Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Terhadap Sel Kanker Serviks
Lampiran 1. Hasil Identifikasi Tumbuhan Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.)
68
Lampiran 2. Gambar Makroskopik Simplisia Buah Andaliman
Simplisia buah andaliman
Serbuk simplisia buah andaliman
69
Lampiran 3. Gambar Mikroskopik Simplisia Buah Andaliman
1
2
3
4
Keterangan:
1. Kelenjar minyak berwarna kuning kemerahan
2. Sel rambut yang kolaps
3. Sel rambut penutup
4. Epidermis kulit biji berwarna jingga kemerahan
70
Lampiran 4. Bagan Kerja Penelitian
Buah Andaliman
dicuci dari pengotor sampai bersih
ditiriskan
ditimbang berat basahnya
Buah Andaliman
dikeringkan
ditimbang berat keringnya
Simplisia
dihaluskan dengan blender
Serbuk Simplisia
Karakterisasi Simplisia
Skrining Fitokimia
Ekstraksi secara maserasi
Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan alkaloida
Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan glikosida
Penetapan kadar air
Pemeriksaan
glikosida antrakinon
Penetapan kadar sari yang
larut dalam air
Pemeriksaan saponin
Penetapan kadar sari yang
larut dalam etanol
Penetapan kadar abu total
Pemeriksaan tannin
Pemeriksaan
steroid/triterpenoid
di maserasi
dengan etanol
96%
Maserat
diuapkan dengan
rotary
evaporator
Ekstrak
Kental
dilakukan uji
sitotoksik
Nilai IC50
Penetapan kadar abu yang
tidak larut asam
71
Lampiran 5. Perhitungan Kadar Air Simplisia Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat sampel (g)
5,009
5,019
5,012
Volume awal (mL)
1,80
2,10
2,45
Volume akhir (mL)
2,10
2,45
2,75
Volume akhir − Volume awal
x 100%
Berat sampel
2,10 - 1,80
x 100% = 5,98 %
1. Kadar air =
5,009
% Kadar air =
2. Kadar air =
2,45 - 2,10
x 100% = 6,97 %
5,019
3. Kadar air =
2,75 - 2,45
x 100% = 5,98 %
5,012
% Rata-rata kadar air =
5,98 % + 6,97 % + 5,96 %
= 6,30 %
3
72
Lampiran 6. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Air Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat Sampel (g)
5,032
5,019
5,002
% Kadar sari larut dalam air =
Berat Sari (g)
0,135
0,120
0,119
Berat sari (g)
100
x
x 100%
Berat sampel (g)
20
1. Kadar sari larut dalam air =
0,135 100
x 100% = 13,41%
x
20
5,032
2. Kadar sari larut dalam air =
0,120 100
x 100% = 11,95%
x
20
5,019
3. Kadar sari larut dalam air =
0,119 100
x 100% = 11,89%
x
20
5,002
% Rata-rata kadar sari larut dalam air =
13,41% + 11,95% + 11,89%
= 12,41%
3
73
Lampiran 7. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Etanol Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat sampel (g)
5,015
5,021
5,012
Berat sari (g)
0,160
0,173
0,157
% Kadar sari larut dalam etanol =
Berat Sari (g)
100
x
x 100%
Berat Sampel (g)
20
1. Kadar sari larut dalam etanol =
0,160 100
x 100% = 15,95 %
x
20
5,015
2. Kadar sari larut dalam etanol =
0,173 100
x 100% = 17,22 %
x
20
5,021
3. Kadar sari larut dalam etanol =
0.157 100
x 100% = 15,66 %
x
20
5,012
% Rata-rata kadar sari larut dalam etanol =
15,95% + 17,22% + 15,66%
3
= 16,28%
74
Lampiran 8. Perhitungan Kadar Abu Total Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat Sampel (g)
2,0001
2,0009
2,0010
Berat Abu (g)
0,0929
0,0932
0,0920
% Kadar abu total =
Berat Abu (g)
x 100%
Berat Sampel (g)
1. Kadar abu total =
0,0929
x 100% = 4,64%
2,0001
2. Kadar abu total =
0,0932
x 100% = 4,65%
2,0009
3. Kadar abu total =
0,0920
x 100% = 4.59%
2,0010
% Rata-rata kadar abu total =
4,64% + 4,65% + 4,59%
= 4,62%
3
75
Lampiran 9. Perhitungan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No. Berat Sampel (g)
1.
2,0001
2.
2,0009
3.
