Deteksi Komposisi Senyawa Polyisoprenoid Pada Organ Vegetatif Tiga Jenis Mangrove Ikutan Chapter III V
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September sampai Maret 2017.
Sampel dikumpulkan dari kawasan hutan mangrove Desa Lubuk Kertang,
Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Isolasi lipid dari setiap sampel dilakukan di
Laboratorium PT. Socfin Indonesia, analisis kromatografi lapis tipis (Thin Layer
Chromatography) dan polyisoprenoid dilakukan di Laboratorium Fitokimia,
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, dan Laboratorium Budidaya Hutan
Fakultas Kehutanan, Universitas Sumatera Utara, Medan.
Alat dan Bahan
Alat
yang
digunakan
dalam
pelaksanaan
penelitian
ini
yaitu
cutter dan gunting untuk memotong sampel menjadi bagian-bagian kecil, grinding
machiene (Foss) untuk menghaluskan sampel, oven, inkubator, desikator,
timbangan analitik, macropipettes (5-20 ml), micropippetes (5-200 µl), chamber,
bar magnetik, TLC plates, TLC cutter, botol kocok, botol serum, corong, spatula,
kamera, alat tulis, kantong plastik, aluminium foil, label name, silica gel dan
amplop sampel.
Bahan yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini yaitu bagian
organ vegetatif berupa akar dan daun R. communis, bagian akar dan daun
M. candidum, dan akar dan daun B. asiatica. Sedangkan bahan kimia yang
digunakan adalah, kloroform, metanol, aquades, etanol, KOH, heksan, toluen, etil
asetat, aseton, polyisoprenoid Std, dan uap yodium.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur Penelitian
Koleksi Sample
Daun dan akar tiga spesies mangrove dikumpulkan dari daerah
Desa Lubuk Kertang, Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Daun dan akar (sekitar
4-5 gram berat basah) dikumpulkan pada bulan September 2016. Tiga spesies
mangrove yang daun dan akar nya dikumpulkan adalah R. communis,
M. candidum, dan B. asiatica. Usia daun diperkirakan berumur 2-6 bulan.
Tumbuhan mangrove yang dikoleksi tumbuh dengan paparan sinar matahari
alami. Semua sampel segar disimpan dilemari es sebelum digunakan.
Ektraksi Lipid
Daun atau akar (masing-masing dengan berat 2 gram berat kering
diekstrak dengan klorofom/methanol (CHCL3/CH3OH; berdasarkan volume 2:1).
Kemudian diinkubasi pada suhu 40 ºC selama 24 jam. Dinding sel yang berisi
ekstrak dalam CM21 disaring dengan kertas filtrasi No. 2 (Advantec, Tokyo,
Jepang) dan yang tersisa adalah ekstrak lipid di dalam kloroform. Sebagian
ekstrak dimurnikan untuk dianalisis kandungan lipidnya seperti yang digambarkan
sebelumnya (Basyuni et al. 2007). Cairan ekstrak lipid yang pekat dikeringkan
kemudian ditimbang dan di dapatkan berat lipidnya. Sehingga dapat diketahui
kandungan total lipid/jaringan (mg/g jaringan).
Saponifikasi
Ekstrak lipid dari daun dan akar disaponifikasi pada suhu 65 ºC selama 24
jam dengan perbandingan :
Universitas Sumatera Utara
2ml air (water)
x sampel
2ml ethanol
x sampel
0,45 KOH
x sampel
Setelah 24 jam
di inkubasi di waterbath, sampel dikeringkan dengan oven
bersuhu 50-55 ºC sampai sampel benar-benar kering.
Bahan kimia
Dolichol dari hati babi diperoleh dari Sigma. Campuran standar senyawa
dolichol (C90-C105) diisolasi dari testis kuda dan campuran polyprenol (C90-C100)
dari Malus sp (Swiezewska & Danikiewicz 2005). Standar dolichol (C95-C110)
berasal dari cakalang hati tuna (Ishiguro et al. 2014). Bombiprenone (C43)
dimurnikan dengan kromatografi silika gel NSL dari CHCL3/CH3OH (2:1)
berasal dari ekstrak daun kering Perilla dan fraksi yang sudah dimurnikan
dikonfirmasi dengan memiliki nilai m/z [M + Na].
Analisis dengan dua dimensi kromatografi lapis tipis
Dimensi pertama TLC dilakukan selama 60 menit diatas silika gel (20 x 3
cm) dengan sistem pelarut toluen-etil asetat (9:1), seperti yang dijelaskan oleh
(Sagami et al. 1992). Dalam analisis TLC, famili polyprenol bergerak sedikit
lebih cepat dari famili dolichol. Tepi longitudinal dari dimensi pertama TLC
dengan lebar 1 cm dan zona konsentrasi dari fase reverse C-18 TLC yang dijepit
dengan cara menggunakan dua bar magnetik (4,0 x 1,1 x 0,8 cm) dengan
mengahadap setiap fase gel. Plat TLC yang terikat kemudian dikembangkan tegak
lurus ke dimensi pertama untuk mentransfer polyprenol dan dolichol ke zona
konsentrasi fase reverse TLC.
Universitas Sumatera Utara
Dimensi kedua fase reverse RP-18 silika gel TLC dilakukan dengan
pelarut aseton selama sekitar 30 menit. Posisi polyisoprenoid alkohol dipisahkan
dan dikembangkan dengan uap yodium (iodine vapor). Gambar kromatografi
yang diperoleh dan discan digital dengan seri printer Canon E400. Konsentrasi
polyprenol dan dolichol terdeteksi pada HPTLC RP-18 diukur menggunakan
ImageJ 1.46r (Schneider et al. 2012) dengan standar dolichol dan polyprenol
sebagai acuan.
