Spektrofotometri UV – Visibel (Bagian II)

JURUSAN FARMASI FKIK
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

Spektrofotometri
UV – Visibel
(Bagian II)
Oleh : Hendri Wasito, S.
Farm., Apt.

Sinar (Radiasi Elektro
Magnetik)

Ketika Sinar menabrak benda
???
Permukaan
pertama
Po

R1

Pa

Pb

R2

b
Harris, 1987

Cahaya (sinar) dengan tenaga
radian P0 menabrak permukaan
Permukaan pertama sampel dengan
ketebalan = b cm
ke dua
P
Cahaya (sinar) dengan tenaga
radian P0 menabrak permukaan
pertama sampel dengan
ketebalan = b cm
Tenaga radian P
ditransmisikan (diteruskan)

Tenaga radian R2
dipantulkan

TRANSMISI QUARTZ


Sinar datang dari medium 1 (udara indeks bias 1,00)
tegak lurus mengenai medium 2 yaitu permukaan
Quartz (indeks bias 1,46). Berapa fraksi sinar yang
diteruskan ?
2

2

Pr n1  n 2 
1
,
00

1

,
46



R
 
 
  0,035


Po n1  n 2 
1,00  1,46 

P
1R
1  0,0350
T



 0,93
Po 1  R 1  0,0350
Jadi Quartz mentransmisikan 93 % dan
memantulkan 7 % tenaga sina datang

Ketika Sinar Menabrak
Sampel ???
Ditransmisikan
Diserap
Dipantulkan
Dihamburkan
Apabila sampel tidak
menyerap cahaya,
proses yang terjadi
hanyalah :
- pemantulan
- transmisi (diteruskan)

Instrumentasi
Spektrofotometer UV-Vis

Instrumentasi
Spektrofotometer UV-Vis
Sumber lampu

Monokromator

Optik

Detektor

Penyerapan sinar UV &
Visibel oleh Molekul

Penyerapan oleh transisi
ikatan danSemua
elektron
anti ikatan
molekul
organik mampu

menyerap REM
karena memiliki
elektron valensi
Penyerapan
yang dapat
radiasi UV dan
dieksitasikan ke
Visibel dibatasi
tingkat energi ya ng
oleh sejumlah
Elektron yang lebih tinggi.
gugus
terlibat :
fungsional
elektron sigma,
tertentu
elektron phi,
(kromofor) yang
dan elektron
mengandung

bukan ikatan.
elektron valensi
dengan tingkat
energi eksitasi

electronic molecular orbital energies

TRANSISI

ELEKTRONIK

------------------σ*
------------------π*
------------------n
Diagram tingkat
------------------energi
π elektronik

Transisi sigma – sigma
star

(σ – σ*)
Transisi n – sigma star
(n - σ*)
Transisi n – phi star
(n – π*)
Transisi phi – phi star
(π - π*)

Transisi sigma - sigma star (σ
– σ*)

Transisi non bonding – sigma star
( n – σ* )
Terjadi pada senyawa organik jenuh
yang mengandung atom-atom dengan
elektron bukan ikatan (e
Sinar yang diserap sekitar
Nilai absorbtivitas molar (
Pengaruh pelarut lebih polar akan
menggeser

b
n
e
g
i
d Transisi n –
k
a (n – π*) dan
a
c
a
o
t
n
a
c
n
o
m

k
e
r
n
a
u
s
n
o
g
t
l
k
u
v
a
k
a
p
s

a
i
d
n
p
a
e
l
l

phi star dan phi – phi star
(π - π*)

Transsisi (n – π*) dan (π - π*)

Perbedaan transisi (n – π*)
dan (π - π*)
(n – π*)
(π - π*)
Nilai ε (10 – 100 liter/ Nilai ε (1000 – 10.oo0
cm.mol)
liter/cm.mol)
Biasanya, pelarut
Biasanya, pelarut
polar menyebabkan
polar menyebabkan
pergeseran biru
pergeseran merah
(hypsochromic schif)
(bathocromic shif)
Pengaruh pelarut pada pergeseran n  π*

pelaru
t

air

metan
ol

Λ (nm)