2,0010
Berat Abu (g)
0,0042
0,0048
0,0039
% Kadar abu tidak larut dalam asam =
Berat Abu (g)
x 100%
Berat Sampel (g)
1. Kadar abu tidak larut dalam asam =
0,0042
x 100% = 0,20%
2,0001
2. Kadar abu tidak larut dalam asam =
0,0048
x 100% = 0,23%
2,0009
3. Kadar abu tidak larut dalam asam =
0,0039
x 100% = 0,19%
2,0010
% Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =
0,20% + 0,23% + 0,19 %
3
= 0,20%
76
Lampiran 10. Rendemen Ekstrak Etanol Buah Andaliman
Berat simplisia kering = 860 g
Berat ekstrak
Rendemen
= 54,573 g
=
=
Berat Ekstrak
Berat Simplisia kering
54,573
860
x 100 %
x 100% = 6,34%
77
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sel HeLa Pada Hemositometer
Jumlah sel HeLa total (A + B + C + D) = 219 sel
Jumlah sel/mL :
∑sel/mL=
∑ sel A+ ∑ sel B+∑ sel C + ∑ sel D
×104
4
∑sel/mL =
219
×104
4
= 54,75 x 104 sel/mL
Volume Panenan Sel :
Volume panenan sel =
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/mL
Volume panenan sel HeLa =
1×106
54,75×104
= 1,20 mL di tambahkan media kultur hingga 10 ml untuk 1 plate
78
Lampiran 12. Perhitungan Jumlah Sel Vero Pada Hemositometer
Jumlah Sel Vero total (A + B + C + D) = 357 sel
Jumlah sel/mL :
∑sel/mL=
∑ sel A+ ∑ sel B+∑ sel C + ∑ sel D
×104
4
∑���/�� =
���
�
× ���
= 89,25 x 104 sel/mL
Volume Panenan Sel Vero :
Volume panenan sel =
Volume panenan sel=
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/mL
1×106
89,25×104
= 1,2 mL di tambahkan media kultur hingga 10 ml untuk 1 plate
79
Lampiran 13. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium
DC.) terhadap Sel HeLa
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,678
0,678
0,679
0,675
Absorbansi kontrol Media
(b)
0,078
0,080
0,108
0,089
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Absorbansi sel dengan perlakuan –Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel –Absorbansi kontrol media
x 100 %
500
0,120 0,112
0,129
RataRata
(c)
0,140
250
0,136 0,136
0,149
0,140
0.052 0.586
9
91
125
0,316 0,335
0,305
0,319
0.230 0.586
39
61
62,5
0,336 0,369
0,324
0,343
0.254 0.586
43
57
31,25
0,382 0,330
0,348
0,353
0.265 0.586
45
55
15,625 0,411 0,384
0,412
0,402
0.314 0.586
78
47
Kadar
Absorbansi (c)
1
2
3
80
% Sel
Hidup
% Sel
Mati
0.052 0.586
9
91
c-b
a-b
Lampiran 14. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium
DC.) terhadap Sel Vero
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,844
0,895
0,819
0,853
Absorbansi kontrol Media
(b)
0,062
0,058
0,054
0,058
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Absorbansi sel dengan perlakuan –Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel –Absorbansi kontrol media
x 100 %
1
2
3
RataRata
(c)
1000
0.09
0.084
0.099
0.091
0.033 0.795
4
96
500
0.293
0.372
0.306
0.324
0.266 0.795
33
67
250
0.597
0.646
0.594
0.612
0.554 0.795
70
30
125
0.641
0.688
0.644
0.658
0.600 0.795
75
25
62,5
0.686
0.727
0.748
0.720
0.662 0.795
83
17
31,25
0.737
0.712
0.769
0.739
0.681 0.795
86
14
Kadar
Absorbansi
81
c –b
a -b
% Sel
Hidup
% Sel
Mati
Lampiran 15. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sel HeLa menggunakan analisa
Probit SPSS 19
Confidence Limits
95% Confidence Limits for
% hambat
Probability
LOGITa
Estimate
Lower
Bound
95% Confidence Limits for log
(% hambat)b
Upper Bound
Estimate
Lower
Bound
Upper
Bound
.010
205.322
.
.
2.312
.
.
.020
161.316
.
.
2.208
.
.
.030
139.881
.
.
2.146
.
.
.040
126.288
.
.
2.101
.
.
.050
116.565
.
.
2.067
.
.
.060
109.102
.
.
2.038
.
.
.070
103.105
.
.
2.013
.
.
.080
98.125
.
.
1.992
.
.
.090
93.888
.
.
1.973
.
.
.100
90.213
.
.
1.955
.
.
.150
76.977
.
.
1.886
.
.
.200
68.310
.
.
1.834
.
.
.250
61.892
.
.
1.792
.
.
.300
56.781
.
.
1.754
.
.
.350
52.505
.
.
1.720
.
.
.400
48.797
.
.
1.688
.
.
.450
45.487
.
.
1.658
.
.
.500
42.462
.
.
1.628
.
.
.550
39.637
.
.
1.598
.
.
.600
36.949
.
.
1.568
.
.
.650
34.339
.
.
1.536
.
.
.700
31.753
.
.
1.502
.
.
.750
29.131
.
.
1.464
.
.
.800
26.394
.
.
1.422
.
.
.850
23.422
.
.
1.370
.
.
.900
19.986
.
.
1.301
.
.
.910
19.204
.
.
1.283
.
.
.920
18.374
.
.
1.264
.
.
.930
17.487
.
.
1.243
.
.
.940
16.526
.
.
1.218
.
.
.950
15.468
.
.
1.189
.
.
.960
14.277
.
.
1.155
.
.
.970
12.889
.
.
1.110
.
.
.980
11.177
.
.
1.048
.
.
.990
8.781
.
.
.944
.
.
a. A heterogenity factor is used.
b. Logarithm base = 10.
