Metode penelitian bab03 metode (16)
Metode
Penentuan vitamin yang terkandung di dalam susu formula dapat dilakukan dengan
beberapa metode uji seperti uji Uji MBA dan metode HPLC. Uji MBA
Microbiological Assay ialah suatu metode yang sederhana dan spesifik. Metode
tersebut dalam menentuan kadar vitamin, memperoleh hasil sangat baik karena dapat
menentukan kedua matriks dan premiks dalam sampel. Metode ini menjadikan dasar
tolak ukur hasil adalah respon pertumbuhan bakteri lactobcilli pada berbagai macam
vitamin.
Uji MBA diawali dengan kalibrasi larutan dan ekstrak sampel (sekitar 200 µl)
disimpan ke dalam 96 spot mikrotiter yang di lapisi oleh alumunium foil untuk
melindungi sampel dari cahaya. Sensor dan sistem mikrofluida diseimbangkan dengan
penyangga HBS-EP dan masing-masing protein yang mengikat vitamin, larutan
pengkondisi dan regenerasi larutan disimpan di rak reagen. Setelah data sampel
dimasukkan ke dalam software dan parameter diuji. Parameter yang diuji yaitu laju
alir, contact time, regeneration time, sistem pendingin, dan fungsi data pengolahan,
secara otomatis pengaturan dimulai. Kisaran dinamis parameter uji ini tergantung
pada kondisi pengujian dan bobot molekul. Laju alir dari lima vitamin ialah 40, 20,
40, 40 dan 25 µl/ menit untuk masing-masing vitamin B 2, B12, folat asam, biotin dan
asam pantotenat. Contact time dan regeneration time adalah 30-480 dan 30-60 s.
Selanjutnya volume injeksi berkisar dari 22 µL sampai dengan 177 µL. Dibutuhkan
waktu dalam analisis per sampel adalah sekitar 2-10 menit. Kalibrasi larutan vitamin
digunakan tanpa adanya preparasi, prosedur analisis dari sampel SRM 1846 sama
persis dengan sampel susu bayi.
Pengujian vitamindapat juga dilakukan dengan Metode KCKT/HPLC. Metode
KCKT digunakan untuk analisis non-destruktif, sehingga berbagai analisis dapat
dilakukan dengan KCKT baik untuk tujuan analitik maupun tujuan preparatif,
senyawa yang dianalisis dilarutkan dalam cairan dan hampir semua pemisahan
berlangsung pada suhu kamar. Pemisahan dengan KCKT didasarkan pada interaksi
analat dengan fase gerak dan fase diamnya (Kazakevich & Lobrutto 2007).Skema
KCKT pada Gambar 2 menunjukkan bahwa sampel diinjeksikan melalui injektor
kemudian melalui kolom yang didalamnya terdapat fase diam. Fase gerak yang telah
disiapkan akan mengalir menuju kolom dengan bantuan pompa, pada kolom tersebut
akan terjadi pemisahan berdasarkan kepolaran. Kolom penjaga ditempatkan sebelum
kolom analitik untuk melindungi kolom analitik dari kontaminasi (Harvey 2000).
Analat yang memiliki sifat yang sama dengan fase diam akan tertahan sedangkan
yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase gerak akan terbawa mengalir menuju
detektor untuk dideteksi kemudian menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang
proporsional dan direkam untuk menghasilkan kromatogram (Kazakevich & Lobrutto
2007). Selain kedua metode di atas ada beberapa metode lain yang dapat digunakan
sabagai penentu kadar vitamin pada beberapa sampel uji seperti metode yang beragam
antara lain Radioimmunoassay (RIA) , Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay(ELISA), enzyme protein binding assay( EPBA), radiolabelled protein binding
assay (RPBA).
Penentuan vitamin yang terkandung di dalam susu formula dapat dilakukan dengan
beberapa metode uji seperti uji Uji MBA dan metode HPLC. Uji MBA
Microbiological Assay ialah suatu metode yang sederhana dan spesifik. Metode
tersebut dalam menentuan kadar vitamin, memperoleh hasil sangat baik karena dapat
menentukan kedua matriks dan premiks dalam sampel. Metode ini menjadikan dasar
tolak ukur hasil adalah respon pertumbuhan bakteri lactobcilli pada berbagai macam
vitamin.
Uji MBA diawali dengan kalibrasi larutan dan ekstrak sampel (sekitar 200 µl)
disimpan ke dalam 96 spot mikrotiter yang di lapisi oleh alumunium foil untuk
melindungi sampel dari cahaya. Sensor dan sistem mikrofluida diseimbangkan dengan
penyangga HBS-EP dan masing-masing protein yang mengikat vitamin, larutan
pengkondisi dan regenerasi larutan disimpan di rak reagen. Setelah data sampel
dimasukkan ke dalam software dan parameter diuji. Parameter yang diuji yaitu laju
alir, contact time, regeneration time, sistem pendingin, dan fungsi data pengolahan,
secara otomatis pengaturan dimulai. Kisaran dinamis parameter uji ini tergantung
pada kondisi pengujian dan bobot molekul. Laju alir dari lima vitamin ialah 40, 20,
40, 40 dan 25 µl/ menit untuk masing-masing vitamin B 2, B12, folat asam, biotin dan
asam pantotenat. Contact time dan regeneration time adalah 30-480 dan 30-60 s.
Selanjutnya volume injeksi berkisar dari 22 µL sampai dengan 177 µL. Dibutuhkan
waktu dalam analisis per sampel adalah sekitar 2-10 menit. Kalibrasi larutan vitamin
digunakan tanpa adanya preparasi, prosedur analisis dari sampel SRM 1846 sama
persis dengan sampel susu bayi.
Pengujian vitamindapat juga dilakukan dengan Metode KCKT/HPLC. Metode
KCKT digunakan untuk analisis non-destruktif, sehingga berbagai analisis dapat
dilakukan dengan KCKT baik untuk tujuan analitik maupun tujuan preparatif,
senyawa yang dianalisis dilarutkan dalam cairan dan hampir semua pemisahan
berlangsung pada suhu kamar. Pemisahan dengan KCKT didasarkan pada interaksi
analat dengan fase gerak dan fase diamnya (Kazakevich & Lobrutto 2007).Skema
KCKT pada Gambar 2 menunjukkan bahwa sampel diinjeksikan melalui injektor
kemudian melalui kolom yang didalamnya terdapat fase diam. Fase gerak yang telah
disiapkan akan mengalir menuju kolom dengan bantuan pompa, pada kolom tersebut
akan terjadi pemisahan berdasarkan kepolaran. Kolom penjaga ditempatkan sebelum
kolom analitik untuk melindungi kolom analitik dari kontaminasi (Harvey 2000).
Analat yang memiliki sifat yang sama dengan fase diam akan tertahan sedangkan
yang memiliki kepolaran yang sama dengan fase gerak akan terbawa mengalir menuju
detektor untuk dideteksi kemudian menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang
proporsional dan direkam untuk menghasilkan kromatogram (Kazakevich & Lobrutto
2007). Selain kedua metode di atas ada beberapa metode lain yang dapat digunakan
sabagai penentu kadar vitamin pada beberapa sampel uji seperti metode yang beragam
antara lain Radioimmunoassay (RIA) , Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay(ELISA), enzyme protein binding assay( EPBA), radiolabelled protein binding
assay (RPBA).