TAPPDF.COM PDF DOWNLOAD PENGEMBANGAN TEKNIK ELISA UNTUK MENDETEKSI TOKSIN ALFA ...
PENGEMBANGAN TEKNI K ELI SA UNTUK MENDETEKSI
TOKSI N ALFA CLOSTRI DI UMNOVYI
LI LY NATALI A
Bal ai Penel i t i an Yet er i ner
Jal an R. E. Mar t adi nat a 30, P. O. Box 151, Bogor 16114, I ndonesi a
( Di t er i ma dewan r edaksi
6 Januar i 1997)
ABSTRACT
NATALI A, L . 1997 . Devel opment of
ELI SA t echni que f or det ect i ng Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n . Jur nal I l mu Ter nak dan Yet er i ner 2 ( 3) :
188- 193 .
An enzyme- l i nked i mmunosor bent assay ( ELI SA) t echni que was devel oped t o det ect speci f i c Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n i n t he
i nvest i gat i on of i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Modi f i cat i on of t he i ndi r ect ELI SA t echni que i n t he syst em used i s an i nhi bi t i on ELI SA f or
ant i gen . The t est sampl es wer e l i ver f l ui d f r om dead ani mal s suspect ed f r om i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . To anal yse f or al pha t oxi n,
mi cr ot i t er pl at es wer e coat ed wi t h ant i gen or al pha t oxi n . The l i ver f l ui d sampl e t hought t o cont ai n ant i gen or t oxi n was t hen mi xed t oget her
wi t h r ef er ence ant i ser umcont ai ni ng speci f i c al pha ant i t oxi n of Cl . novyi . Enzyme l abel l ed ant i gl obul i n was t hen added, f ol l owed by enzyme
subst r at e . The di f f er ence i n col our change bet ween a r ef er ence sampl e cont ai ni ng no ant i gen or t oxi n and t he t est sampl e sol ut i on i ndi cat es t he
amount of ant i gen or t oxi n i n t he t est sampl es . Thi s i s a compet i t i ve assay; hi gh t oxi n concent r at i ons r esul t i n l ess col our at t he end of t he t est .
The sandwi ch ELI SA t echni que was sensi t i ve enough t o det ect as l i t t l e as 390 ng/ ml t oxi n i n l i ver f l ui d sampl e. These r esul t s i ndi cat e t hat t he
ELI SA t echni que i s usef ul f or det ect i ng al pha t oxi n of Cl . novyi and f or di agnosi ng i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s .
Keywor ds : ELI SA t echni que, Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n, i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s
ABSTRAK
NATALI A, L. 1997 . Pengembangan t ekni k ELI SA unt uk mendet eksi t oksi n al f a Cl ost r i di um novyi .
Jur nal I l mu Ter nak dan Pet er i ner 2 ( 3) :
188- 193 .
- Tekni k enzyme- l i nked i mmunosor bent assay ( ELI SA) t el ah di kembangkan unt uk mendet eksi dan mengukur j uml ah t oksi n al f a yang
spesi f i k dar i Cl ost r i di um novyi unt uk penyi di kan i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Si st emi ni adal ah modi f i kasi dar i t ekni k ELI SA t i dak l angsung
yang mer upakan t ekni k i nhi bi si ELI SA unt uk mendet eksi ant i gen. Sampel yang di uj i adal ah cai r an hat i dar i hewan yang di cur i gai mat i kar ena
i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Unt uk mendet eksi t oksi n al f a, l empeng mi kr ot i t er di l api si dengan ant i gen at au t oksi n al f a. Sampel cai r an hat i
yang di per ki r akan mengandung ant i gen at au t oksi n kemudi an di campur dengan ant i ser um r ef er en yang mengandung ant i t oksi n spesi f i k
t er hadap Cl . novyi . Ant i gl obul i n yang t el ah di l abel dengan enzi m kemudi an di t ambahkan, di i kut i dengan subst r at enzi m. Per bedaan wama
ant ar a sampel r ef er en yang t i dak ber i si ant i gen at au t oksi n dan sampel yang di uj i menunj ukkan j uml ah ant i gen at au t oksi n di dal am sampel
yang di uj i . Dal amt ekni k kompet i t i f i ni , konsent r asi t oksi n yang f nggi akan meni mbui kan ber kur angnya wama pada akhi r uj i . Tekni k ELI SA
i ni cukup sensi t i f unt uk mendet eksi 390 ng/ ml t oksi n dal amsampel cai r an hat i . Hasi l i ni menunj ukkan bahwa t ekni k ELI SA ber guna unt uk
mendet eksi t oksi n al f a dar i Cl ost r i di um novyi dan unt uk mendi agnosi s i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s .
Kat z kuncl : Tekni k ELI SA, t oksi n al f a Cl ost r i di um novyi , i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s
PENDAHULUAN
Cl ost r i di um novyi t el ah di kenal sebagai mi kr oor gani sme pat ogeni k bagi t emak r umi nansi a . Penyaki t nya di kenal dengan nama i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s
at au bl ack di sease, yai t u penyaki t yang ber si f at akut
dan t oksemi k pada sapi , domba, babi dan kuda aki bat
adanya pr oduksi t oksi n al f a Cl . novyi t i pe B pada
j ar i ngan hat i yang nekr ot i k dan anoksi k ( BATTY et al . ,
1964 ; BAGADI , 1974) . Spor a dar i Cl . novyi yang
ber si f at t oksi geni k t el ah di ket ahui
dapat di t emukan
dal am hat i hewan yang nampak sehat ( BAGADI , 1974 ;
W
ORRALL et al . , 1987 ; WORRALL, 1988) . Pada Tmak
r umi nansi a, penyaki t i ni umumnya di mul ai dengan
t er j adi nya ker usakan hat i ol eh ber bagai sebab . Dal am
banyak kasus, penyebab ker usakan hat i yang ut ama
adal ah caci ng hat i ( J AMI ESON et al . , 1948 ; JAMI ESON,
1949) . Par asi t i ni ber mi gr asi dal am hat i dan meni m-
188
bul kan nekr osi s, yai t u suat u l i ngkungan yang sesuai dan
bai k unt uk per t umbuhan dan pr ol i f er asi Cl . novyi .
Toksi n al f a yang di hasi l kan kemudi an akan di absor psi
dengan cepat dan dal am beber apa j am hewan akan
mat i ( BAGADI , 1974 ; SMI TH, 1975 ; STERNE, 1981 ;
WORRALL, 1988) .
Penyaki t i ni di I ndonesi a sangat mungki n t er j adi
t anpa dapat di di agnosi s kar ena kej adi annya begi t u cepat
dan hewan mat i mendadak t anpa gej al a kl i ni s dan
kel ai nan pat ol ogi k yang nyat a. Dal ampenel i t i an yang
t el ah di l akukan di Pul au Jawa, t er nyat a 14% hewan
kambi ng- domba dan 20% hewan sapi - ker bau yang
nampak sehat mengandung spor a Cl . novyi t i pe A
dal am hat i nya ( WORRALL et al . , 1987 ; WORRALL,
1988) . Toksi n yang di hasi l kan ol eh gal ur yang t el ah
di i sol asi ber ki sar dar i 10 sampai 10 . 000 mi ni mum l et hal
doses ( MLD) menci t per ml . Penel i t i an ber i kut nya
menunj ukkan bahwa ker bau mempunyai t i t er ant i bodi
Jur nal I l mu Ter nak dan Vet er i ner Vol . 1 No. 3 Th . 1997
t er t i nggi t er hadap t oksi n al f a Cl . novyi di bandi ngkan
dengan pada ber bagai bangsa sapi yang ada di Pul au
Jawa ( NATALI A et al . , 1988) .
Toksi n al f a t er ut ama di hasi l kan ol eh Cl . novyi t i pe
A ( penyebab bi g head pada domba dan gas gangr en
pada manusi a) dan Cl . novyi t i pe B ( penyebab
i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s pada hewan r umi nansi a)
( STERNE, 1981) . Toksi n i ni bi asanya di i dent i f i kasi dar i
cai r an at au ekst r ak dar i t empat t er j adi nya l esi o . Car a
konvensi onal yang bi asa di l akukan unt uk mendet eksi
t oksi n al f a i ni adal ah dengan mel i hat r eaksi nekr ot i k
dar i t oksi n al f a pada penyunt i kan secar a i nt r a der mal
pada mar mot dan r eaksi penghambat an ol eh ant i ser umnya ( SMI TH, 1975) . Sel ai n i t u, kar ena t oksi n al f a i ni
ber si f at l et hal , maka t oksi nnya j uga dapat membunuh
menci t dan di hambat j i ka di ber i ant i ser um at au
ant i t oksi n yang spesi f i k . Uj i i ni di anggap t i dak pr akf s,
kar ena kur ang sensi t i f , memakan wakt u yang f dak
sedi ki t dan menggunakan banyak hewan per cobaan .
Ol eh sebab i t u, per l u di usahakan suat u uj i yang l ebi h
seder hana, cepat dan t epat seper t i t ekni k ELI SA yang
dapat menggant i kan uj i konvensi onal t er sebut .