82
Lampiran 16. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sel Vero menggunakan
analisa Probit SPSS 19
Confidence Limits
95% Confidence Limits for %
hambat
Probability
LOGITa
Estimate
Lower
Bound
95% Confidence Limits for log(%
hambat)b
Upper Bound Estimate
Lower
Bound
Upper
Bound
.010
6665.759 1518.945
4092413.680
3.824
3.182
6.612
.020
4554.061 1190.006
1428220.379
3.658
3.076
6.155
.030
3576.232 1017.704
733508.110
3.553
3.008
5.865
.040
2981.662
903.815
444785.052
3.474
2.956
5.648
.050
2571.726
820.007
296324.379
3.410
2.914
5.472
.060
2267.523
754.340
209853.642
3.356
2.878
5.322
.070
2030.552
700.714
155155.999
3.308
2.846
5.191
.080
1839.466
655.612
118456.436
3.265
2.817
5.074
.090
1681.340
616.836
92717.393
3.226
2.790
4.967
.100
1547.828
582.920
74030.411
3.190
2.766
4.869
.150
1098.882
458.692
29315.309
3.041
2.662
4.467
.200
836.974
375.820
14163.256
2.923
2.575
4.151
.250
662.634
313.796
7659.651
2.821
2.497
3.884
.300
537.253
263.977
4458.745
2.730
2.422
3.649
.350
442.350
221.922
2736.813
2.646
2.346
3.437
.400
367.846
185.072
1751.676
2.566
2.267
3.243
.450
307.729
151.896
1162.669
2.488
2.182
3.065
.500
258.167
121.581
798.957
2.412
2.085
2.903
.550
216.587
93.956
568.665
2.336
1.973
2.755
.600
181.190
69.404
419.375
2.258
1.841
2.623
.650
150.673
48.592
319.723
2.178
1.687
2.505
.700
124.057
32.011
250.443
2.094
1.505
2.399
.750
100.583
19.661
199.676
2.003
1.294
2.300
.800
79.632
11.069
160.151
1.901
1.044
2.205
.850
60.653
5.513
127.292
1.783
.741
2.105
.900
43.060
2.235
97.830
1.634
.349
1.990
.910
39.641
1.792
92.069
1.598
.253
1.964
.920
36.233
1.408
86.278
1.559
.149
1.936
.930
32.824
1.079
80.412
1.516
.033
1.905
.940
29.393
.801
74.412
1.468
-.096
1.872
.950
25.916
.569
68.197
1.414
-.245
1.834
.960
22.353
.381
61.641
1.349
-.419
1.790
.970
18.637
.232
54.533
1.270
-.635
1.737
.980
14.635
.120
46.446
1.165
-.923
1.667
.990
9.999
.042
36.214
1.000
-1.378
1.559
a. A heterogenity factor is used.
b. Logarithm base = 10.
83
Lampiran 17. Bagan Kerja Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Andaliman
Buah Andaliman
dicuci dari pengotor sampai bersih
ditiriskan
ditimbang berat basahnya
Buah Andaliman
dikeringkan
ditimbang berat keringnya
Simplisia
dihaluskan dengan blender
disimpan dalam wadah yang
tertutup rapat sebelum digunakan
300 g serbuk simplisia
dimasukkan ke dalam wadah
ditambahkan 2250 mL etanol 96%
hingga serbuk terendam
dibiarkan selama 5 hari terlindung
dari cahaya, sambil sesekali diaduk
disaring
Ampas
Maserat I
dicuci dengan etanol 96% secukupnya
hingga diperoleh 3000 mL
dibiarkan selama 2 hari terlindung dari cahaya
dienaptuangkan, disaring
Maserat II
Maserat I +II
dipekatkan
dengan
rotary
evaporator pada temperatur tidak
lebih dari 50oC
Ekstrak kental
Etanol Buah Andaliman
84
Lampiran 18. Bagan Pembuatan Media RPMI
RPMI Sachet
2 g Hepes
2 g NaHCO3
dimasukkan kedalam erlenmeyer
ditambahkan 800 mL aquabides steril
dihomogenkan dengan menggunakan
stirer magnet
diatur pH 7,2 - 7,4 (HCl 1 N
atau NaOH 1 N)
ditambahkan aquabides steril samapai 1 L
dilakukan sterilisasi dengan filter vacum
ditampung dalam botol steril
diberi identitas pada botol media
disimpan pada suhu 2 - 80 C
Media RPMI
85
Lampiran 19. Bagan Pembuatan Media M199
M199 Sachet
2 g Hepes
2,2 g NaHCO3
dimasukkan kedalam erlenmeyer
ditambahkan 800 mL aquabides steril
dihomogenkan dengan menggunakan
stirer magnet
diatur pH 7,2 - 7,4 (HCl 1N
atau NaOH 1N)
ditambahkan aquabides steril samapai 1 L
dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum
ditampung dalam botol steril
diberi identitas pada botol media
disimpan pada suhu 2 - 80 C
Media M199
86
Lampiran 20. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK-RPMI) dan
(MK-M199)
Media Kultur Lengkap (MK-RPMI)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizon
(amfoterisin B)
(0,5%)
PenisilinStreptomisin
(1%)
RPMI ad
100%
dicampur
diberi identitas pada botol MK-RPMI
disimpan pada suhu 2 - 80C
Media Kultur Lengkap
(MK-RPMI)
Media Kultur Lengkap (MK-M199)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizon
(amfoterisin B)
(0,5%)
PenisilinStreptomisin
(1%)
M199 ad
100%
dicampur
diberi identitas pada botol MK-M199
