Isolasi Dan Penetapan Kapasitas Antioksidan Hemiselulosa Sekam Padi (Oryza Sativa) Secara In Vitro

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sekam Padi

Sekam Padi merupakan lapisan keras yang meliputi kariopsis yang

terdiri dari dua belahan yang disebut lemma dan palea yang saling bertautan. Pada proses penggilingan beras sekam padi akan terpisah dari butir beras dan menjadi bahan sisa atau limbah penggilingan. Sekam padi dikategorikan sebagai biomassa yang dapat digunakan untuk berbagai kebutuhan seperti bahan baku industri, pakan ternak dan energi atau bahan bakar. Dari proses penggilingan padi biasanya diperoleh sekam padi sekitar 20-30%, dedak antara 8-12% dan beras gilingan antara 50-63,5% dari bobot awal gabah. Sekam padi dengan persentase yang tinggi tersebut dapat menimbulkan masalah lingkungan (Anonim, 2010).

2.2 Hemiselulosa

Indonesia merupakan negara pertanian sebagai penghasil beras, jagung, tebu dan kakao. Dalam proses pengolahan hasil pertanian, selain dihasilkan bagian yang bermanfaat, tetapi juga menghasilkan produk ikutan (by product) yang merupakan Non-Starch Polysaccarides (NSP), yang jumlahnya 30-50% dari keseluruhan proses pengolahan hasil pertanian (Caprita, et al., 2010).

Polisakarida sebagai Non-Starch Polysaccarides (NSP) ditemukan pada bahan makanan yang berasal dari tumbuhan. Sebagai polimer alam, biopolimer

polisakarida merupakan sumber daya terbarukan (renewable sources) yang senantiasa dihasilkan dengan formasi tahunan, dari berbagai jenis tanaman, disintesis oleh energi matahari dan sepenuhnya terurai di keadaan asli (Caprita, et al., 2010).

Komponen yang terbesar dari NSP adalah serat, terdiri dari komponen hetero polisakarida dan non polisakarida antara lain selulosa (20-35%), hemiselulosa (20-35%), pektin, alginate dan lignin (10-25%). Dengan melakukan proses ekstraksi dan fraksinasi yang cermat terhadap biomassa produk ikatan ini dapat menghasilkan berbagai bahan, yang dapat dikonversi menjadi produk bernilai tinggi (Karaaslan, dkk., 2010).

Beberapa hemiselulosa dari tanaman dan tumbuhan yang lebih tinggi merupakan polisakarida sumber potensial untuk perkembangan farmakologi (Saha, 2003).

Hemiselulosa merupakan polisakarida dimana monomer penyusun hemiselulosa biasanya adalah rantai D-glukosa, ditambah dengan berbagai bentuk monosakarida yang terikat pada rantai, baik sebagai cabang atau mata rantai, seperti D-mannosa, D-galaktosa, D-fruktosa, dan pentosa-pentosa seperti D-xilosa dan L-arabinosa yang merupakan gula pereduksi (Melo, et al., 2012)

Gula pereduksi adalah gula yang mempunyai kemampuan untuk mereduksi. Sifat mereduksi ini disebabkan adanya gugus hidroksi yang bebas dan reaktif. Monosakarida yang mengandung gugus aldehid dan gugus keton

dapat mereduksi senyawa-senyawa pengoksidasi seperti ferisianida, hydrogen peroksida dan ion kupro (Lingga, 2012).

2.3 Antioksidan

Antioksidan adalah senyawa yang mempunyai struktur molekul yang dapat memberikan elektronnya kepada molekul radikal bebas tanpa terganggu sama sekali dan dapat memutus reaksi berantai dari radikal bebas Radikal bebas adalah atom atau senyawa yang kehilangan pasangan elektronnya (Kumalaningsih, 2006).

Antioksidan dapat berupa enzim (misalnya superoksida dismutase, katalase dan glutation peroksidase), vitamin-vitamin (seperti vitamin E, vitamin C, vitamin A dan beta karoten), ataupun senyawa lain (misalnya flavonoid, albumin, bilirubin, seruloplasmin dan lain-lain). Antioksidan enzimatis merupakan pertahanan utama (primer) terhadap kondisi stress oksidatif (Winarsi, 2007).