ELI SA mer upakan t ekni k di agnosi s yang pr akt i s,
t epat , ber si f at masal dan t el ah di kembangkan dengan
bai k unt uk mendi agnosi s ber bagai mac am penyaki t
t er masuk penyaki t yang di sebabkan ol eh t oksi n
Cl ost r i di um ( VOLLER et al . , 1979 ; MARTI N et al . , 1988 ;
I DRI SSI dan W
ARD, 1992) . Dal am penel i t i an i ni , t ekni k
ELI SA yang di kembangkan di har apkan akan dapat
mengat asi kesul i t an dal am mendi agnosi s i nf ect i ous
necr ot i c hepat i t i s at au bl ack di sease .
MATERI DANMETODE
Unt uk mengembangkan t ekni k ELI SA guna mendet eksi t oksi n al f a dar i Cl . novyi di buat t ahapan
penger j aan sebagai ber i kut :
Pembuat an t oksi n
Unt uk mempr oduksi t oksi n al f a Cl . novyi , di buat
t er l ebi h dahul u st ar t er dar i bi akan Cl . novyi t i pe A
( gal ur CN 4270, Bur r oughs Wel l come, UK) dal am
medi um Rober t son' s cooked meat medi um ( RCMM) .
Set el ah st ar t er t umbuh dengan bai k sel ama 1 har i ,
pembuat an t oksi n di l akukan dal amj uml ah 1 l i t er dal am
medi umyang ber i si pept on 3, 0%, Na t HPO, 0, 5% dan
gl ukosa 1, 0% ( NATALI A et al . , 1988) . Pada awal per t umbuhan pH medi um adal ah 7, 8 dan sel ama t oksi n
di pr oduksi , pH bi akan di usahakan sel al u ber ada di
seki t ar 7, 0 .
Toksi n sel esai di buat dal am wakt u 3 har i dal am
t abung anaer obi k . Set el ah i t u, di t ambah 0, 01% mer t i ol at unt uk menghent i kan per t umbuhan . Toksi n yang
masi h ber campur dengan medi um i ni di sent r i f i gasi
pada 7 . 000 x g sel ama 20 meni t pada suhu 4 ° C.
Super nat an yang mengandung t oksi n kemudi an di uj i
kekuat annya dengan menggunakan menci t . Ter nyat a
t oksi n yang di hasi l kan mempunyai kekuat an 10 . 000
MLD menci t / ml .
Pemur ni an t oksi n
Pr osedur pemur ni an t oksi n pada umumnya mengi kut i met ode WORRALL ( 1988) . Toksi n mul a- mul a
di mur ni kan dengan mengendapkannya, yai t u dengan
menggunakan 50% w/ v pol yet hyl ene gl ycol ( PEG)
6 . 000 sehi ngga konsent r asi akhi r nya adal ah 30%.
Lar ut an i ni di si mpan di dal am l emar i pendi ngi n sel ama
18 j am dan di sent r i f ugasi pada 10 . 000 x g sel ama 25
meni t .
Endapan yang t er j adi kemudi an di l ar ut kan
kembal i dal am 50 ml l ar ut an phosphat e buf f er ed sal i ne
( PBS) pH 7, 5 . Ter hadap sat u vol ume l ar ut an i ni
di t ambahkan dua vol ume l ar ut an amoni um sul f at j enuh,
0, 001M EDTA, 0, 2M TRI S HCl pH 8, 0 . Endapan
t oksi n yang t er j adi di pi sahkan dan di l ar ut kan kembal i
dal am 70 ml l ar ut an PBS pH 7, 5 .
Toksi n kemudi an di mur ni kan l ebi h l anj ut dengan
menggunakan kol om kr omat ogr af i DEAF sephacel l
( Phar maci a) . Sel anj ut nya di konsent r asi kan sebanyak
10 kal i dengan menggunakan kant ong di al i si s yang
di t abur kan PEG 20 . 000 .
Pada t ahap ber i kut nya, t oksi n di ker i ngbekukan,
di t i mbang bobot nya dan konsent r asi t oksi n di j adi kan
20 mg/ ml dengan pel ar ut PBS pH 7, 5 . Toksi n i ni
akhi r nya di ker i ngbekukan sehi ngga set i ap ampul ber i si
1, 0 mg t oksi n. Pada uj i ELI SA, 1, 0 mg t oksi n i ni akan
di l ar ut kan dal am 100 ml l ar ut an penyangga kar bonat
( coat i ng buf f er ) sehi ngga konsent r asi nya 10 hg/ ml .
Pembuat an ant i t oksi n pada sapi
Hi per i muni sasi pada sapi
di l akukan dengan
menyunt i kkan t oksoi d dan t oksi n al f a Cl . novyi t i pe A
dal am dosi s ber t i ngkat pada j adwal wakt u t er t ent u .
Toksi n yang t el ah di mur ni kan seper t i t er sebut di at as
di buat menj adi t oksoi d dengan penambahan 0, 6% f or mal i n dan di si mpan pada suhu 37° C sel ama semal am.
Uj i keamanan ( saf et y t est ) t er hadap t oksoi d i ni kemudi an di l akukan pada menci t . Sej uml ah 0, 5 ml t oksoi d
har us t i dak membunuh menci t seber at 18- 20 gr am.
Hi per i muni sasi pada sapi di l akukan sebagai
ber i kut :
Pada har i ke- 0 dan ke- 28, sapi mendapat sunt i kan
2 ml t oksoi d yang di campur dengan Fr eund' s compl et e
adj uvant ( FCA) dal am per bandi ngan 1 : 1 . Sunt i kan
di l akukan secar a subkut an di daer ah l eher .
Pada har i ke- 40, - 42, - 44, dan - 67, hewan mendapat sunt i kan t oksi n secar a subkut an, masi ng- masi ng
5, 0 ml , 7, 5 ml , 10, 0 ml dan 10, 0 ml .
Pada har i ke- 73, hewan di ambi l dar ahnya dan
ser umnya di pi sahkan . Ser um i ni kemudi an di ukur
pot ensi nya dengan- uj i L+ pada menci t ( BRI TI SH
PHARMACOPOEI A,
1977) , dengan menggunakan ant i t oksi n st andar i nt er nasi onal .
189
LI LT NATALI A :
Pengembangan Tekni k ELI SA unt uk Mendet eksi Toksi n
Konj ugat
Konj ugat yang di gunakan adal ah I gG ant i sapi
yang t el ah di l abel dengan hor se r addi sh per oxi dase
( Si l enus) . Dal am pemakai annya konj ugat di encer kan
1/ 3 . 500 dengan l ar ut an PBST ( l ar ut an PBS pH 7, 5 yang
di t ambahkan 0, 05%Tween- 20) .
Pr osedur t ekni k ELI SA
Pada dasar nya, penger j aan t ekni k ELI SA yang
di l akukan adal ah mengi kut i met ode VOLLER et al .
( 1979) yang di modi f i kasi sehi ngga dapat di gunakan
unt uk mendet eksi t oksi n . Lempeng mi kr o ELI SA
dengan 96 l ubang mul a- mul a di l api si dengan ant i gen
at au t oksi n al f a sebanyak 100 gl at au 1, 0 pg per l ubang
( konsent r asi l ar ut an ant i gen : 10 gg t oksi n/ ml dal am
l ar ut an penyangga kar bonat pH 9, 6) . Lempeng mi kr o
i ni kemudi an di i nkubasi semal am pada suhu 4° C.
Set el ah i t u di l akukan pencuci an sebanyak 3 kal i dengan
menggunakan PBS pH 7, 5 yang di t ambahkan 0, 05%
Tween- 20 .
Sampel cai r an hat i yang di duga mengandung
t oksi n dal am encer an 1/ 100 di campur ant i ser um/ ant i t oksi n ber kekuat an 4, 0 LU. dal am encer an 1/ 100,
dengan per bandi ngan 1 : 1 . Campur an i ni di bi ar kan
sel ama 30 meni t pada suhu r uangan. Sel anj ut nya 100
pl Campur an i ni kemudi an di masukkan ke dal am set i ap
l ubang dal am l empeng mi kr o . Sebagai pembandi ng
at au kont r ol negat i f ( t i dak mengandung t oksi n) , di gunakan Campur an ant i t oksi n t anpa penambahan t oksi n.
Sebagai pel ar ut ant i t oksi n di gunakan l ar ut an penyangga
Tr i s EDTA NaCl pH 9, 6 yang di t ambah 0, 05% Tween
20 dan 0, 04%kasei n ( TTC) . I nkubasi di l akukan sel ama
1 j am pada suhu r uangan. Pencuci an kembal i di l akukan
dengan PBST sebanyak 3 kal i .
Konj ugat ant i I gG sapi di t ambahkan dal am
encer an 1/ 3 . 500 dal am PBST sebanyak 100 pd per
l ubang . Lempeng mi kr o kemudi an di i nkubasi sel ama
sat u j am dal am suhu r uangan . Pencuci an di l akukan
sebanyak 3 kal i dengan menggunakan PBST. Set el ah
i t u di masukkan subst r at sebanyak 100 pl , yai t u 2, 2azi no- bi s
( 3et hyl
benzt hi azol i ne- 6- sul f oni c
aci d)
( ABTS) dal am penyangga si t r at ber - pH 4, 2 . I nkubasi
pada suhu r uangan kembal i di l akukan sel ama sat u j am.