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil Polyisoprenoid di Mangrove Ikutan
Penelitian dilakukan untuk menganalisis kandungan dan kuantifikasi
senyawa polyisoprenoid pada organ vegetatif tiga jenis mangrove ikutan. Dari
hasil ekstraksi daun dan akar R. communis, M. candidum, dan B. asiatica.
diperoleh total lipid dolichol dan polyprenol. Hasil ekstraksi yang diperoleh
terlihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Total lipid dan pembagian nilai dolichol dan polyprenol pada daun dan
R. communis, M. candidum, dan B. asiatica.
akar
Typ
Lipid
Jari
Dolicho
total
Jenis
% in total lipid
% in polyisoprenoid
e
Polyisopreno Polypreno
nga
ls
(mg/g
id (mg/g dw) ls (mg/g)
n
Polyisopreno Polypreno Dolicho Polypreno Dolicho
(mg/g)
dw)
id
ls
ls
ls
ls
Dau
629,5
B. asiatica
132,6
11,2
121,3
21,1
1,8
19,3
8,4
91,5
I
140,3
95,3
45,1
23,1
15,7
7,4
67,9
32,1
II
20,4
20,4
nd
2,4
2,4
nd
100,0
nd
III
46,8
nd
46,8
7,9
nd
7,9
nd
100,0
I
33,8
14,8
19
6,4
2,8
3,6
43,8
56,2
II
31,1
nd
31,1
5,8
nd
5,8
nd
100,0
I
n
M.
candidum
R.
communis
Dau 606,8±63
n
,9
Dau 860,6±14
n
,6
Aka
595,0
B. asiatica
r
M.
candidum
R.
communis
Aka 528,4±1,
r
90
Aka 534,1±11
r
,9
nd = not detected/ tidak terdeteksi.
Penyebaran polyprenol dan dolichol dengan panjang rantai karbon dari
setiap famili disajikan pada Tabel 1. Dari Tabel 1 dapat dilihat total lipid dan nilai
Universitas Sumatera Utara
dari polyprenol dan dolichol dari masing-masing jaringan daun dan akar dari tiga
jenis mangrove ikutan. Total lipid dinyatakan sebagai perkiraan gravimetri fraksi
lipid. Berdasarkan Tabel 1, total lipid pada jaringan daun berkisar dari 606,5
sampai 860,6 mg/g dengan total lipid terkecil terdapat pada daun M. candidum
(606,5 mg/g) dan yang terbesar pada R. communis (860,6 mg/g), sedangkan total
lipid pada jaringan akar berkisar dari 528,4 sampai 595,0 mg/g dengan total lipid
terkecil ditemukan pada akar M. candidum (528,4 mg/g) dan total lipid terbesar
pada B. asiatica (595,0 mg/g). Jumlah polyisoprenoid terbesar pada jaringan daun
terdapat pada jaringan daun M. candidum (140,3 mg/g) dan pada jaringan akar
terdapat pada B. asiatica (46,8 mg/g), sedangkan nilai polyisoprenoid terkecil
terdapat pada jaringan daun dan akar R. communis masing-masing 20,4 mg/g dan
31,1 mg/g.
Basyuni et al. (2016) membagi polyprenol dan dolichol pada daun dan
akar kedalam tiga tipe (I, II, III). Tipe-I terdapat dominasi dolichol lebih dari 90%,
tipe-II mengandung kedua senyawa polyprenol dan dolichol pada jaringan
tumbuhan, sedangkan tipe-III dominasi senyawa polyprenol lebih dari 90%. Pada
jaringan daun dan akar ketiga jenis mangrove ikutan, dapat ditemukan ketiga tipe
diatas sedangkan pada jaringan akar dari ketiga jenis mangrove ikutan terbagi ke
dalam tipe-I dan II. Sama dengan pengamatan sebelumnya yaitu pada daun
mangrove Okinawa, tipe-I, II dan III juga ditemukan pada jaringan daun dan pada
pengematan
akar
mangrove
juga
hanya
ditemukan
tipe-I
dan
II
(Basyuni et al. 2016). Namun, hasil yang konsisten didapatkan pada tiga akar
mangrove ikutan yang menunjukkan bahwa dolichol lebih berlimpah daripada
Universitas Sumatera Utara
polyprenol, sama dengan penelitian sebelumnya yang menemukan hal serupa pada
akar mangrove di Okinawa (Basyuni et al. 2016).
Daun dan akar B. asiatica dan akar R. communis masuk ke dalam tipe-I.
Sedangkan daun dan akar M. candidum termasuk kedalam tipe-II, dapat dilihat
jumlah polyprenol dengan panjang rantai yang mirip dengan dolichol ditemukan
pada dua jaringan ini (Gambar 2B dan 2E). Pada tipe-III, penemuan polyprenol
lebih dari 90%, yang juga sama dengan pengamatan saat penelitian pada
mangrove Okinawa (Basyuni et al. 2016), seperti yang ditunjukkan pada jaringan
daun R. communis yang termasuk kedalam tipe-III, karena pada jaringan ini hanya
ditemukan 100% polyprenol. Distribusi dari dominasi polyprenol lebih dari pada
dolichol, dan sama dengan tipe-III pada daun tidak terlihat pada jaringan akar dari
tiga jenis mangrove ikutan.
Pada jaringan akar dan daun R. communis dapat dilihat perbedaan rantai
panjang senyawa polyisoprenoid, meskipun pada jaringan daun dan akar
B. asiatica serta daun dan akar M. candidum ditemukan dolichol dan polyprenol,
namun terdapat perbedaan konsentrasi dolichol dan polyprenol (Gambar 2), hal ini
diduga karena perbedaan umur pada jaringan dan perbedaan lingkungan dari
masing-masing jenis. Hal ini sesuai dengan pernyataan Tateyama et al. (1999)
yang menyatakan distribusi rantai panjang polyprenol belum tentu sama dengan
rantai panjang dolichol di jaringan yang sama, hal ini juga didukung pernyataan
Suga et al. (1989) yang menyatakan konsentrasi polyisoprenoid pada tanaman
mengalami perubahan yang disebabkan oleh perbedaan umur dan juga musim.
