Lingkungan sekitar kita banyak terkandun (1)

RANGKUMAN DEMO PRAKTIKUM
IDENTIFIKASI MUTAGENIK BAKTERI Escherichia coli
DENGAN METODE AMES TEST

Oleh :
Nama

: Binti Nurul Zannah

NIM

: 1250901001110034

Kelompok

: 2A

Asisten

: Chintya Chorin
Ilham Risky

Novianti R.
Ratna Fadhillah I.
Restu Nugraha

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2014

BAB I
TINJAUAN PUSTAKA
Lingkungan sekitar kita banyak terkandung senyawa yang sifatnya menyebabkan
kanker atau perusakkan sel, senyawa tersebut adalah senyawa karsinogenik. Amest test adalah
suatu metode dalam biologi yang digunakan untuk mendeteksi potensi mutagenic dari suatu
senyawa kimia. Uji positif mengindikasikan bahwa senyawa kimia tersebut berperan sebagai
zat karsinogenik. Zat karsinogenik adalah suatu zat yang dapat menyebabkan terjadinya
kanker. Zat – zat yang memiliki sifat karsinogenik antara lain; sinar UV, polutan industri,
petisida, food additives dan produk rokok. Zat – zat yang bersifat karsinogenik dapat memicu
kanker, hal ini dikarenakan senyawa ini memiliki sifat mutagen (dapat menyebabkan

terjadinya mutasi atau perubahan dari susunan DNA) (Isnawati, Ani, dkk, 2002).
1. Pengertian Mutagen
Mutagen merupakan suatu zat atau senyawa yang dapat mempengaruhi susunan dari
gen atau disebut mutasi. Mutasi merupakan suatu perubahan DNA yang dapat berpengaruh
terhadap reproduksi dari sel dan pertumbuhan yang tak tekendali, bahkan menyebabkan
terjadinya kerusakkan sel. Karsinogenik berbeda dengan mutagen, karsinogen adalah zat-zat
atau senyawa yang dapat menyebabkan terjadinya kanker, sementara mutagen merupakan zat
yang dapat menyebabkan terjadinya mutasi. Mutasi dapat tejadi secara alami ataupun secara
buatan, secara alami dapat disebabkan oleh panas, radiasi sinar kosmis, radiokatif, sinar
ultraviolet, dan ionisasi internal mikroorganisme. Mutasi buatan merupakan mutasi yang
disebabkan oleh perbuatan manusia, contohnya penggunaan bahan radioaktif untuk diagnosis,
penggunaan senjata nuklir, penggunaan roket, dan pemanfaatan bahan kimia serta bahan
fisika dan biologi. Contoh mutagen fisika adalah sinar kosmis, sinar ultraviolet, radiasi sinar
X, α, β, dan γ. Mutagen kimia adalah mutagen yang berasal dari bahan kimia, contohnya
pestisida, seperti DDT, BHC (Ames, B.N., J.Mc Can and Yamasaki, E. 1975).
Uji senyawa karsinogenik dapat dilakukan dengan uji jangka pendek (short term test),
uji jangka menengah, dan uji jangka panjang.
1. Uji jangka pendek : uji ini dugunakan untuk mengidentifikasi adanya senyawa
yang bersifat karsinogenik dan dapat menyebabkan terjadinya mutasi pada DNA
dalam sel, baik secara invitro adaupun invivo.

2. Uji jangka menengah : uji ini dilakukan selama 1 tahun dengan menggunakan
hewan percobaan berupa tikus. Misalnya ames test.
3. Uji jangka panjang : dilakukan selama dua tahun.

Uji jangka pendek contohnya amest test, amest test merupakan uji yang digunakan
untuk menguji apakah senyawa tersebut bersifat mutagen atau tidak, dan berpotensi untuk
menginduksi terjadinya mutasi pada suatu DNA dalam sel, baik secara invitro maupun in vivo
(Ames, B.N., J.Mc Can and Yamasaki, E. 1975).