Hasi l nya di baca dengan menggunakan ELI SA pl at e
r eader ( Ti t er t ek MCC 340, Fl ow Labor at or i es, USA)
dengan panj ang gel ombang 415 nm. Pads set i ap
l empeng mi kr o akan t er dapat kont r ol negat i f , yai t u
sebagai pembandi ng bagi sampel yang di uj i .
Akan t er l i hat per bedaan yang nyat a ant ar a sampel
yang mengandung t oksi n/ ant i gen dan kont r ol yang
t i dak mengandung ant i gen . Besar nya per bedaan ni l ai
densi t as opt i kal at au war ns i ni menunj ukkan j uml ah
t oksi n al f a at au ant i gen dal am sampel yang di uj i
( Gambar 1) . Uj i i ni ber si f at kompet i t i f , konsent r asi
ant i gen yang maki n t i nggi dal am sampel akan meng-
19 0
aki bat kan ni l ai densi t as opt i kal at au war ns yang maki n
ber kur ang .
St andar di sasi dan eval uasi t ekni k ELI SA
Unt uk mendapat kan encer an ant i gen pel api s yang
opt i mal t er hadap ser um posi t i f ( ant i t oksi n r ef er en) ,
mul a- mul a di l akukan t i t r asi dengan si st em checker
boar d. Sampel yang di gunakan ber upa cai r an hat i yang
di buat dengan car a sebagai ber i kut :
Pot ongan hat i ( ki r a- ki r a 1 cm' ) yang t el ah di t ambah 2, 0 ml PBS pH 7, 2 di hancur kan dengan menggunakan st omacher . Sent r i f ugasi kemudi an di l akukan
pada 5 . 000 x g sel ama 5 meni t unt uk memi sahkan
cai r an dan endapannya. Super nat an t er sebut kemudi an
akan di gunakan sebagai sampel yang di uj i dengan
t ekni k ELI SA.
Dar i r umah pot ong hewan, sebanyak 44 sampel
hat i dar i 44 ekor hewan sapi dan ker bau yang nampak
sehat akan di uj i kadar kandungan t oksi nnya . Hasi l uj i
i ni kemudi an akan di gunakan sebagai bat as ni l ai ELI SA
yang negat i f .
Unt uk menget ahui
kepekaan t ekni k ELI SA,
di l akukan uj i t er hadap sampel ber upa cai r an hat i yang
mengandung ber bagai konsent r asi t oksi n . Unt uk i t u,
sampel hat i sapi dar i hewan sehat di r umah pot ong
hewan yang t el ah di ket ahui negat i f at au t i dak mengandung t oksi n al f a di ber i per l akuan dengan penambahan
ber bagai konsent r asi t oksi n . Unt uk penambahan t oksi n
dal amcai r an hat i , t oksi n di encer kan secar a ser i dengan
kel i pat an dua, yai t u dar i 100 . 000 ng/ ml sampai 48, 75
ng/ ml . Dar i hasi l yang di dapat akan t er l i hat kepekaan
uj i ELI SA unt uk mendet eksi t oksi n yang t er kandung
dal amsampel cai r an hat i .
HASI L DAN PEMBAHASAN
Tekni k ELI SA t el ah di gunakan Unt uk mendet eksi
t oksi n Cl . novyi t i pe B dengan menggunakan 3
ant i ser um pol i kl onal ( SCHRANER et al . , 1992) . Tekni k
ELI SA unt uk mendet eksi ber bagai t oksi n dar i Cl . per f r i ngens, Cl . bot ul i num pada umumnya j uga t el ah di kembangkan dengan menggunakan ant i bodi yang
mur ni dan spesi f i k ( WI MSATT et al . , 1986 ; SOYKA et
al . , 1989 ; LYERLY dan WI LKI NS, 1991 ; THOMAS, 1991 ;
I DRI SSI dan W
ARD,
1992 ; GREGORY et al . , 1996) .
Met ode pengembangan t ekni k ELI SA t er sebut pada
umumnya menggunakan ant i ser um yang t el ah di mur ni kan unt uk dapat di gunakan sebagai ant i gen pel api s at au
pembuat an konj ugat yang spesi f i k .
Tekni k ELI SA yang di kembangkan dal am penel i t i an i ni adal ah modi f i kasi dar i met ode VOLLER et al .
( 1979) , yai t u met ode t i dak l angsung dan kompet i t i f .
Car a i ni dapat di gunakan dengan pemakai an ant i gen
at au t oksi n yang t el ah di mur ni kan t anpa har us menggunakan ant i bodi yang mur ni dan spesi f i k. Dal am uj i
i ni di ni l ai besar nya sel i si h ni l ai densi t as opt i kal ant ar a
Jur nal I l mu Ter nak dan Vet er i ner Vol . 2 No . 3 Th . 1997
Lempeng mi kr o di l api si ant i gen
at au t oksi n al f a C1. novyi
Lempeng mi kr o di cuci
Sampel yang di duga mengandung
ant i gen di campur dengan ant i bodi
at au ant i t oksi n r ef er en
Lempeng mi kr o di cuci
3.
Konj ugat enzi m ant i gl obul i n
di t ambahkan
Lempeng mi kr o
4.
di cuci
Subst r at enzi m di t ambahkan
0
0
0
Adanya degr adasi subst r at menunj ukkan
sampel ( 2) t i dak mengandung ant i gen
Gambar l .
O
0
0
0
0
0
0
O
0
Ti dak ada degr adasi subst r at menunj ukkan
sampel ( 2) mengandung ant i gen
Modi f i kasi met ode VOLLER et al . ( 1, 979) : t ekni k ELI SA t i dak l angsung unt uk mendet eksi ant i gen
sampel yang mengandung t oksi n al f a Cl . novyi dan
kont r ol yang t i dak mengandung t oksi n . Konsent r asi
ant i gen at au t oksi n yang maki n t i nggi dal am sampel
akan mengaki bat kan ni l ai densi t as opt i kal at au wama
yang maki n ber kur ang .
Pada uj i ELI SA i ni , sampel yang di j adi kan bahan
pemer i ksaan adal ah cai r an hat i hewan yang di duga mat i
kar ena i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Dal am kasus
penyaki t i ni , or gan hat i mer upakan t empat ut ama bagi
Cl . novyi unt uk t umbuh, ber pr ol i f er asi dan menghasi l kan t oksi n ( SMI TH, 1975) .
Dar i hasi l t i t r asi pendahul uan di dapat kan bahwa
ant i gen pel api s yang di per l ukan adal ah 1 Lt g/ l ubang
at au dal am konsent r asi 10 l t g/ ml , sedangkan ant i ser um
st andar yang di gunakan adal ah 4 LU. / ml , yang dal am
pemakai annya di encer kan 1/ 100 dal aml ar ut an TTC.
Dal am peni l ai an hasi l ELI SA yang ber si f at kompet i t i f i ni , di ni l ai besar nya penghambat an t oksi n al f a Cl .
novyi t er hadap ser um r ef er en at au di hi t ung besar nya
sel i si h ni l ai densi t as opt i kal ant ar a sampel yang di uj i
dan kont r ol negat i f yang t i dak mengandung t oksi n .
Maki n besar sel i si h densi t as opt i kal akan maki n besar
pul a kandungan t oksi n di dal amsampel .
Unt uk menget ahui bat asan ni l ai ELI SA negat i f ,
j uga t el ah di l akukan uj i ELI SA t er hadap cai r an at au
ekst r ak hat i sapi dan ker bau yang sehat . Ter nyat a dar i
44 sampel cai r an hat i yang di uj i mempunyai
ni l ai
densi t as opt i kal sebesar 1, 050 ± 0, 052 . Dal am eval uasi
uj i ELI SA yang di kembangkan, t el ah di coba mendet eksi ber bagai konsent r asi t oksi n yang di l ar ut kan
dal am cai r an hat i dar i sapi yang sehat . Hasi l nya dapat
di l i hat pada Gambar 2 . Pada gambar i ni dapat di l i hat
adanya per pot ongan ant ar a gar i s cai r an hat i t anpa
t oksi n dan gar i s cai r an hat i yang mengandung t oksi n .
Jadi , di seki t ar t i t ' i k pot ong i ni ada at au t i dak adanya
t oksi n dal am sampel cai r an hat i t i dak dapat di bedakan .
LI LT NATALI A :
Pengembangan Tekni k ELI SA unt uk Mendet eksi Toksi n
Sesudah t i t i k pot ong i ni , maki n besar kadar t oksi n
dal am sampel akan menunj ukkan ni l ai densi t as opt i kal
yang semaki n r endah, at au akan maki n besar sel i si h
ni l ai densi t as opt i kal ant ar a sampel yang mengandung
t oksi n dan sampel t anpa t oksi n.
1 .2
menggunakan wakt u yang l ebi h l ama, namun hasi l
ELI SA l ebi h spesi f i k dan l ebi h konsi st en pada uj i
ul angan . RPLA l ebi h sensi t i f dar i pada ELI SA, t et api
memper l i hat kan beber apa r eaksi nonspesi f i k . Dar i
ket i ga uj i i ni , ver ocel l assay yang t er endah sensi t i vi t asnya dan t i dak sel al u konsi st en pada uj i ul angan
kar ena adanya r eaksi si t ot oksi k nonspesi f i k dan r eaksi
si t ot oni k ( BERRY et al . , 1988) . Met ode l ai n yang seder hana dan yang sel ama i ni masi h di gunakan adal ah uj i
bi ol ogi s menggunakan menci t , uj i hemol i si s dan uj i
hemagl ut i nasi ( LYERLY dan WI LKI NS, 1991) . Uj i i ni
di pandang kur ang sensi t i f di bandi ngkan dengan t ekni k
ELI SA.