Selain itu perbedaan konsentrasi dolichol dan polyprenol akan meningkat disetiap
Universitas Sumatera Utara
jaringan tanaman dengan pertambahan umur dan dengan meningkatmya cekaman
lingkungan (Swiezewska & Danikiewiez 2005).
Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Kandungan senyawa polyisoprenoid dari tiga jenis mangrove ikutan
dianalisis menggunakan metode kromatografi lapis tipis (Sagami et al. 1992,
Basyuni et al. 2016) dapat dilihat pada Gambar 2. Polyisoprenoid dengan rantai
panjang yang berbeda dipisahkan menjadi famili polyprenols dan dolichol.
Sedangkan Tabel 2 menjelaskan tentang penyebaran polyprenols dan dolichols
dengan panjang rantai karbon dari setiap famili.
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Gambar 2. Analisis dua dimensi kromatografi dari daun B. asiatica (A),
daun M. candidum (B), daun R. communis (C), akar B. asiatica (D),
akar M. candidum (E), dan akar R. communis (F).
Identifikasi rantai panjang polyisoprenoid dari tiga jenis mangrove ikutan
pada daun dan akar menggunakan metode analisis kromatografi lapis tipis
(Sagami et al. 1992, Basyuni et al. 2016) untuk memisahkan dolichol dan
Universitas Sumatera Utara
polyprenol. Analisis polyisoprenoid pada jaringan daun dari tiga jenis mangrove
ikutan menunjukkan bahwa tipe-II lebih mendominasi dari pada hanya ditemukan
salah satu senyawa polyprenol atau dolichol. Pengamatan ini berlawanan dengan
daun dan akar pada hutan mangrove bahwa mayoritas polyisoprenoid alkoholnya
adalah dolichol daripada polyprenol. Berdasarkan hasil dari analisis kromatografi
lapis tipis dari polyisoprenoid dari jaringan daun dan akar B. asiatica, daun dan
akar M. candidum dan akar R. communis ditemukan dolichol dengan panjang
rantai masing C55-C140, C75-C100, C50-C115, C75-C90, dan C80-C90 (Tabel 2).
Dengan metode yang sama ditemukan juga senyawa polyisoprenoid
polyprenol pada jaringan daun B. asiatica, daun dan akar M. candidum, dan
jaringan daun R. communis dengan masing-masing panjang rantai C80-C95, C45C140, C80-C90 dan C60-C65 (Tabel 2). Menariknya, pada jaringan daun R. communis
tampak berbeda dengan yang lain, karena bahwa pada spesies ini hanya
mengandung rantai pendek polyprenol (C80-C90) sedangkan rantai panjang
dolichol dan polyprenol tidak terdeteksi. Penemuan ini serupa dengan penelitian
pada famili dari Euphorbiaceae, Lauraceae, Magnoliaceae, dan Moraceae
(Jankowski et al. 1994; Swiezewska et al. 1994; Marczewski et al. 2007)
Pada daun B. asiatica, rantai karbon pada dolichol ditemukan lebih
panjang (>C100 atau lebih) daripada polyprenol (C80-C95) (Gambar 2A dan 2B),
sedangkan pada akar M. candidum (Gambar 2E) rantai karbon dolichol dan
polyprenol tidak jauh berbeda meskipun sedikit lebih panjang pada rantai karbon
dolichol (C75-C90) dari polyprenol (C80-C90). Namun bagaimanapun, rantai karbon
dolichol yang ditemukan pada jaringan daun menujukkan bahwa hasil yang
didapat sedikit berbeda dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya
Universitas Sumatera Utara
(Skoczylas et al. 1994), yaitu dolichol tidak ditemukan pada jaringan daun,
sedangkan
pada
jaringan
daun
L.
racemosa
di
mangrove
Okinawa
(Basyuni et al. 2016) ditemukan dolichol. Perbedaan yang ada ini mungkin
disebabkan karena perbedaan usia pada daun dan kondisi lingkungannya.
Pengamatan ini menunjukkan bahwa jalur biosintesis dari polyprenol rantai
pendek, polyprenol rantai menengah, polyprenol rantai panjang dan dolichol yang
berbeda diatur dalam kerajaan tumbuhan, termasuk tumbuhan mangrove
(Chouda & Jankowski 2005).
Berbeda dengan daun M. candidum yang justru memperlihatkan panjang
rantai karbon polyprenol (>C100 atau lebih) ditemukan lebih panjang dibanding
dolichol (C50-C115) (Gambar 2B). Sedangkan pada daun R. communis (Gambar
2C), senyawa polyprenol 100% ditemukan dan tidak terdeteksi adanya senyawa
dolichol, hampir sama dengan akar B. asiatica dan akar R. communis yang 100%
ditemukan satu jenis senyawa, pada kedua jaringan tersebut hanya terdeteksi
senyawa dolichol dan tidak terdeteksi adanya polyprenol (Gambar 2D dan 2F).
Menurut Tateyama et al. (1999) bahwa rantai panjang dolichol bervariasi
pada setiap jaringan, bahkan pada spesies yang sama dan muncul untuk
membentuk famili yang berbeda dengan molekul spesies yang mendominasi.
Polyprenol juga terjadi menjadi satu atau dua keluarga polyprenol, khususnya
polyprenol tipe-fikaprenol (polyprenol rantai pendek) dan polyprenol rantai
panjang, tergantung pada tumbuhan dan jaringannya. Dua famili polyprenol
ditemukan pada daun M. candidun, temuan ini juga didukung dengan beberapa
penelitian sebelumnya pada dua famili polyprenol di jaringan daun tua dari
tumbuhan mangrove mayor K. obovata (Basyuni et al. 2016).
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2. Panjang rantai karbon pada pada daun dan akar R. communis, M.
candidum, dan B. asiatica.