disimpan pada suhu 2 - 80C
Media Kultur Lengkap
(MK-M199)
87
Lampiran 21. Bagan Penumbuhan Sel HeLa
Sel HeLa
diambil dari tangki nitrogen atau freezer
diambil beberapa tetes
dimasukkan kedalam konikel yg berisi
MK-RPMI
disentrifuge 600 rpm selama 5 menit
dibuang supernatan
ditambahkan 4 mL MK-RPMI
di resuspensi hingga homogen
dimasukkan ke dalam flask
ditambahkan 5 mL MK-RPMI kedalam setiap
flask
dihomogenkan
diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
diberi identitas pada flask
disimpan dalam inkubator CO2 5%
Sel HeLa
88
Lampiran 22. Bagan Penumbuhan Sel Vero
Sel Vero
diambil dari tangki nitrogen atau freezer
diambil beberapa tetes
dimasukkan kedalam konikel yg berisi
MK-M199
disentrifuge 600 rpm selama 5 menit
dibuang supernatan
ditambahkan 4 mL MK-M199
di resuspensi hingga homogen
dimasukkan ke dalam flask
ditambahkan 5 mL MK-M199 kedalam
setiap flask
dihomogenkan
diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
diberi identitas pada flask
disimpan dalam inkubator CO2 5%
Sel Vero
89
Lampiran 23. Bagan Panen Sel HeLa
Sel HeLa, alat dan
bahan
dipersiapkan dan dikondisikan
diamati apakah sel telah konfluen 80%
dibuang MK-RPMI dari flask dengan mikropipet
dicuci sel 2x dengan PBS
ditambahkan 400 µL tripsin-EDTA 0,25%
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit
ditambahkan 4 mL MK-RPMI
di resuspensi dengan mikropipet
diamati sel dibawah mikroskop inverted
di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel Panen HeLa
90
Lampiran 24. Bagan Panen Sel Vero
Sel Vero, alatdan
bahan
dipersiapkan dan dikondisikan
diamati apakah sel telah konfluen 80%
dibuang MK-M199 dari flask dengan mikropipet
dicuci sel 2x dengan PBS
ditambahkan 400 µL tripsin-EDTA 0,25%
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit
ditambahkan 4 mL MK-M199
di resuspensi dengan mikropipet
diamati sel dibawah mikroskop inverted
di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel Panen Vero
91
Lampiran 25. Bagan Penghitungan SelHeLa dan Sel Vero
Kultur Sel HeLa dan Sel Vero
diambil 10 µL panenan sel
dipipetkan kedalam hemositometer
dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel HeLa dan Sel Vero
92
Lampiran 26. Bagan Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak
Etanol
ditimbang sebanyak 50 mg
dimasukkan ke dalam polytube
dilarutkan dalam 500 µL DMSO
di vortex
dibuat pengenceran sampai diperoleh
konsentrasi 1000µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL;
125 µg/mL;62,5 µg/mL;31,25 µg/mL dan 15,625
µg/mL
Larutan Uji
93
Lampiran 27. Bagan Pengujian Sitotoksik
Sel HeLa dan Sel Vero
ditanam pada microplate 96 sumuran dengan
kepadatan 1 x 104
diinkubasi selama 24 jam
dibuang medium
ditambahkan medium baru
ditambahkan larutan uji
diinkubasi selama 24 jam
dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
dicuci dengan PBS
ditambahkan 100 µL MK dan 10 µL MTT (5 mg/mL)
diinkubasi selama 4-6 jam
ditambahkan SDS (sebagai stopper)
dibungkus dengan aluminium foil
dibiarkan selama 1 malam
dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm
Absorbansi
dihitung % sel hidup
dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan
SPSS 19
Nilai IC50
94
Lampiran 28. Gambar Sel HeLa dan Sel Vero yang telah konfluen (dilihat di
bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Sel HeLa
Sel Vero
95
Lampiran 29. Gambar Sel HeLa dan Sel Vero dalam kamar hitung (dilihat di
bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Sel HeLa
Sel Vero
96
Lampiran 30. Gambar morfologi sel kanker serviks HeLa dan Vero (dilihat
dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10) setelah
pemberian ekstrak dari konsentrasi tertinggi hingga terendah
Morfologi sel kanker serviks HeLa (dilihat dengan mikroskop inverted dengan
perbesaran 10x10)
Konsentrasi ekstrak 500 µg/mL
Konsentrasi ekstrak 250 µg/mL
Morfologi sel kanker serviks Vero (dilihat dengan mikroskop inverted dengan
perbesaran 10x10)
Konsentrasi ekstrak 1000 µg/mL
Konsentrasi ekstrak 500 µg/mL
97
Lampiran 31. Gambar Laminar air flow, Mikroskop Inverted, ELISA Reader
dan Inkubator CO2 5%
Laminar air flow
Mikroskop Inverted
Inkubator CO2 5%
ELISA reader
98
(Zanthoxylum acanthopodium DC.)