2. Amest Test
Amest test adalah nama yang diambil dari penemunya Bruce Ames. Dasar dari
tes ini adalah adanya senyawa yang bersifat mutagenik terhadap bakteri, senyawa mutagenik

akan dapat berubah menjadi karsinogenik atau zat yang dapat menyebabkan kanker. Uji ames
test ini sering menggunakan bakteri Salmonella typhimurium, hal ini dikarenakan bakteri ini
memiliki sensitivitas yang tinggi terhadap senyawa-senyawa yang bersifat mutagenik, bakteri
ini tidak dapat bertahan hidup pada media tanpa asam amino histidin. Uji ames test ini
dilakukan dengan cara memasukkan bahan kimia yang diuji beserta bakteri yang digunakan
dalam tabung tes, sampel tersebut kemudian di letakkan pada cawan petri yang isinya media
agar beserta histidin, media ini ditunjukkan sebagai penyedia nutrisi bagi bakteri. Sampel

yang diberikan dibiarkan tumbuh selama 24 - 48 jam, dalam beberapa waktu tersebut akan
terjadi penurunan volume histidin, hal ini dikarenakan digunakan oleh bakteri, sehingga lama
kelamaan volumenya akan habis, dan bakteri tersebut tidak mampu bertahan pada kondisi
media tanpa histidin. Jika hasilnya bakteri terus berkembang dalam media tanpa histidin,
maka bakteri tersebut telah mengalami mutasi. Sehingga dapat hidup pada media tanpa
histidin. Hasil ini menunjukkan hasil ames test positif. Sebagaimana ditunjukkan pada gambar
1 ( Langlais, 2002).

Gambar 1. Uji Ames Test
Amest test ditemukan oleh Bruce Ames, uji tersebut digunakan untuk membuktikan
senyawa kimia yang dapat menjadi mutagen. Penggunaaan uji ini berdasarkan asumsi bahwa
substansi bersifat mutagenik (terhadap bakteri yang digunakan) sehingga dapat menjadi
karsinogenik, zat yang memiliki sifat tersebut dapat menimbulkan kanker. Beberapa substansi
dapat menyebabkan kanker di laboratorium hewan (contohnya dioksin) tidak memberikan
hasil positif pada uji. Test ini perlu biaya yang rendah selain itu test ini mudah dilkaukan
dalam menguji bakteri yang sifatnya carsinogenik terhadap lingkungan. Bakteri yang
digunakan untuk uji ini adalah strain dari Salmonella typhimurium yang membawa defective
(mutan) gen membuatnya tidak dapat mensintesis asam amino histidin (His) dari komposisi
media kultur. Bagaimanapun, beberapa tipe mutasi dapat di amati, hal ini ditandai dengan
mudahnya tumbuh pada suatu media tanpa histidin. Suspensi histidin (His) strain Salmonella

typhimurium ditempatkan pada campuran enzim dari hati tikus pada media agar tanpa histidin,
paper disk dipenuhi dengan 10 µg 2-aminofluorin yang diketahui sebagai karsinogen, seperti
ditunjukkan pada gambar ke 3 (Langlais, 2002). Efek mutagenik dari senyawa kimia senyawa
kimia dapat menyebabkan banyak bakteri dapt hidup tanpa histidin, membentuk revertant

coloni disekitar disk. Koloni tersebar didekat margin pada disk. Banyak senyawa kimia tidak
mutagenic atau karsinogenik, tetapi dapat berubah menjadi mutagenik atau karsinogenik
setelah dimetabolismenya dalam hati ini sebagai reaksi ames test pada percampuran enzim di
liver. Hasilnya akan ditunjukkan seperti gambar 2, dimana banyak bakteri yang tumbuh
(Mortelmans K, 1994).

Gambar 2. Hasil uji Ames test

Gambar 3. Uji Ames Test
1.3 Alasan digunakannya Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium merupakan strain bakteri yang tidak dapat tumbuh dalam
media tanpa asam amino histidin, hal ini dikarenakan mutasi berada pada gen yang mengkode
satu dari 9 enzim yang digunakan pada jalur biosintesis histidin. Mutan sendiri ada dua
macam, yaitu mutan auxoprof dan mutan prototroph. Mutan yang dapat bertahan hidup pada
media tanpa adanya histidin adalah mutan prototrop. Salmonella typhimurium bukan