Sebagai kesi mpul an dapat di nyat akan bahwa
t ekni k ELI SA kompet i t i f yang di kembangkan i ni dapat
di gunakan sebagai penggant i uj i bi ol ogi s yang meng
gunakan menci t , kar ena l ebi h pr akt i s, seder hana dan
l ebi h sensi t i f .
DAFTARPUSTAKA
Toksi n ( ni l / ml )
Gambar 2.
Ti ngkat densi t as opt i kal t ekni k ELI SA dar i
sampel cai r an hat i dengan dan t anpa t ambahan
t oksi n Cl . novyi
Hasi l ELI SA unt uk mendet eksi al f a t oksi n dapat
di coba unt uk di bandi ngkan dengan uj i konvensi onal ,
yai t u uj i t oksi si t as pada menci t . Hasi l yang posi t i f pada
uj i t oksi si t as t oksi n al f a pada menci t di t unj ukkan
dengan adanya kemat i an. Jadi , dal am penel i t i an i ni ,
t oksi n yang di gunakan dal am t ekni k ELI SA di ukur
kemampuannya unt uk membunuh menci t . Dal am uj i
i ni , 1 mg t oksi n yang ker i ng beku mempunyai 150
MLD menci t at au t oksi n i ni dapat membunuh menci t
dal am j uml ah 6, 66 l l g, sedangkan sampel yang
mengandung t oksi n dal am j uml ah l ebi h keci l dar i 6, 66
pg member i hasi l negat i f at au t i dak dapat membunuh
menci t .
Bat asan kepekaan ELI SA dapat di t ent ukan ber dasar kan mean sampel negat i f di t ambah 2 st andar
devi asi ( TuSSEN, 1985) . Kar ena t ekni k ELI SA yang
di kembangkan i ni ber si f at kompet i t i f dan maki n t i nggi
j uml ah t oksi n dal am sampel akan maki n r endah ni l ai
densi t as opt i kal nya, maka bat asan t oksi n yang dapat
di det eksi adal ah mean sampel negat i f di kur angi 2
st andar devi asi . Jadi , bat as pembedaan ant ar a ELI SA
posi t i f dan negat i f adal ah ni l ai densi t as opt i kal 0, 946
at au sampel dengan kandungan t oksi n mendekat i 390
ng/ ml at au 0, 39 pg/ ml ( Gambar 2) . Dengan demi ki an,
t ekni k ELI SA dapat mendet eksi t oksi n dal am j uml ah
yang l ebi h r endah di bandi ngkan dengan uj i konvensi gnal dengan menggunakan menci t .
Di bandi ngkan dengan met ode l ai n unt uk mendet eksi t oksi n kl ost r i di a seper t i r ever sed passi ve l at ex
aggl ut i nat i on ( RPLA) dan ver ocel l assays ( mengukur
ef ek si t ot oksi si t as dar i t oksi n) , meski pun t ekni k ELI SA
19 2
H. O. 1974 . I nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s ( bl ack
di sease) of sheep . Vet . Bul l . 44 : 385- 388 .
BAGADI ,
BATTY,
I .,
D.
BUNTAI N,
and
P. W. WALKER.
1964 .
Cl ost r i di um oedemat i ens: a cause of sudden deat h i n
sheep, cat t l e and pi gs. Vet . Rec. 76 : 1115- 1116 .
J . C. RODHOUSE,
S.
HUGHES,
B. A.
and R. J. GI LBERT. 1988 . Labor at or
y
t echni ques . Eval uat i on of ELI SA, RPLA and Ver o cel l
assays f or det ect i ng Cl ost r i di um per f r i ngens ent er ot oxi n
i n f aecal speci mens . J. Cl i n . Pat hol . 41 : 458- 461 .
BERRY,
P.
R. ,
BARTHOLOMEW,
Appendi x XI V b . Br i t i sh
Publ i shed
on
t he
r ecommendat i on of t he Medi ci nes Commi si on. Her
Maj est y' s St at i oner y Of f i ce . London .
BRI TI SH PHARMACOPOEI A 1977 .
Phar macopoei a
( Vet er i nar y) .
GREGORY, A. R. , T. M. ELLI S, T . F . JUBB, R.
D. V. COUSI NS. 1996 . Us e of enzyme- l
J. NI CKELS, and
i nked i mmunoassays f or ant i body t o t ypes C and D bot ul i num t oxi ns f or
i nvest i gat i ons of bot ul i sms i n cat t l e . Aust . Vet . J. 7 3
( 2) : 55- 61 .
A. H. E. and G. E. WARD. 1992 . Devel opment of
doubl e sandwi ch ELI SA f or Cl ost r i di umper f r i ngens bet a
and epsi l on t oxi ns . Yet . Mi cr obi ol . 31 : 89- 99 .
I DRI SSI ,
J . J . THOMPSON, and J. G. BROTHERSTON. 1948 .
St udi es i n bl ack di sease . The occur ence of t he di sease i n
sheep i n nor t h of Scot l and. Yet . Rec. 60 : 11- 14 .
JAMI ESON, S. ,
S.
1949 . The i dent i f i cat i on of Cl ost r i di um
oedemat i ens and an exper i ment al i nvest i gat i on of i t s r ol e
JAMI ESON,
i n t he pat hogenesi s of i nf ect i on necr ot i c hepat i t i s ( bl ack
di sease) of sheep . J. Pat h . Bact . 61 : 389- 402.
D. M. and T. D. WI LKI NS . 1991 . Toxi n s of
anaer obes . I n : Anaer obi c Mi cr obi ol ogy . The Pr act i cal
Appr oach Ser i es . I RL Pr ess . Oxf or d Uni ver si t y Pr ess,
Oxf or d : 163 - 181 .
LYERLY,
P. K. , R. D. NAYLOR, and R. T . SHARPE. 1988 .
Det ect i on of Cl ost r i di um per f r i ngens epsi l on t oxi n by
MARTI N,
Jur nal I l mu Ter nak dan Vet er i ner Vol . 2 No. 3 Th. 1997
enzyme- l i nked
44 : 270- 271 .
i mmunosor bent
assay.
Res.
Vet .
Sci .
THOMAS, R.J . 1991 . Det ect i on of Cl ost r i di um bot ul i num t ypes
C and Dt oxi n by ELI SA. Am. Vet . J. 68 ( 3) : 111- 113 .
NATALI A, L. ,
E. EMORRALL, and . M
. SYAFARUDI N.
1988 . Ant i bodi es t o Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n i n
i mpor t ed cat t l e and buf f al o i n Java. Pr oceedi ngs of t he
6t h Congr ess of FAVA, Oct . 16- 19, 1988 . Denpasar , Bal i ,
I ndonesi a: 429- 434 .
Ti i ssEN, P. 1985 . Pr act i ce and Theor y of Enzyme I mmuno
Assays . El sevi er , Amst er dam. pp . 385- 421 .
SCHRANER,
L,
M. H. KALTNER, and H. LOSCH. 1992 .
I sol at i on of i mmunogeni c and l et hal pept i des of al phat oxi n f r om Cl ost r i di um novyi t ype B. Toxi con- Oxf or d. 30
( 5/ 6) : 653- 668 .
SMI TH, L. D. S. 1975 . The Pat hogeni c Anaer obi c Bact er i a.
2nd Ed . Char l es C. Thomas Publ i sher . Spr i ngf i el d,
I l l i noi s, U. S. A.
SOYKA, M.G., V. J. WHI TE, C. J . THORNS, and P. L. RoEDER.
1989 . The det ect i on of Cl ost r i di um per f r i ngens epsi l on
ant i t oxi n i n r abbi t ser um by monocl onal ant i body based
compet i t i on ELI SA. J. Bi ol . St andar di zat i on 17 : 117- 124 .
STERNE, M. 1981 . Cl ost r i di al i nf ect i ons . Br i t . Vet . J. 137: 434454.
VOLLER, A. , D. E. BI DWELL, and A. BARTLETT . 1979 . The
Enzyme- l i nked I mmunosor bent Assay. Dynat ech Lab . I nc .
900 Sl at er s Lane, Al exandr i a, Vi r gi ni a 22314 .
WI MSATT, J. C. , S. M. HARMoN, and D. B. SHAH. 1986 .
Det ect i on of Cl ost r i di um per f r i ngens ent er ot oxi n i n st ool
speci mens and cul t ur e super nat ant s by enzyme- l i nked
i mmunosor bent assay . Di agn. Mi cr obi ol . I nf ect . Di s.
4: 307- 313 .
WORRALL,
E. E. , G. MoEKTi , and D. A. LUBI S. 1987.
Cl ost r i di um novyi i sol at ed f r om t he l i ver s of heal t hy
sheep and goat s i n Java. Penyaki t Hewan 19( 13) : 14- 16 .
WORRALL, E. E. 1988 . Assi gnment Ter mi nat i on Repor t .