264,5

270

etanol klorofor heksan
m
a
272

277

279

Transisi π - π*
(bathrocromic shift

E
Non polar

polar

E
Transisi n – π*
hipsocromic shift) Non polar

polar

Pengaruh pH terhadap λ
O
C

O
NH

H3C-H2C
C

C

C

N

O

pH
9,2

_
O

C

NH

C

C

C

NH

H3C-H2C

O

PHENOBARBITAL SPECTRUM

O

s
s
C
e
o
e
H
k
k
n
t2
rr,y
m
a
C
o
w
H
n
p
a
3
a
N
b
d
o
=
e
a
r
N
b
g
C
a
g
a
H
s
u
n
3
g
(,i
u
k
-C
s
H
O
y
3
H
k
a
,N
r-O
n
o

Kromofor Organik dan
Auksokrom

Pengaruh konjugasi
terhadap puncak serapan




Ikatan terkonjugasi berupa ikatan
rangkap yang berselang-seling dengan
satu ikatan tunggal.
Elektron-elektron phi mengalami
delokalisasi lanjut sehingga tingkat
energi π* menurun dan
mengurangi
OH O
H OH
karakter anti ikatan
shift.
C H batocromic
2 -C H -C H -C H -C H 2 O H
H 3C

H 3C

N

N

O
NH

N

RIBOFLAFIN

O

n
n
k
s
t
3
ri
d
s
o
n
i
d
m
a
e
4
n
n
f
y
d
4
e
a
d
n
r
a
d
p
5
e
f
n
d
g
e
i
a
d
n
n
a
g
e
a
p

Penyerapan yang elibatkan
elektron d dan f

Penyerapan karena
perpindahan muatan

Contoh :
senyawa
Absorbsiftas
kompleks
molar
sangat
beberapa
besar (ion
anorganik
Kompleks
harus
sepert
memiliki
sifat
kompleks
donor
elektron
Fe(III)SCN,
dan
komponen
Fe(III)-fenolik,
lainnya
sebagai
Fe(II)Kecendrungan
akseptor
fenantrolin.
perpindaan
elektron.
elektron
meningkat

Aspek kualitatif dan kuantitatif
Spektrofotometri UV-Visibel
Data yang diperoleh dari spektra UV-Vis :
λmax, intensitas, efek pH dan pelarut.
 Dalam aspek uantitatif, diukur intensitas
sinar radiasi yang diteruskan setelah
mengenai sampel/cuplikan.


P / Po

%T

A

1
0,1
0,01

100
10
1

0
1
2

Pembatasan dalam Hukum
Lambert-Beer
Sinar yang digunakan dianggap
monokromatis
 Peyerapan terjadi daam volume
yang memiliki penampang luas
yang sama
 Tidak ada senyawa lain yang
menyerap dalam larutan
senyawa
 Tidak terjadi fuoresensi atau
fosforesensi


Hukum Lambert-Beer
Jika sinar monokromatic dilewatkan suatu larutan maka
penurunan insensitas sinar berbanding langsung dengan
insensitas radiasi ( I ), konsentrasi spesies (c), dan
dengan ketebalan lapisan larutan (b).

A=

 P0
log 10 
 P



   logT



=bc

Absorbtivitas molar ()





() merupakan suatu konstanta yang tidak
tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet
dan insensitas radiasi yang mengenai sampel.
() tergantung pada suhu, pelarut, struktur
molekul, dan λ radiasi.
() satuannya M-1cm-1 atau liter/mol. jika
konsentrasi dinyatakan dengan % b/v
(g/100mL) dapat dinyatakan dengan simbol E
1%
1cm

() = (BM/10 ) x E

1%
1cm

Analisis komponen
tunggal




Jika absorbansi suatu
seri larutan diukur
pada λ, suhu, kondisi
pelarut sama, dan A
larutan diplotkan
terhadap
konsentrasinya 
kurva baku.
Penentuan
konsentrasi
komponen tunggal
dapat dilakukan
dengan :
 Menggunakan

Contoh soal
Sebanyak 20 tablet furosemid ditimbang
beratnya 1,656 g. Diambil sampel 519,5
mg digojog dengan 300 mL NaOH 0,1 N ,
lalu diencerkan sampai 500,0 mL dengan
NaOH 0,1 N. Sejumlah ekstrak disaring dan
diambil 5,0 mL lalu diencerkan dengan
NaOH 0,1 N sampai 250,0 mL. Absorbansi
dibaca pada λ 271 nm dengan blanko
NaOH 0,1 N ternyata absorbansinya 0,596.
Jika E 1%1cm furosemid λ271 nm = 580, Hitung
kadar Furosemid tiap tabletnya ?