68
Lampiran 2. Gambar Makroskopik Simplisia Buah Andaliman
Simplisia buah andaliman
Serbuk simplisia buah andaliman
69
Lampiran 3. Gambar Mikroskopik Simplisia Buah Andaliman
1
2
3
4
Keterangan:
1. Kelenjar minyak berwarna kuning kemerahan
2. Sel rambut yang kolaps
3. Sel rambut penutup
4. Epidermis kulit biji berwarna jingga kemerahan
70
Lampiran 4. Bagan Kerja Penelitian
Buah Andaliman
dicuci dari pengotor sampai bersih
ditiriskan
ditimbang berat basahnya
Buah Andaliman
dikeringkan
ditimbang berat keringnya
Simplisia
dihaluskan dengan blender
Serbuk Simplisia
Karakterisasi Simplisia
Skrining Fitokimia
Ekstraksi secara maserasi
Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan alkaloida
Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan glikosida
Penetapan kadar air
Pemeriksaan
glikosida antrakinon
Penetapan kadar sari yang
larut dalam air
Pemeriksaan saponin
Penetapan kadar sari yang
larut dalam etanol
Penetapan kadar abu total
Pemeriksaan tannin
Pemeriksaan
steroid/triterpenoid
di maserasi
dengan etanol
96%
Maserat
diuapkan dengan
rotary
evaporator
Ekstrak
Kental
dilakukan uji
sitotoksik
Nilai IC50
Penetapan kadar abu yang
tidak larut asam
71
Lampiran 5. Perhitungan Kadar Air Simplisia Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat sampel (g)
5,009
5,019
5,012
Volume awal (mL)
1,80
2,10
2,45
Volume akhir (mL)
2,10
2,45
2,75
Volume akhir − Volume awal
x 100%
Berat sampel
2,10 - 1,80
x 100% = 5,98 %
1. Kadar air =
5,009
% Kadar air =
2. Kadar air =
2,45 - 2,10
x 100% = 6,97 %
5,019
3. Kadar air =
2,75 - 2,45
x 100% = 5,98 %
5,012
% Rata-rata kadar air =
5,98 % + 6,97 % + 5,96 %
= 6,30 %
3
72
Lampiran 6. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Air Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat Sampel (g)
5,032
5,019
5,002
% Kadar sari larut dalam air =
Berat Sari (g)
0,135
0,120
0,119
Berat sari (g)
100
x
x 100%
Berat sampel (g)
20
1. Kadar sari larut dalam air =
0,135 100
x 100% = 13,41%
x
20
5,032
2. Kadar sari larut dalam air =
0,120 100
x 100% = 11,95%
x
20
5,019
3. Kadar sari larut dalam air =
0,119 100
x 100% = 11,89%
x
20
5,002
% Rata-rata kadar sari larut dalam air =
13,41% + 11,95% + 11,89%
= 12,41%
3
73
Lampiran 7. Perhitungan Kadar Sari Larut dalam Etanol Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat sampel (g)
5,015
5,021
5,012
Berat sari (g)
0,160
0,173
0,157
% Kadar sari larut dalam etanol =
Berat Sari (g)
100
x
x 100%
Berat Sampel (g)
20
1. Kadar sari larut dalam etanol =
0,160 100
x 100% = 15,95 %
x
20
5,015
2. Kadar sari larut dalam etanol =
0,173 100
x 100% = 17,22 %
x
20
5,021
3. Kadar sari larut dalam etanol =
0.157 100
x 100% = 15,66 %
x
20
5,012
% Rata-rata kadar sari larut dalam etanol =
15,95% + 17,22% + 15,66%
3
= 16,28%
74
Lampiran 8. Perhitungan Kadar Abu Total Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No.
1.
2.
3.
Berat Sampel (g)
2,0001
2,0009
2,0010
Berat Abu (g)
0,0929
0,0932
0,0920
% Kadar abu total =
Berat Abu (g)
x 100%
Berat Sampel (g)
1. Kadar abu total =
0,0929
x 100% = 4,64%
2,0001
2. Kadar abu total =
0,0932
x 100% = 4,65%
2,0009
3. Kadar abu total =
0,0920
x 100% = 4.59%
2,0010
% Rata-rata kadar abu total =
4,64% + 4,65% + 4,59%
= 4,62%
3
75
Lampiran 9. Perhitungan Kadar Abu Tidak Larut dalam Asam Simplisia
Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
No. Berat Sampel (g)
1.
2,0001
2.
2,0009
3.
