Laporan Praktikum Biokimia I Indonesia

LAPORAN PRAKTIKUM
BIOKIMIA

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO

NAMA
NIM
KELOMPOK
HARI/TGL PERC.
ASISTEN

: HAMSINA
: H41111331
: II (DUA)
: SELASA/ 23 OKTOBER 2012
: ARKIEMAH HAMDA

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR
2012
BAB I

PENDAHULUAN

1. 1 Latar Belakang
Pada

umumnya

asam

amino

diperoleh

sebagai

hasil

hidrolisis

protein,Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan
untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-masing asam
amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut.Banyak
metode yang dapat dilakukan dalam pemisahan dan identifikasiasam amino,
seperti

metode

gravimetri,

kalorimetri,

mikrobiologi,

kromatografi

dan

elektroforesis. Salah satu metode yang paling banyak digunakan dalam pemisahan
asam-asam amino adalah metode romatografi. Metode kromatografi merupakan
metode pemisahan dua atau lebihsenyawa atau ion berdasarkan pada perbedaan
migrasi dan distribusi senyawa atauion-ion tersebut di dalam dua fasa yang
berbeda. Metode kromatografi bermacam-macam, dapat digolongkan berdasarkan
mekanisme pemisahannya serta alat yang digunakan(Aisyah, 2008).
Salah

satu

jenis

kromatograi

adalah

kromatografi

lapis

tipis

(KLT).kromatografi jenis ini murah dan mudah dilakukan serta rutin digunakan di
berbagai laboratorium.Dalam percobaan ini kita akan menentukan nilai Rf asam
amino sertamengidentifikasi asam amino dalam suatu larutan sampel berdasarkan
nilai Rf menggunakan kromatografi lapis tipis, sehingga kita akan lebih
memahami pemisahan dan identifikasi asam amino dengan metode ini. Hal inilah
yang melatarbelakangi sehingga percobaan ini dilakukan.
1.2 Maksud dan tujuan percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan
Maksud dilakukannya percobaan ini adalah untuk mengetahui dan
memahami

cara

pemisahan

dan

identifikasi

asam

amino

melalui

metodekromatografi lapis tipis.
1.2.2 Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukannya percobaan ini adalah untuk:
1. Menghitung nilai Rf dari beberapa jenis asam amino dan larutan sampel
sampel.
2. Mengidentifikasi asam amino dalam larutan sampel berdasarkan nilai Rf nya.
I.3 Prinsip Percobaan
Mengdentifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan
menggunakan metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari
campuran n-butanol, asam asetat dan air, dan fase diamnya berupa lapisan tipis
aluminium oksida.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Asam amino adalah unit dasar dari struktur protein. Semua asam amino
mempunyai sekurang-kurangnya satu gugusan amino (-NH2) pada posisi alfa dari
rantai karbon dan satu gugusan karboksil (-COOH). Kecuali Glisin, semua asam
amoino mempunyai atom karbon yang asimetrik, sehingga dapat terjadi beberapa
isomer. Kebanyakan asam amino dalam alam adalah konfigurasi L, tetapi dalam
bakteria ada konfigurasi D. Sifat asam amino mempunyai gugus nitrogen dasar,
umumnya gugus amino (-NH2) dan sebuah unit karboksil (-COOH) dan
kebanyakan gugus amino terikat pada karbon dengan posisi alfa; prolin
mempunyai suatu pengecualian yaitu mempunyai gugus amino (-NH) dan
bukannya amino (-NH2) (Ti)(Aisyah, 2008).
Fungsi asam amino sebagai komponen sruktur tubuh dapat merupakan
bagian dari enzyme sebagai precursor regulasi metabolit dan berperan dalam
proses fisiologis. Fungsi biokimia ini merupakan titik utama penelitian ilmu
nutrisi (Austic 1986 dalam Widyani 1999). Ketidakseimbangan asam amino dapat
mengakibatkan berkurangnya konsumsi pakan sehingga menurunkan kinerja

karena asam amino dalam plasma berkurang sehingga asam amino yang ke otak
sedikit (Tim Dosen, 2011).
Rumus asam amino yang terbentuk dengaan ikatan peptida adalah sebagai
berikut:

Gambar 1. Pembentukan Ikatan Peptida
Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik
menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran
bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino
maupunkuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara
asam-asam amino tersebut (Poedjiadi dan supriyanti, 2005).
Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode
gravimetri,kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. salah satu
metodeyang banyak memperoleh pengembangan adalah metode kromatografi.
Macam-macam kromatografi ialah kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis
dankromatografi penukar ion (Poedjiadi dan supriyanti, 2005).
Kromatografi

adalah

salah

satu

metode

pemisahan

fisik,

dimanakomponen-komponen yang dipisahkan didistribusikan di antara dua fasa,
salahsatu fasa tersebut adalah suatu lapisan stasioner dengan permukaan yang
luas,yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut sepanjang landasan
stasioner. Fase stasioner dapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase
bergerak dapat berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi, zatzat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja laju
pemisahan terlatak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang
berbeda (Day dan Underwood, 2002).

Zat terlarut di dalam suatu fasa gerak mengalir pada suatu fasa diam. Zat
terlarut yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak yang lebih besar akan tertahan

lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap
fasagerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan
demikiansenyawa-senyawa dapat dipisahkan komponen demi komponen akibat
perbedaan migrasi di dalam fasa gerak dan fasa diam (Tim Dosen Biokimia,
2012).
Penggolongan kromatografi dapat didasarkan atas mekanisme pemisahannya
serta alat yang digunakan. Berdasarkan mekanisme pemisahannya,kromatografi
digolongkan atas kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi,kromatografi
pasangan ion, kromatografi penukar ion, dan kromatografi eksklusiukuran.
Sedangkan

berdasarkan

alat

yang

digunakan,

kromatografi

dibedakan

ataskromatografi kertas, kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi cairan
kinerja tinggi (HPLC), serta kromatografi gas (Aisyah, 2008).
Kromatografi kertas adalah salah satu jenis kromatografi partisi, aitu
pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang
tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini
cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis
diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung
kertas dilarutkan ke dalam pelarut tertentu (Day dan Underwood, 2002).
Pelarut ini akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa
senyawa-senyawa dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam
pelarut tertentu itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh
daripada yang sukar larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir,

kertas diangkat dari pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya diudara.
Dengan proses ini, asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain,dan
dengan menyemprotkan pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebutakan
tampak noda-noda biru yang membuktikan adanya asam amino yangterpisah itu

(Poedjiadi dan Supriyanti, 2005).
Kromatografi lapis tipis menggunakan aluminium oksida, serbuk selulosa
atau silica gel sebagai absorben yang berupa lapis tipis yang diletakan di atas
selembar kaca. Seperti halnya pada kromatografi kertas, larutan yang mengandung
asam amino diteteskan di atas absorben dan dibiarkan bergerak. Pemisahan asam
amino didasarkan perbedaan kecepatan bergerak asam-asam amino tersebut pada
pH tertentu (Poedjiadi dan Supriyanti, 2005).
Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik, dapat digunakan
dua fase pelarut, misalnya pasangan fenol – air, n-butanol – air atau dengan
tigafase pelarut, misalnya n-butanol – asam asetat – air, dimana setiap jenis asam
amino mempunyai koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu

Gambar 2 Plat Tipis Kromatografi

Dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana,
cepat dalam pemisahan dan sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah
untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan. Harga Rf yaitu b/
a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut tertentu. Dengan
menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui macamnya pada
kromatografi kertas seperti yang dilakukan di atas maka dapat diketahui macam
asam amino yang diperiksa. Penentuan macam asam aminodapat pula dilakukan
dengan menghitung harga Rf masing-masing asam amino, dan dibandingkan
dengan harga Rf asam amino yang telah ada (Poedjiadi dan Supriyanti, 2005).

BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1Bahan Percobaan
Larutan sampel, larutan glisin, larutan histidin, larutan alanin, eluen (nbutanol : asam asetat : air = 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v), larutan penyemprot ninhidrin 2 %,
plat KLT, aseton, akuades, selotip dan tissue roll, sabun cair
3.2 Alat Percobaan
Chamber, pipet volum 1 mL, pipa kapiler 0,5µL, gelas ukur 10 mL,
botolsemprot, pipet tetes, gunting, pensil, penggaris, gegep dan oven, bulb
filter,mistar, lap halus, dan sikat tabung.
3.3 Prosedur Percobaan
Dibuat larutan eluen dengan menggunakan larutan n-butanol, asam
asetat,dan air dengan perbandingan 2,5 : 6 : 2,6 v/v. Kemudian dimasukkan eluen
kedalam chamber, dikocok sebentar, kemudian ditutup dan ditunggu sampai jenuh
kurang lebih selama 1 jam. Pada plat KLT yang sebelumya telah digunting sesuai
ukuran chamber, dibuat base line, kemudian membuat titik-titik pada base line
yang merupakan tempat penotolan larutan asam amino alanin, glisin, histidin serta
asam amino sampel Xserta membuat garis pada ujung atas absorben sebagai batas
tanda elusi. Plat KLTselanjutnya diaktifasi degan jalan dipanaskna dalam oven
pada suhu sekitar 100oC. Setelah plat KLT diaktifasi, semua larutan asam amino
dan larutan asamamino sampel X ditotolkan pada titik yang telah dibuat pada plat
KLT denganmenggunakan pipa kapiler yang sebelumya telah dicuci dengan

aseton kemudian dikeringkan. Jika eluen telah jenuh, plat KLT dielusi ke dalam
chamber denganhati-hati agar base line tidak tercelup ke dalam eluen. Elusi
dihentikan jipka eluenmenempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya.
Dikeluarkan absorben darichamber dan dikeringkan. Selanjutnya kromatogram
disemprot dengan larutanninhidrin, kemudian dikeringkan dalam oven dengan
suhu kurang lebih 60°Cselama setengah jam. Setelah kering diberi tanda pada
noda yang timbul pada kromatogram dengan pensil. Ditentukan nilai Rf dari
masing-masing noda pada kromatogram.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan
Tabel 1
Noda
Asam Aspartat
Serin
Glisin
Sampel

Jarak eluen (cm)
4
4
4
4

Jarak Noda (cm)
1,8
1,3
1,3
1,2

Rf (cm)
0,45
0,325
0,325
0,3

Tabel 2
Noda
Asam Aspartat
Glisin
Serin
Sampel

4.2 Reaksi
 Asam Aspartat

Jarak eluen (cm)
4
4
4
4

Jarak Noda (cm)
1,7
1,5
1,6
1

Rf (cm)
0,425
0,375
0,4
0,25

 Glisin

 Serin
Reaksi Serin dengan ninhidrin

Larutan eluen dibuat dari caSSmpuran n-butanol, asam asetat, dan air
dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v. Pemilihan ketiga pelarut ini
didasarkan pada perbedaan kepolaran dari ketiga pelarut tersebut, dengan
urutan kepolaran air > n- butanol > asam asetat. Setiap asam amino memiliki
koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino yang
memiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang lebih besar akan tertahan
lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zatterlarut yang afinitasnya terhadap
fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam.
Dengan

demikian

asam

amino

dapat

dipisahkan

akibat

perbedaanm i g r a s i d i d a l a m f a s a g e r a k d a n f a s a d i a m n y a . P r i n s i p
p e r c o b a a n K L T i n i didasarkan pada sifat fisik dan kimia asam amino.

Sifat fisik ditunjukkan olehkecepatan bergerak pada fase diam dari
kertas kromatografi dan sifat kimianya berdasarkan pada warna ynag timbul
ketika disemprot dengan larutan ninhidrinS e b e l u m d i m a s u k k a n p l a t K L T ,
chamber terlebih dahulu dijenuhkandengan eluen dengan cara
m e n u t u p r a p a t c h a m b e r y a n g b e r i s i e l u e n . T u j u a n penjenuhan ini
adalah

agar

proses

untuk m e n c e g a h

elusi

dapat

penguapan

berjalan

dengan

eluen.

cepat

Setelah

serta
eluen

d i j e n u h k a n d a n p l a t K L T t e l a h ditotolkan larutan asam amino dan
sampel, plat KLT dimasukkan dalam chamber dan dilakukan proses elusi sampai
bayang-bayang eluen mencapai end line (batasakhir elusi). Setelah plat KLT
diangkat dari eluen, kemudian dikeringkan padasuhu kamar dan
disemprotkan

dengan

larutan

ninhidrin,

yang

bertujuan

untuk m e m b e r i k a n w a r n a p a d a n o d a a s a m a m i n o d a n N i n h i d r i n
berfungsi
amino

sebagai p e r e a k s i

dengan

membentuk

spesifik
warna

terhadap

asam

u n g u (lembayung) bagi

asam amino glisin, serin, dan alanin dan larutan sampel.
Untuk m e m p e r j e l a s