Jenis
Jaringan
(C43)
B. asiatica
Daun
○
Polyprenol
Dolichol
80 85 90 95
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115
120 125 130 135 140 and more
M. candidum
Daun
○
45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115
120 125 130 135 140 and more
R. communis
Daun
B. asiatica
Akar
M. candidum
Akar
R. communis
Akar
60 65
75 80 85 90 95 100
80 85 90
75 80 85 90
80 85 90
Tabel 2 menggambarkan distribusi dolichol dan polyprenol pada masingmasing daun dan akar dari tiga jenis mangrove ikutan B. asiatica, M. candidum,
dan R. communis. Dolichol ditemukan disemua jaringan kecuali pada jaringan
daun R. communis yang hanya ditemukan polyprenol rantai pendek, yakni
C60-C65. Senyawa bombiprenone (C43) terdeteksi pada daun B. asiatica dan
M. candidum (Tabel 2). Tidak ada senyawa polyprenol yang terdeteksi di akar
B. asiatica dan akar R. communis. Senyawa polyprenol pada akar hanya terdapat
pada akar M. candidum dalam jumlah kecil yakni C80-C90. Namun polyprenol
mendominasi pada daun M. candidum dengan rantai panjang C45-C140, dan
senyawa polyprenol terdapat pada semua jaringan daun.
Berdasarkan penelitian sebelumnya (Basyuni et al. 2016), pada jaringan
daun H. tiliaceus yang termasuk kedalam mangrove ikutan, juga hanya ditemukan
rantai
pendek
polypernol.
Hal
ini
sesuai
dengan
pernyataan
Swiezewska et al. (1994); Tateyama et al. (1999); Swiezewska dan Danikiewska
(2005), yang menyatakan bahwa dalam dunia tumbuhan terutama pada jaringan
daun, polyprenol biasanya terdeteksi dengan konsentrasi yang berlimpah
dibandingkan dengan dolichol.
Universitas Sumatera Utara
Dolichol bertindak sebagai lipid pembawa gula dalam biosintesis Nglikoprotein. Oleh karena itu, meskipun pada daun B. asiatica panjang rantai
dolichol lebih besar dari polyprenol dan sekalipun itu di jaringan daun tumbuhan
mangrove, hal ini dikarenakan bahwa reduktase polyprenol bertanggung jawab
untuk konversi dari polyprenol ke dolichol mungkin aktif pada jaringan daun
B. asiatica, seperti yang ditemukan pada hewan (Pattison & Amtmann 2009;
Cantagrel et al. 2010), dimana dolichol merupakan senyawa polyisoprenoid utama
dan hanya beberapa polyprenol dapat ditemukan (Chojnacki & Dallner 1988;
Daniels & Hemming 1990; Sagami et al. 1992).
Sedangkan dolichol yang ditemukan pada lima dari enam jaringan termasuk
akar dan daun, mendominasi pada ketiga jaringan akar mangrove ikutan, hanya ada
satu janis mangrove ikutan dari jaringan akar yang ditemukan kedua senyawa
polyprenol dan senyawa dolichol namun itupun dalam jumlah kecil. Seperti yang
bisa dilihat pada tabel 2, pada akar B. asiatica hanya ditemukan dolichol (C75-C100),
M. candidum dengan panjang rantai dolichol C75-C90, sedangkan pada jaringan akar
R. communis (C80-C90). Hasil ini didukung dengan penelitian sebelumnya yang
melaporkan bahwa dolichol lebih dominan daripada polyprenol dengan rantai
panjang di akar Hevea brasiliensis (Tateyama et al. 1999), akar Coluria geoides
(Skorupinska-Tudek et al. 2003), dan akar tumbuhan mangrove (Basyuni et al.
2016).
Oleh sebab itu, jumlah besar dari dolichol yang ada bahkan pada lima dari
enam jaringan tiga jenis mangrove ikutan, menyiratkan bahwa polyprenol tidak
memainkan peran penting dalam beberapa jaringan mangrove ikutan, walaupun
fungsi dari polyprenol pada dunia tumbuhan tetap tidak jelas. Dominasi dolichol
Universitas Sumatera Utara
yang jelas mungkin adalah hasil dari zona mangrove ikutan yang berada dipesisir
dengan kondisi iklim tropis atau subtropis. Dimasa mendatang, akan sangat penting
untuk memahami keberadaan dolichol pada tumbuhan mangrove ikutan ini yang
dapat berfungsi sebagai lipid pembawa gula dalam biosintesis N-glikoprotein
(Pattison & Amtmann, 2009; Cantagrel et al. 2010). Temuan ini menjelaskan
bahwa distribusi polyprenol dan dolichol ditemukan pada tiga jenis mangrove
ikutan yang bervariasi tergantung dari setiap jaringan.
Universitas Sumatera Utara
KESIMPULAN
Analisis kromatografi lapis tipis dua dimensi dari jaringan daun dan akar
B. asiatica, daun dan akar M. candidum dan akar R. communis ditemukan
senyawa dolichol dengan panjang rantai masing C55-C140, C75-C100, C50-C115, C75C90, dan C80-C90, ditemukan juga senyawa polyisoprenoid polyprenol pada
jaringan daun B. asiatica, daun dan akar M. candidum, dan jaringan daun R.
communis dengan masing-masing panjang rantai C80-C95, C45-C140, C80-C90 dan
C60-C65. Jumlah polyisoprenoid terbesar terdapat pada jaringan daun M. candidum
(140,3 mg/g) dan pada jaringan akar pada B. asiatica (46,8 mg/g), sedangkan nilai
polyisoprenoid terkecil terdapat pada jaringan daun dan akar R. communis
masing-masing 20,4 mg/g dan 31,1 mg/g.
Saran
Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui manfaat
farmakologi dari tiga jenis mangrove ikutan R. communis, M. candidum, dan B.
asiatica berdasarkan senyawa polyisoprenoid yang telah ditemukan..
Universitas Sumatera Utara
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan September sampai Maret 2017.