merupakan model yang sempurna untuk pada tubuh manusia. Bakteri uji yang digunakan
merupakan mikroba prokariot sedangkan manusia merupakan eukaryot sehingga perlu
dilakukan pencampuran enzim liver dari organisme eukaryot. Penghitungan jumlah koloni
yang tumbuh digunakan utuk mengukur aktivitas mutagenik dari senyawa yang digunakan,
aktivitas mutasi akan berlangsung secara spontan pada media yang tidak diberi histidin.
Salmonella typhimurium memang sering digunakan dalam uji ames test, strain lainnya adalah

strain TA 1535 dan strain TA 100 sensitif terhadap subtitusi pasangan basa melalui DNA.
Beberapa strain lainnya yiatu TA1537, TA1538, TA98 dan strai baru yang lebih sensitif yaitu
TA97 dan TA 102. Selain itu juga dapat digunakan Escherichia coli (Mortelmans K, 1994).

BAB II
METODELOGI
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum yang Berjudul “Ames Test” dilaksanakan hari Kamis, 01 Mei 2014 pada
pukul 13.00-16.30 WIB. Bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
2.1 Cara Kerja
Praktikum tentang Ames test ini bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa yang
dapat menyebabkan mutagenic, senyawa mutagen ini dapat bersifat karsinogenik atau

menimbulkan kanker), bakteri uji yang digunakan biasanya Salmonella typhymuriam dan
E.coli. Bakteri Salmonella typhimarium menggunakan media spesifik histidin sedangkan pada
bakteri Escherichia coli menggunakan media triptofan. Ames test dilakukan melalui tiga
metode yaitu :
1. Media 2 layer
2. Media Spot test
3. Keberadaan warna merah
Pada praktikum kali ini digunakan metode media 2 layer, dengan komposisi layer
ynag berbeda untuk tiap layer. Layer pertama dengan komposisi 15 % agar, vogel Bonner salt,
dan glukosa sedangkan untuk layer yang kedua komposisinya adalah soft agar 0.8 %, kultur
E.coli dan triptofan 10 %. Prosedurnya adalah menyiakan 3 cawan petri yang telah berisi
meida layer pertama. Disiapkan 3 cawan petri yaitu, cawan pertama digunakan untuk kontrol
yang isinya akuades 300 mikrolit, Escherichia coli, soft agar, untuk cawan kedua berisi soft
agar dan Escherichia coli dan untuk cawan ketiga berisi soft agar, Escherichia coli, dan
triptofan 300 mikrolit, setelah itu disiapkan 3 tabung reaksi, dan peralatan yang dibutuhkan
seperti jarum ose, kultur bakteri dan media. Langkah yang dilakukan yaitu soft agar dibagi
menjadi 3 ml untuk setiap tabung reaksi dengan menggunakan pipet 5 ml, pada perlakuan
kontrol ditambahkan dengan 1 ose Escherichia coli yang diinokulasi dengan jarum ose dekat
api bunsen, kemudian ditambahkan dengan akuades steril 300 mikrolit dan dituangkan ke
cawan petri sebagai layer kedua. Setelah itu diputar-putar tujuannya agar media tidak

memadat. Tabung 2 yang berisi soft agar ditambahkan dengan E.coli dan dituangkan ke
cawan dua dan tabung tiga yang berisi soft agar ditabahakan dengan E.coli dan triptofan 300
mikrolit kemudian juga dituangkan ke cawan tiga. Ketiga cawan tersebut dibiarkan hingga
memadat dan diinkubasi dengan suhu 37℃ selama 48 jam untuk dimati. Selanjutnya dimati
pertumbuhan bakteri pada cawan tersebut.

BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisa Prosedur
Praktikum tentang Ames test ini bertujuan untuk mengetahui adanya senyawa
yang dapat menyebabkan mutagenic, senyawa mutagen ini dapat bersifat karsinogenik atau
menimbulkan kanker), bakteri uji yang digunakan biasanya Salmonella typhymuriam dan
E.coli. Bakteri Salmonella typhimarium menggunakan media spesifik histidin sedangkan pada
bakteri Escherichia coli menggunakan media triptofan. Bakteri jenis ini digunakan
dikarenakan karena bakteri-bakteri jenis ini dapat mengalami mutasi atau memiliki galur
mutan jika tidak diberi media yang sesuai, misalnya histidin dan triptofan. Ames test
dilakukan melalui tiga metode yaitu : Media 2 layer, Media Spot test, Keberadaan pigmen
warna merah. Pada praktikum kali ini digunakan metode media 2 layer, dengan komposisi
layer yang berbeda untuk tiap layer. Layer pertama dengan komposisi 15 % agar, vogel
Bonner salt, dan glukosa (karbohidrat dan garam-garaman) sedangkan untuk layer yang