Br i t i sh I ndonesi an Techni cal Cooper at i on Pr oj ect . ATA
244. Phase 3 . RI VS, Bogor , West Java, I ndonesi a.
TOKSI N ALFA CLOSTRI DI UMNOVYI
LI LY NATALI A
Bal ai Penel i t i an Yet er i ner
Jal an R. E. Mar t adi nat a 30, P. O. Box 151, Bogor 16114, I ndonesi a
( Di t er i ma dewan r edaksi
6 Januar i 1997)
ABSTRACT
NATALI A, L . 1997 . Devel opment of
ELI SA t echni que f or det ect i ng Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n . Jur nal I l mu Ter nak dan Yet er i ner 2 ( 3) :
188- 193 .
An enzyme- l i nked i mmunosor bent assay ( ELI SA) t echni que was devel oped t o det ect speci f i c Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n i n t he
i nvest i gat i on of i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Modi f i cat i on of t he i ndi r ect ELI SA t echni que i n t he syst em used i s an i nhi bi t i on ELI SA f or
ant i gen . The t est sampl es wer e l i ver f l ui d f r om dead ani mal s suspect ed f r om i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . To anal yse f or al pha t oxi n,
mi cr ot i t er pl at es wer e coat ed wi t h ant i gen or al pha t oxi n . The l i ver f l ui d sampl e t hought t o cont ai n ant i gen or t oxi n was t hen mi xed t oget her
wi t h r ef er ence ant i ser umcont ai ni ng speci f i c al pha ant i t oxi n of Cl . novyi . Enzyme l abel l ed ant i gl obul i n was t hen added, f ol l owed by enzyme
subst r at e . The di f f er ence i n col our change bet ween a r ef er ence sampl e cont ai ni ng no ant i gen or t oxi n and t he t est sampl e sol ut i on i ndi cat es t he
amount of ant i gen or t oxi n i n t he t est sampl es . Thi s i s a compet i t i ve assay; hi gh t oxi n concent r at i ons r esul t i n l ess col our at t he end of t he t est .
The sandwi ch ELI SA t echni que was sensi t i ve enough t o det ect as l i t t l e as 390 ng/ ml t oxi n i n l i ver f l ui d sampl e. These r esul t s i ndi cat e t hat t he
ELI SA t echni que i s usef ul f or det ect i ng al pha t oxi n of Cl . novyi and f or di agnosi ng i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s .
Keywor ds : ELI SA t echni que, Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n, i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s
ABSTRAK
NATALI A, L. 1997 . Pengembangan t ekni k ELI SA unt uk mendet eksi t oksi n al f a Cl ost r i di um novyi .
Jur nal I l mu Ter nak dan Pet er i ner 2 ( 3) :
188- 193 .
- Tekni k enzyme- l i nked i mmunosor bent assay ( ELI SA) t el ah di kembangkan unt uk mendet eksi dan mengukur j uml ah t oksi n al f a yang
spesi f i k dar i Cl ost r i di um novyi unt uk penyi di kan i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Si st emi ni adal ah modi f i kasi dar i t ekni k ELI SA t i dak l angsung
yang mer upakan t ekni k i nhi bi si ELI SA unt uk mendet eksi ant i gen. Sampel yang di uj i adal ah cai r an hat i dar i hewan yang di cur i gai mat i kar ena
i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Unt uk mendet eksi t oksi n al f a, l empeng mi kr ot i t er di l api si dengan ant i gen at au t oksi n al f a. Sampel cai r an hat i
yang di per ki r akan mengandung ant i gen at au t oksi n kemudi an di campur dengan ant i ser um r ef er en yang mengandung ant i t oksi n spesi f i k
t er hadap Cl . novyi . Ant i gl obul i n yang t el ah di l abel dengan enzi m kemudi an di t ambahkan, di i kut i dengan subst r at enzi m. Per bedaan wama
ant ar a sampel r ef er en yang t i dak ber i si ant i gen at au t oksi n dan sampel yang di uj i menunj ukkan j uml ah ant i gen at au t oksi n di dal am sampel
yang di uj i . Dal amt ekni k kompet i t i f i ni , konsent r asi t oksi n yang f nggi akan meni mbui kan ber kur angnya wama pada akhi r uj i . Tekni k ELI SA
i ni cukup sensi t i f unt uk mendet eksi 390 ng/ ml t oksi n dal amsampel cai r an hat i . Hasi l i ni menunj ukkan bahwa t ekni k ELI SA ber guna unt uk
mendet eksi t oksi n al f a dar i Cl ost r i di um novyi dan unt uk mendi agnosi s i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s .
Kat z kuncl : Tekni k ELI SA, t oksi n al f a Cl ost r i di um novyi , i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s
PENDAHULUAN
Cl ost r i di um novyi t el ah di kenal sebagai mi kr oor gani sme pat ogeni k bagi t emak r umi nansi a . Penyaki t nya di kenal dengan nama i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s
at au bl ack di sease, yai t u penyaki t yang ber si f at akut
dan t oksemi k pada sapi , domba, babi dan kuda aki bat
adanya pr oduksi t oksi n al f a Cl . novyi t i pe B pada
j ar i ngan hat i yang nekr ot i k dan anoksi k ( BATTY et al . ,
1964 ; BAGADI , 1974) . Spor a dar i Cl . novyi yang
ber si f at t oksi geni k t el ah di ket ahui
dapat di t emukan
dal am hat i hewan yang nampak sehat ( BAGADI , 1974 ;
W
ORRALL et al . , 1987 ; WORRALL, 1988) . Pada Tmak
r umi nansi a, penyaki t i ni umumnya di mul ai dengan
t er j adi nya ker usakan hat i ol eh ber bagai sebab . Dal am
banyak kasus, penyebab ker usakan hat i yang ut ama
adal ah caci ng hat i ( J AMI ESON et al . , 1948 ; JAMI ESON,
1949) . Par asi t i ni ber mi gr asi dal am hat i dan meni m-
188
bul kan nekr osi s, yai t u suat u l i ngkungan yang sesuai dan
bai k unt uk per t umbuhan dan pr ol i f er asi Cl . novyi .
Toksi n al f a yang di hasi l kan kemudi an akan di absor psi
dengan cepat dan dal am beber apa j am hewan akan
mat i ( BAGADI , 1974 ; SMI TH, 1975 ; STERNE, 1981 ;
WORRALL, 1988) .
Penyaki t i ni di I ndonesi a sangat mungki n t er j adi
t anpa dapat di di agnosi s kar ena kej adi annya begi t u cepat
dan hewan mat i mendadak t anpa gej al a kl i ni s dan
kel ai nan pat ol ogi k yang nyat a. Dal ampenel i t i an yang
t el ah di l akukan di Pul au Jawa, t er nyat a 14% hewan
kambi ng- domba dan 20% hewan sapi - ker bau yang
nampak sehat mengandung spor a Cl . novyi t i pe A
dal am hat i nya ( WORRALL et al . , 1987 ; WORRALL,
1988) . Toksi n yang di hasi l kan ol eh gal ur yang t el ah
di i sol asi ber ki sar dar i 10 sampai 10 . 000 mi ni mum l et hal
doses ( MLD) menci t per ml . Penel i t i an ber i kut nya
menunj ukkan bahwa ker bau mempunyai t i t er ant i bodi
Jur nal I l mu Ter nak dan Vet er i ner Vol . 1 No. 3 Th . 1997
t er t i nggi t er hadap t oksi n al f a Cl . novyi di bandi ngkan
dengan pada ber bagai bangsa sapi yang ada di Pul au
Jawa ( NATALI A et al . , 1988) .
Toksi n al f a t er ut ama di hasi l kan ol eh Cl . novyi t i pe
A ( penyebab bi g head pada domba dan gas gangr en
pada manusi a) dan Cl . novyi t i pe B ( penyebab
i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s pada hewan r umi nansi a)
( STERNE, 1981) . Toksi n i ni bi asanya di i dent i f i kasi dar i
cai r an at au ekst r ak dar i t empat t er j adi nya l esi o . Car a
konvensi onal yang bi asa di l akukan unt uk mendet eksi
t oksi n al f a i ni adal ah dengan mel i hat r eaksi nekr ot i k
dar i t oksi n al f a pada penyunt i kan secar a i nt r a der mal
pada mar mot dan r eaksi penghambat an ol eh ant i ser umnya ( SMI TH, 1975) . Sel ai n i t u, kar ena t oksi n al f a i ni
ber si f at l et hal , maka t oksi nnya j uga dapat membunuh
menci t dan di hambat j i ka di ber i ant i ser um at au
ant i t oksi n yang spesi f i k . Uj i i ni di anggap t i dak pr akf s,
kar ena kur ang sensi t i f , memakan wakt u yang f dak
sedi ki t dan menggunakan banyak hewan per cobaan .
Ol eh sebab i t u, per l u di usahakan suat u uj i yang l ebi h
seder hana, cepat dan t epat seper t i t ekni k ELI SA yang
dapat menggant i kan uj i konvensi onal t er sebut .
ELI SA mer upakan t ekni k di agnosi s yang pr akt i s,
t epat , ber si f at masal dan t el ah di kembangkan dengan
bai k unt uk mendi agnosi s ber bagai mac am penyaki t
t er masuk penyaki t yang di sebabkan ol eh t oksi n
Cl ost r i di um ( VOLLER et al . , 1979 ; MARTI N et al . , 1988 ;
I DRI SSI dan W
ARD, 1992) . Dal am penel i t i an i ni , t ekni k
ELI SA yang di kembangkan di har apkan akan dapat
mengat asi kesul i t an dal am mendi agnosi s i nf ect i ous
necr ot i c hepat i t i s at au bl ack di sease .