2,0010
Berat Abu (g)
0,0042
0,0048
0,0039
% Kadar abu tidak larut dalam asam =
Berat Abu (g)
x 100%
Berat Sampel (g)
1. Kadar abu tidak larut dalam asam =
0,0042
x 100% = 0,20%
2,0001
2. Kadar abu tidak larut dalam asam =
0,0048
x 100% = 0,23%
2,0009
3. Kadar abu tidak larut dalam asam =
0,0039
x 100% = 0,19%
2,0010
% Rata-rata kadar abu tidak larut dalam asam =
0,20% + 0,23% + 0,19 %
3
= 0,20%
76
Lampiran 10. Rendemen Ekstrak Etanol Buah Andaliman
Berat simplisia kering = 860 g
Berat ekstrak
Rendemen
= 54,573 g
=
=
Berat Ekstrak
Berat Simplisia kering
54,573
860
x 100 %
x 100% = 6,34%
77
Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sel HeLa Pada Hemositometer
Jumlah sel HeLa total (A + B + C + D) = 219 sel
Jumlah sel/mL :
∑sel/mL=
∑ sel A+ ∑ sel B+∑ sel C + ∑ sel D
×104
4
∑sel/mL =
219
×104
4
= 54,75 x 104 sel/mL
Volume Panenan Sel :
Volume panenan sel =
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/mL
Volume panenan sel HeLa =
1×106
54,75×104
= 1,20 mL di tambahkan media kultur hingga 10 ml untuk 1 plate
78
Lampiran 12. Perhitungan Jumlah Sel Vero Pada Hemositometer
Jumlah Sel Vero total (A + B + C + D) = 357 sel
Jumlah sel/mL :
∑sel/mL=
∑ sel A+ ∑ sel B+∑ sel C + ∑ sel D
×104
4
∑���/�� =
���
�
× ���
= 89,25 x 104 sel/mL
Volume Panenan Sel Vero :
Volume panenan sel =
Volume panenan sel=
Jumlah total sel yang diperlukan
Jumlah sel terhitung/mL
1×106
89,25×104
= 1,2 mL di tambahkan media kultur hingga 10 ml untuk 1 plate
79
Lampiran 13. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium
DC.) terhadap Sel HeLa
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,678
0,678
0,679
0,675
Absorbansi kontrol Media
(b)
0,078
0,080
0,108
0,089
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Absorbansi sel dengan perlakuan –Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel –Absorbansi kontrol media
x 100 %
500
0,120 0,112
0,129
RataRata
(c)
0,140
250
0,136 0,136
0,149
0,140
0.052 0.586
9
91
125
0,316 0,335
0,305
0,319
0.230 0.586
39
61
62,5
0,336 0,369
0,324
0,343
0.254 0.586
43
57
31,25
0,382 0,330
0,348
0,353
0.265 0.586
45
55
15,625 0,411 0,384
0,412
0,402
0.314 0.586
78
47
Kadar
Absorbansi (c)
1
2
3
80
% Sel
Hidup
% Sel
Mati
0.052 0.586
9
91
c-b
a-b
Lampiran 14. Perhitungan Persen Sel Hidup Dari Berbagai Konsentrasi Larutan
Uji Ekstrak Etanol Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium
DC.) terhadap Sel Vero
No.
1
2
3
Rata-Rata
Absorbansi Kontrol Sel
(a)
0,844
0,895
0,819
0,853
Absorbansi kontrol Media
(b)
0,062
0,058
0,054
0,058
Rumus Perhitungan Persen Sel Hidup :
% Hidup =
Absorbansi sel dengan perlakuan –Absorbansi kontrol media
Absorbansi kontrol media sel –Absorbansi kontrol media
x 100 %
1
2
3
RataRata
(c)
1000
0.09
0.084
0.099
0.091
0.033 0.795
4
96
500
0.293
0.372
0.306
0.324
0.266 0.795
33
67
250
0.597
0.646
0.594
0.612
0.554 0.795
70
30
125
0.641
0.688
0.644
0.658
0.600 0.795
75
25
62,5
0.686
0.727
0.748
0.720
0.662 0.795
83
17
31,25
0.737
0.712
0.769
0.739
0.681 0.795
86
14
Kadar
Absorbansi
81
c –b
a -b
% Sel
Hidup
% Sel
Mati
Lampiran 15. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sel HeLa menggunakan analisa
Probit SPSS 19
Confidence Limits
95% Confidence Limits for
% hambat
Probability
LOGITa
Estimate
Lower
Bound
95% Confidence Limits for log
(% hambat)b
Upper Bound
Estimate
Lower
Bound
Upper
Bound
.010
205.322
.
.
2.312
.
.
.020
161.316
.
.
2.208
.
.
.030
139.881
.
.
2.146
.
.
.040
126.288
.
.
2.101
.
.
.050
116.565
.
.
2.067
.
.
.060
109.102
.
.
2.038
.
.
.070
103.105
.
.
2.013
.
.
.080
98.125
.
.
1.992
.
.
.090
93.888
.
.
1.973
.
.
.100
90.213
.
.
1.955
.
.
.150
76.977
.
.
1.886
.
.
.200
68.310
.
.
1.834
.
.
.250
61.892
.
.
1.792
.
.
.300
56.781
.
.
1.754
.
.
.350
52.505
.
.
1.720
.
.
.400
48.797
.
.
1.688
.
.
.450
45.487
.
.
1.658
.
.
.500
42.462
.
.
1.628
.
.
.550
39.637
.
.
1.598
.
.
.600
36.949
.
.
1.568
.
.
.650
34.339
.
.
1.536
.
.
.700
31.753
.
.
1.502
.
.
.750
29.131
.
.
1.464
.
.
.800
26.394
.
.
1.422
.
.
.850
23.422
.
.
1.370
.
.
.900
19.986
.
.
1.301
.
.
.910
19.204
.
.
1.283
.
.
.920
18.374
.
.
1.264
.
.
.930
17.487
.
.
1.243
.
.
.940
16.526
.
.
1.218
.
.
.950
15.468
.
.
1.189
.
.
.960
14.277
.
.
1.155
.
.
.970
12.889
.
.
1.110
.
.
.980
11.177
.
.
1.048
.
.
.990
8.781
.
.
.944
.
.
a. A heterogenity factor is used.
b. Logarithm base = 10.