Sampel dikumpulkan dari kawasan hutan mangrove Desa Lubuk Kertang,
Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Isolasi lipid dari setiap sampel dilakukan di
Laboratorium PT. Socfin Indonesia, analisis kromatografi lapis tipis (Thin Layer
Chromatography) dan polyisoprenoid dilakukan di Laboratorium Fitokimia,
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, dan Laboratorium Budidaya Hutan
Fakultas Kehutanan, Universitas Sumatera Utara, Medan.
Alat dan Bahan
Alat
yang
digunakan
dalam
pelaksanaan
penelitian
ini
yaitu
cutter dan gunting untuk memotong sampel menjadi bagian-bagian kecil, grinding
machiene (Foss) untuk menghaluskan sampel, oven, inkubator, desikator,
timbangan analitik, macropipettes (5-20 ml), micropippetes (5-200 µl), chamber,
bar magnetik, TLC plates, TLC cutter, botol kocok, botol serum, corong, spatula,
kamera, alat tulis, kantong plastik, aluminium foil, label name, silica gel dan
amplop sampel.
Bahan yang digunakan dalam pelaksanaan penelitian ini yaitu bagian
organ vegetatif berupa akar dan daun R. communis, bagian akar dan daun
M. candidum, dan akar dan daun B. asiatica. Sedangkan bahan kimia yang
digunakan adalah, kloroform, metanol, aquades, etanol, KOH, heksan, toluen, etil
asetat, aseton, polyisoprenoid Std, dan uap yodium.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur Penelitian
Koleksi Sample
Daun dan akar tiga spesies mangrove dikumpulkan dari daerah
Desa Lubuk Kertang, Kabupaten Langkat, Sumatera Utara. Daun dan akar (sekitar
4-5 gram berat basah) dikumpulkan pada bulan September 2016. Tiga spesies
mangrove yang daun dan akar nya dikumpulkan adalah R. communis,
M. candidum, dan B. asiatica. Usia daun diperkirakan berumur 2-6 bulan.
Tumbuhan mangrove yang dikoleksi tumbuh dengan paparan sinar matahari
alami. Semua sampel segar disimpan dilemari es sebelum digunakan.
Ektraksi Lipid
Daun atau akar (masing-masing dengan berat 2 gram berat kering
diekstrak dengan klorofom/methanol (CHCL3/CH3OH; berdasarkan volume 2:1).
Kemudian diinkubasi pada suhu 40 ºC selama 24 jam. Dinding sel yang berisi
ekstrak dalam CM21 disaring dengan kertas filtrasi No. 2 (Advantec, Tokyo,
Jepang) dan yang tersisa adalah ekstrak lipid di dalam kloroform. Sebagian
ekstrak dimurnikan untuk dianalisis kandungan lipidnya seperti yang digambarkan
sebelumnya (Basyuni et al. 2007). Cairan ekstrak lipid yang pekat dikeringkan
kemudian ditimbang dan di dapatkan berat lipidnya. Sehingga dapat diketahui
kandungan total lipid/jaringan (mg/g jaringan).
Saponifikasi
Ekstrak lipid dari daun dan akar disaponifikasi pada suhu 65 ºC selama 24
jam dengan perbandingan :
Universitas Sumatera Utara
2ml air (water)
x sampel
2ml ethanol
x sampel
0,45 KOH
x sampel
Setelah 24 jam
di inkubasi di waterbath, sampel dikeringkan dengan oven
bersuhu 50-55 ºC sampai sampel benar-benar kering.
Bahan kimia
Dolichol dari hati babi diperoleh dari Sigma. Campuran standar senyawa
dolichol (C90-C105) diisolasi dari testis kuda dan campuran polyprenol (C90-C100)
dari Malus sp (Swiezewska & Danikiewicz 2005). Standar dolichol (C95-C110)
berasal dari cakalang hati tuna (Ishiguro et al. 2014). Bombiprenone (C43)
dimurnikan dengan kromatografi silika gel NSL dari CHCL3/CH3OH (2:1)
berasal dari ekstrak daun kering Perilla dan fraksi yang sudah dimurnikan
dikonfirmasi dengan memiliki nilai m/z [M + Na].
Analisis dengan dua dimensi kromatografi lapis tipis
Dimensi pertama TLC dilakukan selama 60 menit diatas silika gel (20 x 3
cm) dengan sistem pelarut toluen-etil asetat (9:1), seperti yang dijelaskan oleh
(Sagami et al. 1992). Dalam analisis TLC, famili polyprenol bergerak sedikit
lebih cepat dari famili dolichol. Tepi longitudinal dari dimensi pertama TLC
dengan lebar 1 cm dan zona konsentrasi dari fase reverse C-18 TLC yang dijepit
dengan cara menggunakan dua bar magnetik (4,0 x 1,1 x 0,8 cm) dengan
mengahadap setiap fase gel. Plat TLC yang terikat kemudian dikembangkan tegak
lurus ke dimensi pertama untuk mentransfer polyprenol dan dolichol ke zona
konsentrasi fase reverse TLC.
Universitas Sumatera Utara
Dimensi kedua fase reverse RP-18 silika gel TLC dilakukan dengan
pelarut aseton selama sekitar 30 menit. Posisi polyisoprenoid alkohol dipisahkan
dan dikembangkan dengan uap yodium (iodine vapor). Gambar kromatografi
yang diperoleh dan discan digital dengan seri printer Canon E400. Konsentrasi
polyprenol dan dolichol terdeteksi pada HPTLC RP-18 diukur menggunakan
ImageJ 1.46r (Schneider et al. 2012) dengan standar dolichol dan polyprenol
sebagai acuan.