MATERI DANMETODE
Unt uk mengembangkan t ekni k ELI SA guna mendet eksi t oksi n al f a dar i Cl . novyi di buat t ahapan
penger j aan sebagai ber i kut :
Pembuat an t oksi n
Unt uk mempr oduksi t oksi n al f a Cl . novyi , di buat
t er l ebi h dahul u st ar t er dar i bi akan Cl . novyi t i pe A
( gal ur CN 4270, Bur r oughs Wel l come, UK) dal am
medi um Rober t son' s cooked meat medi um ( RCMM) .
Set el ah st ar t er t umbuh dengan bai k sel ama 1 har i ,
pembuat an t oksi n di l akukan dal amj uml ah 1 l i t er dal am
medi umyang ber i si pept on 3, 0%, Na t HPO, 0, 5% dan
gl ukosa 1, 0% ( NATALI A et al . , 1988) . Pada awal per t umbuhan pH medi um adal ah 7, 8 dan sel ama t oksi n
di pr oduksi , pH bi akan di usahakan sel al u ber ada di
seki t ar 7, 0 .
Toksi n sel esai di buat dal am wakt u 3 har i dal am
t abung anaer obi k . Set el ah i t u, di t ambah 0, 01% mer t i ol at unt uk menghent i kan per t umbuhan . Toksi n yang
masi h ber campur dengan medi um i ni di sent r i f i gasi
pada 7 . 000 x g sel ama 20 meni t pada suhu 4 ° C.
Super nat an yang mengandung t oksi n kemudi an di uj i
kekuat annya dengan menggunakan menci t . Ter nyat a
t oksi n yang di hasi l kan mempunyai kekuat an 10 . 000
MLD menci t / ml .
Pemur ni an t oksi n
Pr osedur pemur ni an t oksi n pada umumnya mengi kut i met ode WORRALL ( 1988) . Toksi n mul a- mul a
di mur ni kan dengan mengendapkannya, yai t u dengan
menggunakan 50% w/ v pol yet hyl ene gl ycol ( PEG)
6 . 000 sehi ngga konsent r asi akhi r nya adal ah 30%.
Lar ut an i ni di si mpan di dal am l emar i pendi ngi n sel ama
18 j am dan di sent r i f ugasi pada 10 . 000 x g sel ama 25
meni t .
Endapan yang t er j adi kemudi an di l ar ut kan
kembal i dal am 50 ml l ar ut an phosphat e buf f er ed sal i ne
( PBS) pH 7, 5 . Ter hadap sat u vol ume l ar ut an i ni
di t ambahkan dua vol ume l ar ut an amoni um sul f at j enuh,
0, 001M EDTA, 0, 2M TRI S HCl pH 8, 0 . Endapan
t oksi n yang t er j adi di pi sahkan dan di l ar ut kan kembal i
dal am 70 ml l ar ut an PBS pH 7, 5 .
Toksi n kemudi an di mur ni kan l ebi h l anj ut dengan
menggunakan kol om kr omat ogr af i DEAF sephacel l
( Phar maci a) . Sel anj ut nya di konsent r asi kan sebanyak
10 kal i dengan menggunakan kant ong di al i si s yang
di t abur kan PEG 20 . 000 .
Pada t ahap ber i kut nya, t oksi n di ker i ngbekukan,
di t i mbang bobot nya dan konsent r asi t oksi n di j adi kan
20 mg/ ml dengan pel ar ut PBS pH 7, 5 . Toksi n i ni
akhi r nya di ker i ngbekukan sehi ngga set i ap ampul ber i si
1, 0 mg t oksi n. Pada uj i ELI SA, 1, 0 mg t oksi n i ni akan
di l ar ut kan dal am 100 ml l ar ut an penyangga kar bonat
( coat i ng buf f er ) sehi ngga konsent r asi nya 10 hg/ ml .
Pembuat an ant i t oksi n pada sapi
Hi per i muni sasi pada sapi
di l akukan dengan
menyunt i kkan t oksoi d dan t oksi n al f a Cl . novyi t i pe A
dal am dosi s ber t i ngkat pada j adwal wakt u t er t ent u .
Toksi n yang t el ah di mur ni kan seper t i t er sebut di at as
di buat menj adi t oksoi d dengan penambahan 0, 6% f or mal i n dan di si mpan pada suhu 37° C sel ama semal am.
Uj i keamanan ( saf et y t est ) t er hadap t oksoi d i ni kemudi an di l akukan pada menci t . Sej uml ah 0, 5 ml t oksoi d
har us t i dak membunuh menci t seber at 18- 20 gr am.
Hi per i muni sasi pada sapi di l akukan sebagai
ber i kut :
Pada har i ke- 0 dan ke- 28, sapi mendapat sunt i kan
2 ml t oksoi d yang di campur dengan Fr eund' s compl et e
adj uvant ( FCA) dal am per bandi ngan 1 : 1 . Sunt i kan
di l akukan secar a subkut an di daer ah l eher .
Pada har i ke- 40, - 42, - 44, dan - 67, hewan mendapat sunt i kan t oksi n secar a subkut an, masi ng- masi ng
5, 0 ml , 7, 5 ml , 10, 0 ml dan 10, 0 ml .
Pada har i ke- 73, hewan di ambi l dar ahnya dan
ser umnya di pi sahkan . Ser um i ni kemudi an di ukur
pot ensi nya dengan- uj i L+ pada menci t ( BRI TI SH
PHARMACOPOEI A,
1977) , dengan menggunakan ant i t oksi n st andar i nt er nasi onal .
189
LI LT NATALI A :
Pengembangan Tekni k ELI SA unt uk Mendet eksi Toksi n
Konj ugat
Konj ugat yang di gunakan adal ah I gG ant i sapi
yang t el ah di l abel dengan hor se r addi sh per oxi dase
( Si l enus) . Dal am pemakai annya konj ugat di encer kan
1/ 3 . 500 dengan l ar ut an PBST ( l ar ut an PBS pH 7, 5 yang
di t ambahkan 0, 05%Tween- 20) .
Pr osedur t ekni k ELI SA
Pada dasar nya, penger j aan t ekni k ELI SA yang
di l akukan adal ah mengi kut i met ode VOLLER et al .
( 1979) yang di modi f i kasi sehi ngga dapat di gunakan
unt uk mendet eksi t oksi n . Lempeng mi kr o ELI SA
dengan 96 l ubang mul a- mul a di l api si dengan ant i gen
at au t oksi n al f a sebanyak 100 gl at au 1, 0 pg per l ubang
( konsent r asi l ar ut an ant i gen : 10 gg t oksi n/ ml dal am
l ar ut an penyangga kar bonat pH 9, 6) . Lempeng mi kr o
i ni kemudi an di i nkubasi semal am pada suhu 4° C.
Set el ah i t u di l akukan pencuci an sebanyak 3 kal i dengan
menggunakan PBS pH 7, 5 yang di t ambahkan 0, 05%
Tween- 20 .
Sampel cai r an hat i yang di duga mengandung
t oksi n dal am encer an 1/ 100 di campur ant i ser um/ ant i t oksi n ber kekuat an 4, 0 LU. dal am encer an 1/ 100,
dengan per bandi ngan 1 : 1 . Campur an i ni di bi ar kan
sel ama 30 meni t pada suhu r uangan. Sel anj ut nya 100
pl Campur an i ni kemudi an di masukkan ke dal am set i ap
l ubang dal am l empeng mi kr o . Sebagai pembandi ng
at au kont r ol negat i f ( t i dak mengandung t oksi n) , di gunakan Campur an ant i t oksi n t anpa penambahan t oksi n.
Sebagai pel ar ut ant i t oksi n di gunakan l ar ut an penyangga
Tr i s EDTA NaCl pH 9, 6 yang di t ambah 0, 05% Tween
20 dan 0, 04%kasei n ( TTC) . I nkubasi di l akukan sel ama
1 j am pada suhu r uangan. Pencuci an kembal i di l akukan
dengan PBST sebanyak 3 kal i .
Konj ugat ant i I gG sapi di t ambahkan dal am
encer an 1/ 3 . 500 dal am PBST sebanyak 100 pd per
l ubang . Lempeng mi kr o kemudi an di i nkubasi sel ama
sat u j am dal am suhu r uangan . Pencuci an di l akukan
sebanyak 3 kal i dengan menggunakan PBST. Set el ah
i t u di masukkan subst r at sebanyak 100 pl , yai t u 2, 2azi no- bi s
( 3et hyl
benzt hi azol i ne- 6- sul f oni c
aci d)
( ABTS) dal am penyangga si t r at ber - pH 4, 2 . I nkubasi
pada suhu r uangan kembal i di l akukan sel ama sat u j am.
Hasi l nya di baca dengan menggunakan ELI SA pl at e
r eader ( Ti t er t ek MCC 340, Fl ow Labor at or i es, USA)
dengan panj ang gel ombang 415 nm. Pads set i ap
l empeng mi kr o akan t er dapat kont r ol negat i f , yai t u
sebagai pembandi ng bagi sampel yang di uj i .