82
Lampiran 16. Perhitungan nilai IC50 Ekstrak Etanol Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) Sel Vero menggunakan
analisa Probit SPSS 19
Confidence Limits
95% Confidence Limits for %
hambat
Probability
LOGITa
Estimate
Lower
Bound
95% Confidence Limits for log(%
hambat)b
Upper Bound Estimate
Lower
Bound
Upper
Bound
.010
6665.759 1518.945
4092413.680
3.824
3.182
6.612
.020
4554.061 1190.006
1428220.379
3.658
3.076
6.155
.030
3576.232 1017.704
733508.110
3.553
3.008
5.865
.040
2981.662
903.815
444785.052
3.474
2.956
5.648
.050
2571.726
820.007
296324.379
3.410
2.914
5.472
.060
2267.523
754.340
209853.642
3.356
2.878
5.322
.070
2030.552
700.714
155155.999
3.308
2.846
5.191
.080
1839.466
655.612
118456.436
3.265
2.817
5.074
.090
1681.340
616.836
92717.393
3.226
2.790
4.967
.100
1547.828
582.920
74030.411
3.190
2.766
4.869
.150
1098.882
458.692
29315.309
3.041
2.662
4.467
.200
836.974
375.820
14163.256
2.923
2.575
4.151
.250
662.634
313.796
7659.651
2.821
2.497
3.884
.300
537.253
263.977
4458.745
2.730
2.422
3.649
.350
442.350
221.922
2736.813
2.646
2.346
3.437
.400
367.846
185.072
1751.676
2.566
2.267
3.243
.450
307.729
151.896
1162.669
2.488
2.182
3.065
.500
258.167
121.581
798.957
2.412
2.085
2.903
.550
216.587
93.956
568.665
2.336
1.973
2.755
.600
181.190
69.404
419.375
2.258
1.841
2.623
.650
150.673
48.592
319.723
2.178
1.687
2.505
.700
124.057
32.011
250.443
2.094
1.505
2.399
.750
100.583
19.661
199.676
2.003
1.294
2.300
.800
79.632
11.069
160.151
1.901
1.044
2.205
.850
60.653
5.513
127.292
1.783
.741
2.105
.900
43.060
2.235
97.830
1.634
.349
1.990
.910
39.641
1.792
92.069
1.598
.253
1.964
.920
36.233
1.408
86.278
1.559
.149
1.936
.930
32.824
1.079
80.412
1.516
.033
1.905
.940
29.393
.801
74.412
1.468
-.096
1.872
.950
25.916
.569
68.197
1.414
-.245
1.834
.960
22.353
.381
61.641
1.349
-.419
1.790
.970
18.637
.232
54.533
1.270
-.635
1.737
.980
14.635
.120
46.446
1.165
-.923
1.667
.990
9.999
.042
36.214
1.000
-1.378
1.559
a. A heterogenity factor is used.
b. Logarithm base = 10.
83
Lampiran 17. Bagan Kerja Pembuatan Ekstrak Etanol Buah Andaliman
Buah Andaliman
dicuci dari pengotor sampai bersih
ditiriskan
ditimbang berat basahnya
Buah Andaliman
dikeringkan
ditimbang berat keringnya
Simplisia
dihaluskan dengan blender
disimpan dalam wadah yang
tertutup rapat sebelum digunakan
300 g serbuk simplisia
dimasukkan ke dalam wadah
ditambahkan 2250 mL etanol 96%
hingga serbuk terendam
dibiarkan selama 5 hari terlindung
dari cahaya, sambil sesekali diaduk
disaring
Ampas
Maserat I
dicuci dengan etanol 96% secukupnya
hingga diperoleh 3000 mL
dibiarkan selama 2 hari terlindung dari cahaya
dienaptuangkan, disaring
Maserat II
Maserat I +II
dipekatkan
dengan
rotary
evaporator pada temperatur tidak
lebih dari 50oC
Ekstrak kental
Etanol Buah Andaliman
84
Lampiran 18. Bagan Pembuatan Media RPMI
RPMI Sachet
2 g Hepes
2 g NaHCO3
dimasukkan kedalam erlenmeyer
ditambahkan 800 mL aquabides steril
dihomogenkan dengan menggunakan
stirer magnet
diatur pH 7,2 - 7,4 (HCl 1 N
atau NaOH 1 N)
ditambahkan aquabides steril samapai 1 L
dilakukan sterilisasi dengan filter vacum
ditampung dalam botol steril
diberi identitas pada botol media
disimpan pada suhu 2 - 80 C
Media RPMI
85
Lampiran 19. Bagan Pembuatan Media M199
M199 Sachet
2 g Hepes
2,2 g NaHCO3
dimasukkan kedalam erlenmeyer
ditambahkan 800 mL aquabides steril
dihomogenkan dengan menggunakan
stirer magnet
diatur pH 7,2 - 7,4 (HCl 1N
atau NaOH 1N)
ditambahkan aquabides steril samapai 1 L
dilakukan sterilisasi dengan filter vaccum
ditampung dalam botol steril
diberi identitas pada botol media
disimpan pada suhu 2 - 80 C
Media M199
86
Lampiran 20. Bagan Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK-RPMI) dan
(MK-M199)
Media Kultur Lengkap (MK-RPMI)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizon
(amfoterisin B)
(0,5%)
PenisilinStreptomisin
(1%)
RPMI ad
100%
dicampur
diberi identitas pada botol MK-RPMI
disimpan pada suhu 2 - 80C
Media Kultur Lengkap
(MK-RPMI)
Media Kultur Lengkap (MK-M199)
Fetal Bovine
Serum (FBS)
(10%)
Fungizon
(amfoterisin B)
(0,5%)
PenisilinStreptomisin
(1%)
M199 ad
100%
dicampur
diberi identitas pada botol MK-M199