Analisis dua campuran secara
bersama-sama
Dua buah kromofor yang berbeda akan memiliki
kekuatan absorbsi cahaya yang berbeda pada
suatu λ tertentu, sehingga dengan mengukur
kedua λ akan diperoleh konsentrasi masingmasing komponen campuran.

A1 = a1 b1 c1 dan A2 = a2 b2
c2,
karena tebal kuvet sama maka
A1 = a1 c1 dan A2 = a2 c2
sehingga :
Aλ1 = (a1c1) λ1 + (a2c2) λ1

Contoh soal


Absorbansi obat A dengan konsentrasi
0,0001 M dalam kuvet 1 cm adalah
0,982 pada λ 420 nm, dan sebesar
0,216 pada λ 505 nm. Absorbansi obat B
dengan konsentrasi 0,0002 M adalah
0,362 pada λ 420 nm dan 1,262 pada λ
505. Absorbansi campuran 2 obat
adalah 0,820 pada λ 420 nm, dan 0,908
pada λ 505 nm. Berapakah konsentrasi
masing-masing obat A dan B dalam
campuran tersebut ?

Hal-hal penting dalam pengukuran
spektrofotometri UV-Visibel







Terutama untuk senyawa yang semula tidak
berwarna dan akan diukur dengan
spektrofotometer Visibel  dilakukan
derivatisasi.
Waktu operasional (operating time) untuk
mengetahui waktu pengukuran yang stabil.
Pemilihan panjang gelombang maksimum (λ
max)
Pembuatan kurva baku sebaiknya sering
diperiksa ulang.
Pembacaan absorbansi sampel/cuplikan
sebaiknya dalam rentang 0,2 – 0,8.

Derivatisasi sampel

Syarat pereaksi :
Reaksinya selektif dan sensitif
Reaksinya cepat, kuantitatif, dan
reprodusiel

Operating Time



Ditentukan dengan mengukur hubungan antara
waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.
Pengukuran senyawa harus dilakukan pada saat
waktu operasionalnya.

Gambar operating time

Pemilihan panjang
gelombang (λ)
Panjang
elombang yang
digunakan
adalah λmax.
 Alasan :


 Kepekaan

maksimal
 Hukum
Lambert-Beer
terpenuhi


Pembuatan kurva baku

Pembacaan absorbansi sampel
(0,2 – 0,8)
Absorban yang terbaca hendaknya A =
0,2-0,8 atau %T = 15 % - 70 % agar
kesalahan fotometrik dalam pembacaan
transmitan sebesar 0,005 atau 0,5 %

Kalibrasi instrumen






Kalibrasi skala absorbansi  digunakan
senyawa kalium dikromat.
Kalibrasi skala λ  dengan larutan holmium
perklorat 5 % b/v.
Penentuan daya pisah (resolusi)
spektrofotometer  dikontrol dengan lebar
celah dengan larutan toluen 0,02 % b/v
dalam heksan.
Penentuan adanya sesatan sinar (stray
radiation)  dengan larutan KCl 1,2 % b/v
dalam air pada λ 200 nm, jika A = 2 maka
terjadisesatan sinar.

Latihan Soal


Tolbutamid (BM 270,4) memiliki absorbtivitas molar
703/M.cm, pada λ 262 nm. Jika tablet tunggal
tolbutamid dilarutkan dalam air sampai 250,0 mL,
absorbansinya 0,520 pada λ 262 nm, dan kuvet 1 cm.
Tentukan berat tolbutamid yang terkandung dalam
tablet ersebut !



Absorbansi senyawa murni X dan senyawa Y dengan
konsentrasi masing-masing 5 x 10-5 M sebagai berikut
( X A280 = 0,0510 A350 = 0,192 dan Y A280 = 0,335
A350 = 0,150). Salah satu larutan dari keduanya
dengan konsentrasi yang belum diketahui mempunyai
A280 = 0,395 dan A350 = 0,147. Senyawa manakah (X
atau Y) yang tidak diketahui ? Hitung konsentrasi
senyawa yang tidak diketahui tersebut !

HATUR NUHUN
PISAN ......

Jangan lupa
untuk
membaca
literatur
lainnya baik
dari buku
maupun
internet
serta banyak
latihan
soal ...