Menurut Kosasih, dkk. (2004), berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan dapat dibagi dalam tiga kelompok, yaitu antioksidan primer, antioksidan sekunder dan antioksidan tersier.

1. Antioksidan primer bekerja dengan mencegah terbentuknya senyawa radikal bebas baru. Ia mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang berkurang dampak negatifnya, sebelum radikal bebas ini sempat bereaksi. Contoh antioksidan primer adalah SOD (Superoxide Dismustase), GPx (Gluthathion peroksidase) dan enzim katalase.

2. Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa serta mencegah terjadinya reaksi berantai. Contoh antioksidan sekunder : vitamin E, vitamin C, betakaroten, asam urat, bilirubin dan albumin.

3. Antioksidan tersier bekerja dengan cara memperbaiki kerusakan sel-sel dan jaringan yang disebabkan radikal bebas. Contoh enzim yang memperbaiki DNA pada inti sel adalah metionin sulfooksidan reduktase. Adanya enzim-enzim perbaikan DNA ini berguna untuk mencegah penyakit misalnya kanker.

2.4 Mekanisme Kerja Antioksidan

Mekanisme kerja antioksidan secara umum adalah menghambat oksidasi lemak. Menurut Antolovich, et al. (2002), oksidasi lemak terdiri dari beberapa tahap, yaitu inisiasi, propagasi, branching dan terminasi.

1. Inisiasi: LH + R*  L* + RH

Dimana LH merupakan molekul substrat, contohnya lipid, dan R* merupakan radikal pengoksidasi. Oksidasi lipid menghasilkan radikal asam lemak yang sangat reaktif (L*) yang dapat dengan cepat bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksil lipid (LOO*).

2. Propagasi: L* + O2  LOO*

LOO* + LH  L* + LOOH

Radikal peroksil adalah pembawa rantai yang dapat mengoksidasi lipid lebih jauh, menghasilkan hidroperoksid lipid (LOOH).

3. Branching: LOOH  LO* + HO*

2LOOH  LOO* + LO* + H2O

Pemecahan dari hidroperoksid lipid melibatkan katalis ion logam transisi. Tahap ini akan menghasilkan peroksil lipid dan alkoksi lipid radikal. 4. Terminasi: LO* + LO*  produk non radikal

LOO* + LOO*  produk non radikal LO* + LOO*  produk non radikal

Reaksi terminasi mencakup penggabungan radikal-radikal membentuk produk non radikal.

2.5 Metode Fosfomolibdenum

Metode ini didasarkan pada proses reduksi dari Mo (VI) menjadi Mo (V) oleh antioksidan sehingga dapat membentuk kompleks fosfat/Mo(V) yang berwarna hijau. Untuk sampel yang tidak diketahui komposisinya, kapasitas

antioksidan dapat dinyatakan sebagai ekivalensi α-tokoferol atau asam askorbat (Melo, et al., 2012)

2.6 Spektrofotometer Infra Merah

Cahaya tampak terdiri dari beberapa frekuensi elektromagnetik monokromatis yang berbeda dimana setiap frekuensi bisa dilihat sebagai warna yang berbeda. Radiasi inframerah juga mengandung beberapa range frekuensi tetapi tidak dapat dilihat oleh mata. Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada cahaya daerah inframerah (mid- infrared) yaitu pada panjang

gelombang 2,5- 50 µm atau bilangan gelombang 4000- 200 cm-1. Energi yang dihasilkan oleh radiasi ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Pita absorbansi inframerah sangat khas dan spesifik untuk setiap tipe ikatan kimia atau gugus fungsi. Metode ini sangat berguna mengindentifikasi senyawa organik. Sebagai sumber cahaya yang umum digunakan adalah lampu tungsten, Nerst glowers (Dachriyanus, 2004)

2.7 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detector yang sangat sensitif dan beragam sehingga mampe menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995).