Universitas Sumatera Utara
HASIL DAN PEMBAHASAN
Profil Polyisoprenoid di Mangrove Ikutan
Penelitian dilakukan untuk menganalisis kandungan dan kuantifikasi
senyawa polyisoprenoid pada organ vegetatif tiga jenis mangrove ikutan. Dari
hasil ekstraksi daun dan akar R. communis, M. candidum, dan B. asiatica.
diperoleh total lipid dolichol dan polyprenol. Hasil ekstraksi yang diperoleh
terlihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Total lipid dan pembagian nilai dolichol dan polyprenol pada daun dan
R. communis, M. candidum, dan B. asiatica.
akar
Typ
Lipid
Jari
Dolicho
total
Jenis
% in total lipid
% in polyisoprenoid
e
Polyisopreno Polypreno
nga
ls
(mg/g
id (mg/g dw) ls (mg/g)
n
Polyisopreno Polypreno Dolicho Polypreno Dolicho
(mg/g)
dw)
id
ls
ls
ls
ls
Dau
629,5
B. asiatica
132,6
11,2
121,3
21,1
1,8
19,3
8,4
91,5
I
140,3
95,3
45,1
23,1
15,7
7,4
67,9
32,1
II
20,4
20,4
nd
2,4
2,4
nd
100,0
nd
III
46,8
nd
46,8
7,9
nd
7,9
nd
100,0
I
33,8
14,8
19
6,4
2,8
3,6
43,8
56,2
II
31,1
nd
31,1
5,8
nd
5,8
nd
100,0
I
n
M.
candidum
R.
communis
Dau 606,8±63
n
,9
Dau 860,6±14
n
,6
Aka
595,0
B. asiatica
r
M.
candidum
R.
communis
Aka 528,4±1,
r
90
Aka 534,1±11
r
,9
nd = not detected/ tidak terdeteksi.
Penyebaran polyprenol dan dolichol dengan panjang rantai karbon dari
setiap famili disajikan pada Tabel 1. Dari Tabel 1 dapat dilihat total lipid dan nilai
Universitas Sumatera Utara
dari polyprenol dan dolichol dari masing-masing jaringan daun dan akar dari tiga
jenis mangrove ikutan. Total lipid dinyatakan sebagai perkiraan gravimetri fraksi
lipid. Berdasarkan Tabel 1, total lipid pada jaringan daun berkisar dari 606,5
sampai 860,6 mg/g dengan total lipid terkecil terdapat pada daun M. candidum
(606,5 mg/g) dan yang terbesar pada R. communis (860,6 mg/g), sedangkan total
lipid pada jaringan akar berkisar dari 528,4 sampai 595,0 mg/g dengan total lipid
terkecil ditemukan pada akar M. candidum (528,4 mg/g) dan total lipid terbesar
pada B. asiatica (595,0 mg/g). Jumlah polyisoprenoid terbesar pada jaringan daun
terdapat pada jaringan daun M. candidum (140,3 mg/g) dan pada jaringan akar
terdapat pada B. asiatica (46,8 mg/g), sedangkan nilai polyisoprenoid terkecil
terdapat pada jaringan daun dan akar R. communis masing-masing 20,4 mg/g dan
31,1 mg/g.
Basyuni et al. (2016) membagi polyprenol dan dolichol pada daun dan
akar kedalam tiga tipe (I, II, III). Tipe-I terdapat dominasi dolichol lebih dari 90%,
tipe-II mengandung kedua senyawa polyprenol dan dolichol pada jaringan
tumbuhan, sedangkan tipe-III dominasi senyawa polyprenol lebih dari 90%. Pada
jaringan daun dan akar ketiga jenis mangrove ikutan, dapat ditemukan ketiga tipe
diatas sedangkan pada jaringan akar dari ketiga jenis mangrove ikutan terbagi ke
dalam tipe-I dan II. Sama dengan pengamatan sebelumnya yaitu pada daun
mangrove Okinawa, tipe-I, II dan III juga ditemukan pada jaringan daun dan pada
pengematan
akar
mangrove
juga
hanya
ditemukan
tipe-I
dan
II
(Basyuni et al. 2016). Namun, hasil yang konsisten didapatkan pada tiga akar
mangrove ikutan yang menunjukkan bahwa dolichol lebih berlimpah daripada
Universitas Sumatera Utara
polyprenol, sama dengan penelitian sebelumnya yang menemukan hal serupa pada
akar mangrove di Okinawa (Basyuni et al. 2016).
Daun dan akar B. asiatica dan akar R. communis masuk ke dalam tipe-I.
Sedangkan daun dan akar M. candidum termasuk kedalam tipe-II, dapat dilihat
jumlah polyprenol dengan panjang rantai yang mirip dengan dolichol ditemukan
pada dua jaringan ini (Gambar 2B dan 2E). Pada tipe-III, penemuan polyprenol
lebih dari 90%, yang juga sama dengan pengamatan saat penelitian pada
mangrove Okinawa (Basyuni et al. 2016), seperti yang ditunjukkan pada jaringan
daun R. communis yang termasuk kedalam tipe-III, karena pada jaringan ini hanya
ditemukan 100% polyprenol. Distribusi dari dominasi polyprenol lebih dari pada
dolichol, dan sama dengan tipe-III pada daun tidak terlihat pada jaringan akar dari
tiga jenis mangrove ikutan.
Pada jaringan akar dan daun R. communis dapat dilihat perbedaan rantai
panjang senyawa polyisoprenoid, meskipun pada jaringan daun dan akar
B. asiatica serta daun dan akar M. candidum ditemukan dolichol dan polyprenol,
namun terdapat perbedaan konsentrasi dolichol dan polyprenol (Gambar 2), hal ini
diduga karena perbedaan umur pada jaringan dan perbedaan lingkungan dari
masing-masing jenis. Hal ini sesuai dengan pernyataan Tateyama et al. (1999)
yang menyatakan distribusi rantai panjang polyprenol belum tentu sama dengan
rantai panjang dolichol di jaringan yang sama, hal ini juga didukung pernyataan
Suga et al. (1989) yang menyatakan konsentrasi polyisoprenoid pada tanaman
mengalami perubahan yang disebabkan oleh perbedaan umur dan juga musim.