kedua komposisinya adalah soft agar 0.8 %, kultur E.coli dan triptofan 10 %. Prosedurnya
adalah menyiakan 3 cawan petri yang telah berisi meida layer pertama. Disiapkan 3 cawan
petri yaitu, cawan pertama digunakan untuk kontrol yang isinya akuades 300 mikrolit, E. coli,
soft agar, untuk cawan kedua berisi soft agar dan Ecoli dan untuk cawan ketiga berisi soft
agar, Ecoli, dan triptofan 300 mikrolit. Agar digunakan untuk penyedia nutrisi bagi bakteri,
sedangkan triptofan yang memungkinkan terjadinya metabolisme secara kimia. Setelah itu
disiapkan 3 tabung reaksi, dan peralatan yang dibutuhkan seperti jarum ose, kultur bakteri dan
media. Langkah yang dilakukan yaitu soft agar dibagi menjadi 3 ml untuk setiap tabung
reaksi dengan menggunakan pipet 5 ml, pada perlakuan kontrol ditambahkan dengan 1 ose
E.coli yang diinokulasi dengan jarum ose dekat api bunsen, tujuannya agar tetap steril
kemudian ditambahkan dengan akuades steril 300 mikrolit dan dituangkan ke cawan petri
sebagai layer kedua. Setelah itu diputar-putar tujuannya agar media tidak memadat. Perlakuan
ini harus dilakukan secara karena digunakan soft agar. Tabung 2 yang berisi soft agar
ditambahkan dengan Escherichia coli dan dituangkan ke cawan dua dan tabung tiga yang
berisi soft agar ditabahakan dengan Escherichia coli dan triptofan 300 mikrolit kemudian juga
dituangkan ke cawan titermasuk salah satu asam amino. Triptofan yang digunakan tidak boleh
terkena cahaya, karena Ketiga cawan tersebut dibiarkan hingga memadat dan diinkubasi
dengan suhu 37℃ selama 48 jam untuk dimati. Selanjutnya dimati pertumbuhan bakteri pada
cawan tersebut.

4.2 Analisa Hasil
Beradasarkan uji ames test yang dilakukan, dihasilkan uji amest test positif, dimana
Escherichia coli dapat mengalami mutasi dan dapat hidup pada media kontrol yang berisi
aquades steril dan soft agar. Escherichia coli dapat hidup pada media yang tanpa ada asam
amino triptofan walaupun dalam jumlah sedikit, hal ini menandakan bahwa bakteri dapat
mengalami mutasi, sehingga dapat tumbuh. Uji ditunjukkan dengan hasil positif dilihat
dengan banyaknya atau jumlah koloni revertan dari setiap bakteri pada masing-masing cawan
kontrol negatif, cawan kedua, dan cawan ketiga yang ditambah tryptofan. Bakteri Escherichia
coli memanfaatkan galur mutan, sehingga bakteri ini dapat hidup pada media yang berisi
aquadest steril dan soft agar. Soft agar disini difungsikan sebagai sumber nutrisi bagi bakteri.
Uji mutagenesitas dilakukan dengan sistem mutasi balik menggunakan galur bakteri uji yang
telah dimutasikan dengan cara pergeseran kerangka dan perubahan pasangan basa DNA,
untuk mendeteksi kemungkinan adanya efek mutagenik pada simplisia yang diuji. Hasil
dikatakan positif jika bakteri dapat tumbuh, Namun, jika sampel terus berkembang, hal ini
menandakan bahwa bakteri tidak lagi tergantung pada kehadiran enzim untuk tumbuh. Hal ini
berarti bahwa bakteri telah bermutasi. Dalam hal ini, jika uji Ames telah menghasilkan hasil
yang positif. Tetapi , bukan berarti bahwa bahan kimia yang diuji menyebabkan kanker pada
manusia. Belum sepenuhnya benar. Hal ini hanya untuk menunjukan bahwa zat kimia tersebut
perlu diteliti ulang apakah karsinogenik atau tidak, sebagaimana yan ditunjukkan pada
perlakuan kontrol, bahwa bakteri yang tumbuh hanya sedikit.