Akan t er l i hat per bedaan yang nyat a ant ar a sampel
yang mengandung t oksi n/ ant i gen dan kont r ol yang
t i dak mengandung ant i gen . Besar nya per bedaan ni l ai
densi t as opt i kal at au war ns i ni menunj ukkan j uml ah
t oksi n al f a at au ant i gen dal am sampel yang di uj i
( Gambar 1) . Uj i i ni ber si f at kompet i t i f , konsent r asi
ant i gen yang maki n t i nggi dal am sampel akan meng-
19 0
aki bat kan ni l ai densi t as opt i kal at au war ns yang maki n
ber kur ang .
St andar di sasi dan eval uasi t ekni k ELI SA
Unt uk mendapat kan encer an ant i gen pel api s yang
opt i mal t er hadap ser um posi t i f ( ant i t oksi n r ef er en) ,
mul a- mul a di l akukan t i t r asi dengan si st em checker
boar d. Sampel yang di gunakan ber upa cai r an hat i yang
di buat dengan car a sebagai ber i kut :
Pot ongan hat i ( ki r a- ki r a 1 cm' ) yang t el ah di t ambah 2, 0 ml PBS pH 7, 2 di hancur kan dengan menggunakan st omacher . Sent r i f ugasi kemudi an di l akukan
pada 5 . 000 x g sel ama 5 meni t unt uk memi sahkan
cai r an dan endapannya. Super nat an t er sebut kemudi an
akan di gunakan sebagai sampel yang di uj i dengan
t ekni k ELI SA.
Dar i r umah pot ong hewan, sebanyak 44 sampel
hat i dar i 44 ekor hewan sapi dan ker bau yang nampak
sehat akan di uj i kadar kandungan t oksi nnya . Hasi l uj i
i ni kemudi an akan di gunakan sebagai bat as ni l ai ELI SA
yang negat i f .
Unt uk menget ahui
kepekaan t ekni k ELI SA,
di l akukan uj i t er hadap sampel ber upa cai r an hat i yang
mengandung ber bagai konsent r asi t oksi n . Unt uk i t u,
sampel hat i sapi dar i hewan sehat di r umah pot ong
hewan yang t el ah di ket ahui negat i f at au t i dak mengandung t oksi n al f a di ber i per l akuan dengan penambahan
ber bagai konsent r asi t oksi n . Unt uk penambahan t oksi n
dal amcai r an hat i , t oksi n di encer kan secar a ser i dengan
kel i pat an dua, yai t u dar i 100 . 000 ng/ ml sampai 48, 75
ng/ ml . Dar i hasi l yang di dapat akan t er l i hat kepekaan
uj i ELI SA unt uk mendet eksi t oksi n yang t er kandung
dal amsampel cai r an hat i .
HASI L DAN PEMBAHASAN
Tekni k ELI SA t el ah di gunakan Unt uk mendet eksi
t oksi n Cl . novyi t i pe B dengan menggunakan 3
ant i ser um pol i kl onal ( SCHRANER et al . , 1992) . Tekni k
ELI SA unt uk mendet eksi ber bagai t oksi n dar i Cl . per f r i ngens, Cl . bot ul i num pada umumnya j uga t el ah di kembangkan dengan menggunakan ant i bodi yang
mur ni dan spesi f i k ( WI MSATT et al . , 1986 ; SOYKA et
al . , 1989 ; LYERLY dan WI LKI NS, 1991 ; THOMAS, 1991 ;
I DRI SSI dan W
ARD,
1992 ; GREGORY et al . , 1996) .
Met ode pengembangan t ekni k ELI SA t er sebut pada
umumnya menggunakan ant i ser um yang t el ah di mur ni kan unt uk dapat di gunakan sebagai ant i gen pel api s at au
pembuat an konj ugat yang spesi f i k .
Tekni k ELI SA yang di kembangkan dal am penel i t i an i ni adal ah modi f i kasi dar i met ode VOLLER et al .
( 1979) , yai t u met ode t i dak l angsung dan kompet i t i f .
Car a i ni dapat di gunakan dengan pemakai an ant i gen
at au t oksi n yang t el ah di mur ni kan t anpa har us menggunakan ant i bodi yang mur ni dan spesi f i k. Dal am uj i
i ni di ni l ai besar nya sel i si h ni l ai densi t as opt i kal ant ar a
Jur nal I l mu Ter nak dan Vet er i ner Vol . 2 No . 3 Th . 1997
Lempeng mi kr o di l api si ant i gen
at au t oksi n al f a C1. novyi
Lempeng mi kr o di cuci
Sampel yang di duga mengandung
ant i gen di campur dengan ant i bodi
at au ant i t oksi n r ef er en
Lempeng mi kr o di cuci
3.
Konj ugat enzi m ant i gl obul i n
di t ambahkan
Lempeng mi kr o
4.
di cuci
Subst r at enzi m di t ambahkan
0
0
0
Adanya degr adasi subst r at menunj ukkan
sampel ( 2) t i dak mengandung ant i gen
Gambar l .
O
0
0
0
0
0
0
O
0
Ti dak ada degr adasi subst r at menunj ukkan
sampel ( 2) mengandung ant i gen
Modi f i kasi met ode VOLLER et al . ( 1, 979) : t ekni k ELI SA t i dak l angsung unt uk mendet eksi ant i gen
sampel yang mengandung t oksi n al f a Cl . novyi dan
kont r ol yang t i dak mengandung t oksi n . Konsent r asi
ant i gen at au t oksi n yang maki n t i nggi dal am sampel
akan mengaki bat kan ni l ai densi t as opt i kal at au wama
yang maki n ber kur ang .
Pada uj i ELI SA i ni , sampel yang di j adi kan bahan
pemer i ksaan adal ah cai r an hat i hewan yang di duga mat i
kar ena i nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s . Dal am kasus
penyaki t i ni , or gan hat i mer upakan t empat ut ama bagi
Cl . novyi unt uk t umbuh, ber pr ol i f er asi dan menghasi l kan t oksi n ( SMI TH, 1975) .
Dar i hasi l t i t r asi pendahul uan di dapat kan bahwa
ant i gen pel api s yang di per l ukan adal ah 1 Lt g/ l ubang
at au dal am konsent r asi 10 l t g/ ml , sedangkan ant i ser um
st andar yang di gunakan adal ah 4 LU. / ml , yang dal am
pemakai annya di encer kan 1/ 100 dal aml ar ut an TTC.
Dal am peni l ai an hasi l ELI SA yang ber si f at kompet i t i f i ni , di ni l ai besar nya penghambat an t oksi n al f a Cl .
novyi t er hadap ser um r ef er en at au di hi t ung besar nya
sel i si h ni l ai densi t as opt i kal ant ar a sampel yang di uj i
dan kont r ol negat i f yang t i dak mengandung t oksi n .
Maki n besar sel i si h densi t as opt i kal akan maki n besar
pul a kandungan t oksi n di dal amsampel .
Unt uk menget ahui bat asan ni l ai ELI SA negat i f ,
j uga t el ah di l akukan uj i ELI SA t er hadap cai r an at au
ekst r ak hat i sapi dan ker bau yang sehat . Ter nyat a dar i
44 sampel cai r an hat i yang di uj i mempunyai
ni l ai
densi t as opt i kal sebesar 1, 050 ± 0, 052 . Dal am eval uasi
uj i ELI SA yang di kembangkan, t el ah di coba mendet eksi ber bagai konsent r asi t oksi n yang di l ar ut kan
dal am cai r an hat i dar i sapi yang sehat . Hasi l nya dapat
di l i hat pada Gambar 2 . Pada gambar i ni dapat di l i hat
adanya per pot ongan ant ar a gar i s cai r an hat i t anpa
t oksi n dan gar i s cai r an hat i yang mengandung t oksi n .
Jadi , di seki t ar t i t ' i k pot ong i ni ada at au t i dak adanya
t oksi n dal am sampel cai r an hat i t i dak dapat di bedakan .
LI LT NATALI A :
Pengembangan Tekni k ELI SA unt uk Mendet eksi Toksi n
Sesudah t i t i k pot ong i ni , maki n besar kadar t oksi n
dal am sampel akan menunj ukkan ni l ai densi t as opt i kal
yang semaki n r endah, at au akan maki n besar sel i si h
ni l ai densi t as opt i kal ant ar a sampel yang mengandung
t oksi n dan sampel t anpa t oksi n.
1 .2
menggunakan wakt u yang l ebi h l ama, namun hasi l
ELI SA l ebi h spesi f i k dan l ebi h konsi st en pada uj i
ul angan . RPLA l ebi h sensi t i f dar i pada ELI SA, t et api
memper l i hat kan beber apa r eaksi nonspesi f i k . Dar i
ket i ga uj i i ni , ver ocel l assay yang t er endah sensi t i vi t asnya dan t i dak sel al u konsi st en pada uj i ul angan
kar ena adanya r eaksi si t ot oksi k nonspesi f i k dan r eaksi
si t ot oni k ( BERRY et al . , 1988) . Met ode l ai n yang seder hana dan yang sel ama i ni masi h di gunakan adal ah uj i
bi ol ogi s menggunakan menci t , uj i hemol i si s dan uj i
hemagl ut i nasi ( LYERLY dan WI LKI NS, 1991) . Uj i i ni
di pandang kur ang sensi t i f di bandi ngkan dengan t ekni k
ELI SA.