Selain itu perbedaan konsentrasi dolichol dan polyprenol akan meningkat disetiap
Universitas Sumatera Utara
jaringan tanaman dengan pertambahan umur dan dengan meningkatmya cekaman
lingkungan (Swiezewska & Danikiewiez 2005).
Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Kandungan senyawa polyisoprenoid dari tiga jenis mangrove ikutan
dianalisis menggunakan metode kromatografi lapis tipis (Sagami et al. 1992,
Basyuni et al. 2016) dapat dilihat pada Gambar 2. Polyisoprenoid dengan rantai
panjang yang berbeda dipisahkan menjadi famili polyprenols dan dolichol.
Sedangkan Tabel 2 menjelaskan tentang penyebaran polyprenols dan dolichols
dengan panjang rantai karbon dari setiap famili.
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Gambar 2. Analisis dua dimensi kromatografi dari daun B. asiatica (A),
daun M. candidum (B), daun R. communis (C), akar B. asiatica (D),
akar M. candidum (E), dan akar R. communis (F).
Identifikasi rantai panjang polyisoprenoid dari tiga jenis mangrove ikutan
pada daun dan akar menggunakan metode analisis kromatografi lapis tipis
(Sagami et al. 1992, Basyuni et al. 2016) untuk memisahkan dolichol dan
Universitas Sumatera Utara
polyprenol. Analisis polyisoprenoid pada jaringan daun dari tiga jenis mangrove
ikutan menunjukkan bahwa tipe-II lebih mendominasi dari pada hanya ditemukan
salah satu senyawa polyprenol atau dolichol. Pengamatan ini berlawanan dengan
daun dan akar pada hutan mangrove bahwa mayoritas polyisoprenoid alkoholnya
adalah dolichol daripada polyprenol. Berdasarkan hasil dari analisis kromatografi
lapis tipis dari polyisoprenoid dari jaringan daun dan akar B. asiatica, daun dan
akar M. candidum dan akar R. communis ditemukan dolichol dengan panjang
rantai masing C55-C140, C75-C100, C50-C115, C75-C90, dan C80-C90 (Tabel 2).
Dengan metode yang sama ditemukan juga senyawa polyisoprenoid
polyprenol pada jaringan daun B. asiatica, daun dan akar M. candidum, dan
jaringan daun R. communis dengan masing-masing panjang rantai C80-C95, C45C140, C80-C90 dan C60-C65 (Tabel 2). Menariknya, pada jaringan daun R. communis
tampak berbeda dengan yang lain, karena bahwa pada spesies ini hanya
mengandung rantai pendek polyprenol (C80-C90) sedangkan rantai panjang
dolichol dan polyprenol tidak terdeteksi. Penemuan ini serupa dengan penelitian
pada famili dari Euphorbiaceae, Lauraceae, Magnoliaceae, dan Moraceae
(Jankowski et al. 1994; Swiezewska et al. 1994; Marczewski et al. 2007)
Pada daun B. asiatica, rantai karbon pada dolichol ditemukan lebih
panjang (>C100 atau lebih) daripada polyprenol (C80-C95) (Gambar 2A dan 2B),
sedangkan pada akar M. candidum (Gambar 2E) rantai karbon dolichol dan
polyprenol tidak jauh berbeda meskipun sedikit lebih panjang pada rantai karbon
dolichol (C75-C90) dari polyprenol (C80-C90). Namun bagaimanapun, rantai karbon
dolichol yang ditemukan pada jaringan daun menujukkan bahwa hasil yang
didapat sedikit berbeda dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya
Universitas Sumatera Utara
(Skoczylas et al. 1994), yaitu dolichol tidak ditemukan pada jaringan daun,
sedangkan
pada
jaringan
daun
L.
racemosa
di
mangrove
Okinawa
(Basyuni et al. 2016) ditemukan dolichol. Perbedaan yang ada ini mungkin
disebabkan karena perbedaan usia pada daun dan kondisi lingkungannya.
Pengamatan ini menunjukkan bahwa jalur biosintesis dari polyprenol rantai
pendek, polyprenol rantai menengah, polyprenol rantai panjang dan dolichol yang
berbeda diatur dalam kerajaan tumbuhan, termasuk tumbuhan mangrove
(Chouda & Jankowski 2005).
Berbeda dengan daun M. candidum yang justru memperlihatkan panjang
rantai karbon polyprenol (>C100 atau lebih) ditemukan lebih panjang dibanding
dolichol (C50-C115) (Gambar 2B). Sedangkan pada daun R. communis (Gambar
2C), senyawa polyprenol 100% ditemukan dan tidak terdeteksi adanya senyawa
dolichol, hampir sama dengan akar B. asiatica dan akar R. communis yang 100%
ditemukan satu jenis senyawa, pada kedua jaringan tersebut hanya terdeteksi
senyawa dolichol dan tidak terdeteksi adanya polyprenol (Gambar 2D dan 2F).
Menurut Tateyama et al. (1999) bahwa rantai panjang dolichol bervariasi
pada setiap jaringan, bahkan pada spesies yang sama dan muncul untuk
membentuk famili yang berbeda dengan molekul spesies yang mendominasi.
Polyprenol juga terjadi menjadi satu atau dua keluarga polyprenol, khususnya
polyprenol tipe-fikaprenol (polyprenol rantai pendek) dan polyprenol rantai
panjang, tergantung pada tumbuhan dan jaringannya. Dua famili polyprenol
ditemukan pada daun M. candidun, temuan ini juga didukung dengan beberapa
penelitian sebelumnya pada dua famili polyprenol di jaringan daun tua dari
tumbuhan mangrove mayor K. obovata (Basyuni et al. 2016).
Universitas Sumatera Utara
Tabel 2. Panjang rantai karbon pada pada daun dan akar R. communis, M.
candidum, dan B. asiatica.