noda

asam

amino,

plat

KLT

d i m a s u k k a n d a l a m o v e n p a d a s u h u s e k i t a r 9 0 O C selama sepuluh
menit. Proses elusi dibiarkan beberapa saat agar eluen mencapai jarak
tertentu yang telah diberi tanda dan setelah sampai padagaris tanda,
plat KLT dikeringkan dengan oven agar pelarut menguap sempurna
sehingga noda yang terbentuk tidak melebar. Selanjutnya dilakukan
pengukuran jarak

eluen

dan

jarak

noda

dari

base

line

(tempat

penotolan).Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan noda yang

akan dihitung jaraknya antara noda yang satu dengan noda yang
lainnya tidak dapat dilihat secara langsung karena adanya kesalahan
ketika dilakukkan pentotolan, lapisan tipis aluminium oksida tersentuh
tangan bahkan ada yang meniup-nupnya, sehinngga untuk membaca
noda harus di baca bibawa sinar UV.
Dari percobaan ini dapat diketahui bahwa sampel pada tabel 1 memiliki R f
sebesar 0,3 dimana jika dibandingkan dengan nilai Rf teori nilai ini merupakan
nilai Rf Asam Glutamat, jadi kita dapat simpulkan bahwa sampel pada tabel 1
yaitu asam glutamat. Hasil nilai Rf dari Asam aspartat, serin, dan glisin berturut –
turut yaiitu 0,45, 0,325, dan 0,325. Adapun sampel pada tabel 2 memiliki nilai Rf
pada hasil percobaan yaitu 0,25 dan jika dibandingkan dengan tabel Rf teoritis
maka nilai Rf sampel tersebut mendekati nilai Rf glisin pada tabel teori yaitu 0,26,
sedangkan pada hasil pengamatan pada tabel 2 di temukan bahwa asam aspartat,
glisin, dan serin memiliki nilai Rf berturut – turut yaitu 0,425, 0,375, dan 0,4.

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan:
1. Nilai Rf asam amino pada kromatografi yang pertama
yaitu asam aspartat 0,45o, asam amino serin 0,325o,
a s a m amino alanin 0,325o, serta sampel X adalah 0,3o. S e d a n g k a n p a d a
kromatografi ke dua yaitu Asam aspartat 0,425, asam amino
glisin 0,375o, asam amino serin 0,4o, serta, sampel X adalah
0,25.
2 . Pada tabel 1 memiliki Rf sebesar 0,3 dimana jika dibandingkan dengan nilai Rf
teori nilai ini merupakan nilai Rf asam glutamat, . Adapun sampel pada tabel 2
memiliki nilai Rf pada hasil percobaan yaitu 0,25 dan jika dibandingkan
dengan tabel Rf teoritis maka nilai Rf sampel tersebut mendekati nilai Rf glisin
pada tabel teori yaitu 0,26.
5.2 Saran
Untuk laboratorium agar kebersihannya agar tetap terjaga dan
kalau bisa asam amino yang disediakan asam amino yang beragam. U n t u k
asiten

kinerjanya

sudah

sangat

baik

dalam

menjelaskan

k e p a d a kami praktiknnya tentang prosedur percobaan yang akan
dilakukan, saya harap dapat dipertahankan.

DAFTAR PUSTAKA

Aisyah, 2008, Kromatografi, (http://rgmaisyah.wordpress.com/kromatografi,
diakses tanggal 24 Oktober 2012, pukul 16.00 WITA.)
Day, R.A., dan Underwood, A.L., 2001, Analisis Kimia Kuantitatif edisi keenam,
diterjemahkan oleh : Iis Sopyan, Erlangga, Jakarta.
Lehninger, A. L., 2002 Dasar-Dasar Biokimia jiid 1, diterjemahkan oleh Maggy
Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta.
Khopkar, S.M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.
Poedjiadi, A., dan supriyanti 2005, Dasar-Dasar Biokimia edisi revisi, UI-Press,
jakarta.
Tim Dosen Biokimia, 2009, Penuntun dan Laporan praktikum Biokimia,
Laboratorium Biokimia fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
AlamUniversitas Hasanuddin, Makassar.

LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 30 Oktober 2012

Asisten

( IRWAN )

Praktikan

( HAMSINA )