Sebagai kesi mpul an dapat di nyat akan bahwa
t ekni k ELI SA kompet i t i f yang di kembangkan i ni dapat
di gunakan sebagai penggant i uj i bi ol ogi s yang meng
gunakan menci t , kar ena l ebi h pr akt i s, seder hana dan
l ebi h sensi t i f .
DAFTARPUSTAKA
Toksi n ( ni l / ml )
Gambar 2.
Ti ngkat densi t as opt i kal t ekni k ELI SA dar i
sampel cai r an hat i dengan dan t anpa t ambahan
t oksi n Cl . novyi
Hasi l ELI SA unt uk mendet eksi al f a t oksi n dapat
di coba unt uk di bandi ngkan dengan uj i konvensi onal ,
yai t u uj i t oksi si t as pada menci t . Hasi l yang posi t i f pada
uj i t oksi si t as t oksi n al f a pada menci t di t unj ukkan
dengan adanya kemat i an. Jadi , dal am penel i t i an i ni ,
t oksi n yang di gunakan dal am t ekni k ELI SA di ukur
kemampuannya unt uk membunuh menci t . Dal am uj i
i ni , 1 mg t oksi n yang ker i ng beku mempunyai 150
MLD menci t at au t oksi n i ni dapat membunuh menci t
dal am j uml ah 6, 66 l l g, sedangkan sampel yang
mengandung t oksi n dal am j uml ah l ebi h keci l dar i 6, 66
pg member i hasi l negat i f at au t i dak dapat membunuh
menci t .
Bat asan kepekaan ELI SA dapat di t ent ukan ber dasar kan mean sampel negat i f di t ambah 2 st andar
devi asi ( TuSSEN, 1985) . Kar ena t ekni k ELI SA yang
di kembangkan i ni ber si f at kompet i t i f dan maki n t i nggi
j uml ah t oksi n dal am sampel akan maki n r endah ni l ai
densi t as opt i kal nya, maka bat asan t oksi n yang dapat
di det eksi adal ah mean sampel negat i f di kur angi 2
st andar devi asi . Jadi , bat as pembedaan ant ar a ELI SA
posi t i f dan negat i f adal ah ni l ai densi t as opt i kal 0, 946
at au sampel dengan kandungan t oksi n mendekat i 390
ng/ ml at au 0, 39 pg/ ml ( Gambar 2) . Dengan demi ki an,
t ekni k ELI SA dapat mendet eksi t oksi n dal am j uml ah
yang l ebi h r endah di bandi ngkan dengan uj i konvensi gnal dengan menggunakan menci t .
Di bandi ngkan dengan met ode l ai n unt uk mendet eksi t oksi n kl ost r i di a seper t i r ever sed passi ve l at ex
aggl ut i nat i on ( RPLA) dan ver ocel l assays ( mengukur
ef ek si t ot oksi si t as dar i t oksi n) , meski pun t ekni k ELI SA
19 2
H. O. 1974 . I nf ect i ous necr ot i c hepat i t i s ( bl ack
di sease) of sheep . Vet . Bul l . 44 : 385- 388 .
BAGADI ,
BATTY,
I .,
D.
BUNTAI N,
and
P. W. WALKER.
1964 .
Cl ost r i di um oedemat i ens: a cause of sudden deat h i n
sheep, cat t l e and pi gs. Vet . Rec. 76 : 1115- 1116 .
J . C. RODHOUSE,
S.
HUGHES,
B. A.
and R. J. GI LBERT. 1988 . Labor at or
y
t echni ques . Eval uat i on of ELI SA, RPLA and Ver o cel l
assays f or det ect i ng Cl ost r i di um per f r i ngens ent er ot oxi n
i n f aecal speci mens . J. Cl i n . Pat hol . 41 : 458- 461 .
BERRY,
P.
R. ,
BARTHOLOMEW,
Appendi x XI V b . Br i t i sh
Publ i shed
on
t he
r ecommendat i on of t he Medi ci nes Commi si on. Her
Maj est y' s St at i oner y Of f i ce . London .
BRI TI SH PHARMACOPOEI A 1977 .
Phar macopoei a
( Vet er i nar y) .
GREGORY, A. R. , T. M. ELLI S, T . F . JUBB, R.
D. V. COUSI NS. 1996 . Us e of enzyme- l
J. NI CKELS, and
i nked i mmunoassays f or ant i body t o t ypes C and D bot ul i num t oxi ns f or
i nvest i gat i ons of bot ul i sms i n cat t l e . Aust . Vet . J. 7 3
( 2) : 55- 61 .
A. H. E. and G. E. WARD. 1992 . Devel opment of
doubl e sandwi ch ELI SA f or Cl ost r i di umper f r i ngens bet a
and epsi l on t oxi ns . Yet . Mi cr obi ol . 31 : 89- 99 .
I DRI SSI ,
J . J . THOMPSON, and J. G. BROTHERSTON. 1948 .
St udi es i n bl ack di sease . The occur ence of t he di sease i n
sheep i n nor t h of Scot l and. Yet . Rec. 60 : 11- 14 .
JAMI ESON, S. ,
S.
1949 . The i dent i f i cat i on of Cl ost r i di um
oedemat i ens and an exper i ment al i nvest i gat i on of i t s r ol e
JAMI ESON,
i n t he pat hogenesi s of i nf ect i on necr ot i c hepat i t i s ( bl ack
di sease) of sheep . J. Pat h . Bact . 61 : 389- 402.
D. M. and T. D. WI LKI NS . 1991 . Toxi n s of
anaer obes . I n : Anaer obi c Mi cr obi ol ogy . The Pr act i cal
Appr oach Ser i es . I RL Pr ess . Oxf or d Uni ver si t y Pr ess,
Oxf or d : 163 - 181 .
LYERLY,
P. K. , R. D. NAYLOR, and R. T . SHARPE. 1988 .
Det ect i on of Cl ost r i di um per f r i ngens epsi l on t oxi n by
MARTI N,
Jur nal I l mu Ter nak dan Vet er i ner Vol . 2 No. 3 Th. 1997
enzyme- l i nked
44 : 270- 271 .
i mmunosor bent
assay.
Res.
Vet .
Sci .
THOMAS, R.J . 1991 . Det ect i on of Cl ost r i di um bot ul i num t ypes
C and Dt oxi n by ELI SA. Am. Vet . J. 68 ( 3) : 111- 113 .
NATALI A, L. ,
E. EMORRALL, and . M
. SYAFARUDI N.
1988 . Ant i bodi es t o Cl ost r i di um novyi al pha t oxi n i n
i mpor t ed cat t l e and buf f al o i n Java. Pr oceedi ngs of t he
6t h Congr ess of FAVA, Oct . 16- 19, 1988 . Denpasar , Bal i ,
I ndonesi a: 429- 434 .
Ti i ssEN, P. 1985 . Pr act i ce and Theor y of Enzyme I mmuno
Assays . El sevi er , Amst er dam. pp . 385- 421 .
SCHRANER,
L,
M. H. KALTNER, and H. LOSCH. 1992 .
I sol at i on of i mmunogeni c and l et hal pept i des of al phat oxi n f r om Cl ost r i di um novyi t ype B. Toxi con- Oxf or d. 30
( 5/ 6) : 653- 668 .
SMI TH, L. D. S. 1975 . The Pat hogeni c Anaer obi c Bact er i a.
2nd Ed . Char l es C. Thomas Publ i sher . Spr i ngf i el d,
I l l i noi s, U. S. A.
SOYKA, M.G., V. J. WHI TE, C. J . THORNS, and P. L. RoEDER.
1989 . The det ect i on of Cl ost r i di um per f r i ngens epsi l on
ant i t oxi n i n r abbi t ser um by monocl onal ant i body based
compet i t i on ELI SA. J. Bi ol . St andar di zat i on 17 : 117- 124 .
STERNE, M. 1981 . Cl ost r i di al i nf ect i ons . Br i t . Vet . J. 137: 434454.
VOLLER, A. , D. E. BI DWELL, and A. BARTLETT . 1979 . The
Enzyme- l i nked I mmunosor bent Assay. Dynat ech Lab . I nc .
900 Sl at er s Lane, Al exandr i a, Vi r gi ni a 22314 .
WI MSATT, J. C. , S. M. HARMoN, and D. B. SHAH. 1986 .
Det ect i on of Cl ost r i di um per f r i ngens ent er ot oxi n i n st ool
speci mens and cul t ur e super nat ant s by enzyme- l i nked
i mmunosor bent assay . Di agn. Mi cr obi ol . I nf ect . Di s.
4: 307- 313 .
WORRALL,
E. E. , G. MoEKTi , and D. A. LUBI S. 1987.
Cl ost r i di um novyi i sol at ed f r om t he l i ver s of heal t hy
sheep and goat s i n Java. Penyaki t Hewan 19( 13) : 14- 16 .
WORRALL, E. E. 1988 . Assi gnment Ter mi nat i on Repor t .
Br i t i sh I ndonesi an Techni cal Cooper at i on Pr oj ect . ATA
244. Phase 3 . RI VS, Bogor , West Java, I ndonesi a.