dilakukan dengan cereboh dan tidak menggunakan
prosedur yang telah ditetapkan akan mempengaruhi hasil dan
tidak menutup kemungkinan akan terjadi kecelakaan kerja,
serta sebelum praktikum diharapkan praktikan memahami
terlebih dahulu apa yang akan dikerjakan.

19

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2010. Pewarnaan Gram. Http://www.wikipedia.com,
Akses 1/12/12.
Anonim. 2010. Bakteri Tahan Asam .
http://my.opera.com/chanlightz/blog. Akses 1/12/12.
Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Penerbit : PT
Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Krueger, RG , N.W. Gillham, dan J.H. Coggin JR. 1973.
Introduction To Microboilogy. Penerbit : The
Macmillan Compony. New York.
Muhamad, Ali. 2011 . Mikrobiologi Dasar. Penerbit :
Universitas Pasundan, Bandung.
Muhamad, Ali. 2012 . Mikrobiologi Pangan. Penerbit :
Universitas Pasundan, Bandung.
Pelczar, M. J. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit :
Universitas Indonesia, Jakarta.
Reyza,
M.
2008.
Metode
Pewarnaan
http://qi206.wordpress.co. Akses 1/12/12

20

Gram,