2.8 Spektrofotometri Sinar Tampak

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang mempelajari interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Spektrofotometri serapan sinar tampak dan ultraviolet memanfaatkan sinar dengan panjang gelombang 400-700 nm untuk daerah sinar tampak dan 100-400 nm untuk daerah sinar UV. Bila suatu zat dikenai radiasi maka zat akan menyerap radiasi tersebut untuk berbagai keperluan. Suatu zat dapat menyerap berbagai panjang gelombang suatu radiasi. Sudah tentu tidak

seluruh radiasi yang mengenai zat tersebut akan diserap, sebagian diteruskan atau ditransmisikan. Spektrum absorpsi merupakan gambaran hubungan antara panjang gelombang sinar yang mengenai suatu zat dengan besarnya serapan sinar pada panjang gelombang tersebut oleh zat yang bersangkutan. Pengukuran absorpsi radiasi UV-Vis oleh spesi larutan dapat digunakan sebagai metode analisis kuantitatif (Khopkar, 1998).

Menurut Gandjar dan Rohman (2007), ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna.Berikut adalah tahapan-tahapan yang perlu diperhatikan:

a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis

Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubahnya menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu:

- Reaksinya selektif dan sensitif

- Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel - Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama b. Pemilihan Panjang Gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih

panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.

Ada beberapa alasan mengapa pengukuran harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu:

- Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar

- Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kutva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi

- Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal

c. Waktu Operasional (Operating time)

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.

d. Pembuatan kurva baku

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi (x).

e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan

Absorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik).

2.9 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis adalah sebagai berikut:

a. Kecermatan

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita, 2004).

Menurut Ermer (2005), rentang persen perolehan kembali memenuhi syarat jika nilai persen perolehan kembali berada pada rentang 80% -120%. b. Keseksamaan (presisi)

Keseksamaan atau presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Keseksamaan atau presisi merupakan ukuran yang

menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukan adanya keseksamaan metode yang dilakukan (Harmita, 2004).

c. Sensitivitas

Sensitivitas merupakan kemampuan untuk membedakan dua konsentrasi yang berbeda dan ditentukan dengan kemiringan dari kurva kalibrasi (Christian, 2004).

d. Linearitas dan rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon baik secara langsung maupun dengan bantuan transformasi matematika, menghasilkan suatu hubungan yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang merupakan batas terendah dan batas tertinggi analit yang dapat ditetapkan secara cermat, seksama dan dalam linearitas yang dapat diterima (Harmita, 2004).

e. Batas deteksi

Batas deteksi merupakan tingkat konsentrasi terendah yang dapat dikatakan secara statistic berbeda dari blanko (Christian, 2004).

f. Batas Kuantitasi

Batas kuantitasi merupakan konsentrasi terendah yang dapat diukur di dalam matriks sampel pada tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima (Christian, 2004).

3. Branching: LOOH  LO* + HO*

2LOOH  LOO* + LO* + H2O

Pemecahan dari hidroperoksid lipid melibatkan katalis ion logam transisi. Tahap ini akan menghasilkan peroksil lipid dan alkoksi lipid radikal. 4. Terminasi: LO* + LO*  produk non radikal

LOO* + LOO*  produk non radikal LO* + LOO*  produk non radikal

Reaksi terminasi mencakup penggabungan radikal-radikal membentuk produk non radikal.

2.5 Metode Fosfomolibdenum

Metode ini didasarkan pada proses reduksi dari Mo (VI) menjadi Mo (V) oleh antioksidan sehingga dapat membentuk kompleks fosfat/Mo(V) yang berwarna hijau. Untuk sampel yang tidak diketahui komposisinya, kapasitas

antioksidan dapat dinyatakan sebagai ekivalensi α-tokoferol atau asam askorbat (Melo, et al., 2012)