disimpan pada suhu 2 - 80C
Media Kultur Lengkap
(MK-M199)
87
Lampiran 21. Bagan Penumbuhan Sel HeLa
Sel HeLa
diambil dari tangki nitrogen atau freezer
diambil beberapa tetes
dimasukkan kedalam konikel yg berisi
MK-RPMI
disentrifuge 600 rpm selama 5 menit
dibuang supernatan
ditambahkan 4 mL MK-RPMI
di resuspensi hingga homogen
dimasukkan ke dalam flask
ditambahkan 5 mL MK-RPMI kedalam setiap
flask
dihomogenkan
diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
diberi identitas pada flask
disimpan dalam inkubator CO2 5%
Sel HeLa
88
Lampiran 22. Bagan Penumbuhan Sel Vero
Sel Vero
diambil dari tangki nitrogen atau freezer
diambil beberapa tetes
dimasukkan kedalam konikel yg berisi
MK-M199
disentrifuge 600 rpm selama 5 menit
dibuang supernatan
ditambahkan 4 mL MK-M199
di resuspensi hingga homogen
dimasukkan ke dalam flask
ditambahkan 5 mL MK-M199 kedalam
setiap flask
dihomogenkan
diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
diberi identitas pada flask
disimpan dalam inkubator CO2 5%
Sel Vero
89
Lampiran 23. Bagan Panen Sel HeLa
Sel HeLa, alat dan
bahan
dipersiapkan dan dikondisikan
diamati apakah sel telah konfluen 80%
dibuang MK-RPMI dari flask dengan mikropipet
dicuci sel 2x dengan PBS
ditambahkan 400 µL tripsin-EDTA 0,25%
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit
ditambahkan 4 mL MK-RPMI
di resuspensi dengan mikropipet
diamati sel dibawah mikroskop inverted
di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel Panen HeLa
90
Lampiran 24. Bagan Panen Sel Vero
Sel Vero, alatdan
bahan
dipersiapkan dan dikondisikan
diamati apakah sel telah konfluen 80%
dibuang MK-M199 dari flask dengan mikropipet
dicuci sel 2x dengan PBS
ditambahkan 400 µL tripsin-EDTA 0,25%
diinkubasi dalam inkubator CO2 5% selama 5 menit
ditambahkan 4 mL MK-M199
di resuspensi dengan mikropipet
diamati sel dibawah mikroskop inverted
di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
ditransfer sel kedalam tabung konikel
Sel Panen Vero
91
Lampiran 25. Bagan Penghitungan SelHeLa dan Sel Vero
Kultur Sel HeLa dan Sel Vero
diambil 10 µL panenan sel
dipipetkan kedalam hemositometer
dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel HeLa dan Sel Vero
92
Lampiran 26. Bagan Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak
Etanol
ditimbang sebanyak 50 mg
dimasukkan ke dalam polytube
dilarutkan dalam 500 µL DMSO
di vortex
dibuat pengenceran sampai diperoleh
konsentrasi 1000µg/mL; 500 µg/mL; 250 µg/mL;
125 µg/mL;62,5 µg/mL;31,25 µg/mL dan 15,625
µg/mL
Larutan Uji
93
Lampiran 27. Bagan Pengujian Sitotoksik
Sel HeLa dan Sel Vero
ditanam pada microplate 96 sumuran dengan
kepadatan 1 x 104
diinkubasi selama 24 jam
dibuang medium
ditambahkan medium baru
ditambahkan larutan uji
diinkubasi selama 24 jam
dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
dicuci dengan PBS
ditambahkan 100 µL MK dan 10 µL MTT (5 mg/mL)
diinkubasi selama 4-6 jam
ditambahkan SDS (sebagai stopper)
dibungkus dengan aluminium foil
dibiarkan selama 1 malam
dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm
Absorbansi
dihitung % sel hidup
dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan
SPSS 19
Nilai IC50
94
Lampiran 28. Gambar Sel HeLa dan Sel Vero yang telah konfluen (dilihat di
bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Sel HeLa
Sel Vero
95
Lampiran 29. Gambar Sel HeLa dan Sel Vero dalam kamar hitung (dilihat di
bawah mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10)
Sel HeLa
Sel Vero
96
Lampiran 30. Gambar morfologi sel kanker serviks HeLa dan Vero (dilihat
dengan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x10) setelah
pemberian ekstrak dari konsentrasi tertinggi hingga terendah
Morfologi sel kanker serviks HeLa (dilihat dengan mikroskop inverted dengan
perbesaran 10x10)
Konsentrasi ekstrak 500 µg/mL
Konsentrasi ekstrak 250 µg/mL
Morfologi sel kanker serviks Vero (dilihat dengan mikroskop inverted dengan
perbesaran 10x10)
Konsentrasi ekstrak 1000 µg/mL
Konsentrasi ekstrak 500 µg/mL
97
Lampiran 31. Gambar Laminar air flow, Mikroskop Inverted, ELISA Reader
dan Inkubator CO2 5%
Laminar air flow
Mikroskop Inverted
Inkubator CO2 5%
ELISA reader
98