Gambar 4. Perlakuan Kontrol
Pada perlakuan dengan asam amino triptofan menunjukkan pertumbuhan
bakteri yang pesat, Karena mutan bakteri Escherichia coli dapat tumbuh pada medium dengan
asam amino triptofan, dalam medium lain tidak dapat tumbuh dikarenakan tidak dapat
membuat asam amino sendiri melaui jalur biosintetis. Mutan sejenis ini dinamakan mutan
auxotroph, dimana pada mutan tersebut hanya dapat tumbuh pada media dengan penambahan
triptofan. Mutan auxotroph yang disebut mutan histidine- dependent or his-. Mutan jenis ini
tidak dapat melakukan sintesis molekul organic yang diperlukan bagi pertumbuhan bakteri
(Hayes, 1984). Escherichia coli menyintesis asam amino triptofan dari molekul prekursor
dalam jalur multi langkah. Setiap reaksi dalam jalur itu di katalisis oleh enzim spesifik, dan
kelima gen yang mengodekan sub unit enzim enzim ini tergugus bersama pada kromosom
bakteri. Hasil ini sesuai dengan gambar yang ditunjukkan warna merah, Escherichia coli
merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk basil, sehingga akan muncul warna merah
saat pewarnaan gram. Hal ini sebagaimana ditunjukkan pada gambar dibawah ini :

Gambar 5. Escherichia coli dalam Triptofan
Uji mutagenisitas bertujuan untuk mengetahui apakah suatu bahan uji bersifat
mutagen. Prinsip dari uji ini adalah bakteri yang digunakan sudah dimutasi sehingga tidak
mampu mensintesa salah satu jenis asam amino esensial misalnya histidin dan triptofan untuk
pertumbuhannya. Bakteri uji yang akan digunakan untuk uji Ames harus mempunyai sifat
genotip yang telah disyaratkan. Konfirmasi sifat genotip ini harus dilakukan segera setelah
menerima biakan, pada saat revertan spontan percawan terletak diluar di luar rentang normal
dan bila bakteri-bakteri tersebut kehilangan sensitivitas terhadap mutagen (Maron dan Ames,
1983, Rustini dkk, 2002).

Gambar 6. Perlakuan Escherichia coli dalam soft agar

BAB IV
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa ames test adalah
salah satu uji yang digunakan untuk menguji senyawa yang bersifat mutagenik terhadap
bakteri, senyawa mutagenik akan dapat berubah menjadi karsinogenik atau zat yang dapat
menyebabkan kanker. Uji ames test ini sering menggunakan bakteri Escherichia coli yang
tidak bisa hidup tanpa asam amino triptofan. Hasil menunjukkan bakteri ini dapat hidup
dengan baik pada media dengan asam amino triptofan artinya bakteri tersebut mutan, dan
dalam cawan lainnya yang menggunakan soft agar dan akuades hanya ditemukan dalam
jumlah sedikit.

5.2 Saran
Praktikum selanjutnya diharapkan untuk praktikum semacam demo ini hendaknya
semua praktikan mencatat dan di tempat dimana semua praktikan dapat mengamati langkahlangkah yang dilakukan.

DAFTAR PUSTAKA

Ames, B.N., J.Mc Can and Yamasaki, E. 1975. Methods for Detection Carcinogens and
Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation
Res., 31.
Hayes, A.W, 1984, (ED), Principles and Methods of Toxicology, Raven Press, Book ltd, New
York.
Isnawati, Ani, Sri Endreswari, Pudjiastuti, Murhandini. 2002. Efek Mutagen Ekstrak Etanol
Buah Cabe Jawa (Piper Retrofractum Vahl.). Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN
1412-2855 Vol. 1, No. 2, Juli 2002
Langlais, Bruno. 2002. Ozone In Water Treatment Application And Engineering. New York :
Lewis Publisher.
Mortelmans K, Zeiger E. 1994. The Salmonella / Microsoome Mutagenity assay. Mutat Res.
2000. Nov 20; 455 (1-2) : 29-60