2.6 Spektrofotometer Infra Merah

Cahaya tampak terdiri dari beberapa frekuensi elektromagnetik monokromatis yang berbeda dimana setiap frekuensi bisa dilihat sebagai warna yang berbeda. Radiasi inframerah juga mengandung beberapa range frekuensi tetapi tidak dapat dilihat oleh mata. Pengukuran pada spektrum inframerah dilakukan pada cahaya daerah inframerah (mid- infrared) yaitu pada panjang

gelombang 2,5- 50 µm atau bilangan gelombang 4000- 200 cm-1. Energi yang dihasilkan oleh radiasi ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Pita absorbansi inframerah sangat khas dan spesifik untuk setiap tipe ikatan kimia atau gugus fungsi. Metode ini sangat berguna mengindentifikasi senyawa organik. Sebagai sumber cahaya yang umum digunakan adalah lampu tungsten, Nerst glowers (Dachriyanus, 2004)

2.7 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi karena didukung oleh kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detector yang sangat sensitif dan beragam sehingga mampe menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif maupun kuantitatif, baik dalam komponen tunggal maupun campuran (Ditjen POM, 1995).

2.8 Spektrofotometri Sinar Tampak

Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis yang mempelajari interaksi antara materi dengan radiasi elektromagnetik. Spektrofotometri serapan sinar tampak dan ultraviolet memanfaatkan sinar dengan panjang gelombang 400-700 nm untuk daerah sinar tampak dan 100-400 nm untuk daerah sinar UV. Bila suatu zat dikenai radiasi maka zat akan menyerap radiasi tersebut untuk berbagai keperluan. Suatu zat dapat menyerap berbagai panjang gelombang suatu radiasi. Sudah tentu tidak

seluruh radiasi yang mengenai zat tersebut akan diserap, sebagian diteruskan atau ditransmisikan. Spektrum absorpsi merupakan gambaran hubungan antara panjang gelombang sinar yang mengenai suatu zat dengan besarnya serapan sinar pada panjang gelombang tersebut oleh zat yang bersangkutan. Pengukuran absorpsi radiasi UV-Vis oleh spesi larutan dapat digunakan sebagai metode analisis kuantitatif (Khopkar, 1998).

Menurut Gandjar dan Rohman (2007), ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri UV-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang berwarna.Berikut adalah tahapan-tahapan yang perlu diperhatikan:

a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis

Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubahnya menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu:

- Reaksinya selektif dan sensitif

- Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel - Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama b. Pemilihan Panjang Gelombang

Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih

panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada konsentrasi tertentu.

Ada beberapa alasan mengapa pengukuran harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu:

- Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar

- Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kutva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi

- Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal

c. Waktu Operasional (Operating time)

Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi larutan.

d. Pembuatan kurva baku

Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi (x).

e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan

Absorban yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometrik).

2.9 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis adalah sebagai berikut:

a. Kecermatan

Kecermatan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan (Harmita, 2004).

Menurut Ermer (2005), rentang persen perolehan kembali memenuhi syarat jika nilai persen perolehan kembali berada pada rentang 80% -120%. b. Keseksamaan (presisi)

Keseksamaan atau presisi diukur sebagai simpangan baku relatif atau koefisien variasi. Keseksamaan atau presisi merupakan ukuran yang

menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Nilai simpangan baku relatif yang memenuhi persyaratan menunjukan adanya keseksamaan metode yang dilakukan (Harmita, 2004).

c. Sensitivitas

Sensitivitas merupakan kemampuan untuk membedakan dua konsentrasi yang berbeda dan ditentukan dengan kemiringan dari kurva kalibrasi (Christian, 2004).

d. Linearitas dan rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon baik secara langsung maupun dengan bantuan transformasi matematika, menghasilkan suatu hubungan yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang merupakan batas terendah dan batas tertinggi analit yang dapat ditetapkan secara cermat, seksama dan dalam linearitas yang dapat diterima (Harmita, 2004).

e. Batas deteksi

Batas deteksi merupakan tingkat konsentrasi terendah yang dapat dikatakan secara statistic berbeda dari blanko (Christian, 2004).

f. Batas Kuantitasi

Batas kuantitasi merupakan konsentrasi terendah yang dapat diukur di dalam matriks sampel pada tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima (Christian, 2004).