Jenis
Jaringan
(C43)
B. asiatica
Daun
○
Polyprenol
Dolichol
80 85 90 95
55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115
120 125 130 135 140 and more
M. candidum
Daun
○
45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115
50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115
120 125 130 135 140 and more
R. communis
Daun
B. asiatica
Akar
M. candidum
Akar
R. communis
Akar
60 65
75 80 85 90 95 100
80 85 90
75 80 85 90
80 85 90
Tabel 2 menggambarkan distribusi dolichol dan polyprenol pada masingmasing daun dan akar dari tiga jenis mangrove ikutan B. asiatica, M. candidum,
dan R. communis. Dolichol ditemukan disemua jaringan kecuali pada jaringan
daun R. communis yang hanya ditemukan polyprenol rantai pendek, yakni
C60-C65. Senyawa bombiprenone (C43) terdeteksi pada daun B. asiatica dan
M. candidum (Tabel 2). Tidak ada senyawa polyprenol yang terdeteksi di akar
B. asiatica dan akar R. communis. Senyawa polyprenol pada akar hanya terdapat
pada akar M. candidum dalam jumlah kecil yakni C80-C90. Namun polyprenol
mendominasi pada daun M. candidum dengan rantai panjang C45-C140, dan
senyawa polyprenol terdapat pada semua jaringan daun.
Berdasarkan penelitian sebelumnya (Basyuni et al. 2016), pada jaringan
daun H. tiliaceus yang termasuk kedalam mangrove ikutan, juga hanya ditemukan
rantai
pendek
polypernol.
Hal
ini
sesuai
dengan
pernyataan
Swiezewska et al. (1994); Tateyama et al. (1999); Swiezewska dan Danikiewska
(2005), yang menyatakan bahwa dalam dunia tumbuhan terutama pada jaringan
daun, polyprenol biasanya terdeteksi dengan konsentrasi yang berlimpah
dibandingkan dengan dolichol.
Universitas Sumatera Utara
Dolichol bertindak sebagai lipid pembawa gula dalam biosintesis Nglikoprotein. Oleh karena itu, meskipun pada daun B. asiatica panjang rantai
dolichol lebih besar dari polyprenol dan sekalipun itu di jaringan daun tumbuhan
mangrove, hal ini dikarenakan bahwa reduktase polyprenol bertanggung jawab
untuk konversi dari polyprenol ke dolichol mungkin aktif pada jaringan daun
B. asiatica, seperti yang ditemukan pada hewan (Pattison & Amtmann 2009;
Cantagrel et al. 2010), dimana dolichol merupakan senyawa polyisoprenoid utama
dan hanya beberapa polyprenol dapat ditemukan (Chojnacki & Dallner 1988;
Daniels & Hemming 1990; Sagami et al. 1992).
Sedangkan dolichol yang ditemukan pada lima dari enam jaringan termasuk
akar dan daun, mendominasi pada ketiga jaringan akar mangrove ikutan, hanya ada
satu janis mangrove ikutan dari jaringan akar yang ditemukan kedua senyawa
polyprenol dan senyawa dolichol namun itupun dalam jumlah kecil. Seperti yang
bisa dilihat pada tabel 2, pada akar B. asiatica hanya ditemukan dolichol (C75-C100),
M. candidum dengan panjang rantai dolichol C75-C90, sedangkan pada jaringan akar
R. communis (C80-C90). Hasil ini didukung dengan penelitian sebelumnya yang
melaporkan bahwa dolichol lebih dominan daripada polyprenol dengan rantai
panjang di akar Hevea brasiliensis (Tateyama et al. 1999), akar Coluria geoides
(Skorupinska-Tudek et al. 2003), dan akar tumbuhan mangrove (Basyuni et al.
2016).
Oleh sebab itu, jumlah besar dari dolichol yang ada bahkan pada lima dari
enam jaringan tiga jenis mangrove ikutan, menyiratkan bahwa polyprenol tidak
memainkan peran penting dalam beberapa jaringan mangrove ikutan, walaupun
fungsi dari polyprenol pada dunia tumbuhan tetap tidak jelas. Dominasi dolichol
Universitas Sumatera Utara
yang jelas mungkin adalah hasil dari zona mangrove ikutan yang berada dipesisir
dengan kondisi iklim tropis atau subtropis. Dimasa mendatang, akan sangat penting
untuk memahami keberadaan dolichol pada tumbuhan mangrove ikutan ini yang
dapat berfungsi sebagai lipid pembawa gula dalam biosintesis N-glikoprotein
(Pattison & Amtmann, 2009; Cantagrel et al. 2010). Temuan ini menjelaskan
bahwa distribusi polyprenol dan dolichol ditemukan pada tiga jenis mangrove
ikutan yang bervariasi tergantung dari setiap jaringan.
Universitas Sumatera Utara
KESIMPULAN
Analisis kromatografi lapis tipis dua dimensi dari jaringan daun dan akar
B. asiatica, daun dan akar M. candidum dan akar R. communis ditemukan
senyawa dolichol dengan panjang rantai masing C55-C140, C75-C100, C50-C115, C75C90, dan C80-C90, ditemukan juga senyawa polyisoprenoid polyprenol pada
jaringan daun B. asiatica, daun dan akar M. candidum, dan jaringan daun R.
communis dengan masing-masing panjang rantai C80-C95, C45-C140, C80-C90 dan
C60-C65. Jumlah polyisoprenoid terbesar terdapat pada jaringan daun M. candidum
(140,3 mg/g) dan pada jaringan akar pada B. asiatica (46,8 mg/g), sedangkan nilai
polyisoprenoid terkecil terdapat pada jaringan daun dan akar R. communis
masing-masing 20,4 mg/g dan 31,1 mg/g.
Saran
Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui manfaat
farmakologi dari tiga jenis mangrove ikutan R. communis, M. candidum, dan B.
asiatica berdasarkan senyawa polyisoprenoid yang telah ditemukan..
Universitas Sumatera Utara