Uji Efek Imunomodulator Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa (Scheff) Boerl.) Pada Mencit Jantan Chapter III V
BAB III
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengumpulan bahan,
pengolahan bahan, pembuatan ekstrak etanol daun mahkota dewa, penyiapan
hewan percobaan (mencit), penyiapan bahan kontrol dan uji, dan pengujian efek
imunomodulator terhadap aktivitas fagositosis dengan metode bersihan karbon.
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biofarmasetika dan Farmakokinetika
dan Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
Data hasil penelitian dianalisis dengan program SPSS 22 menggunakan uji OneWay ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tuckey.
3.1
Alat dan Bahan
3.1.1 Alat - alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas
laboratorium, blender, rotary evaporator, seperangkat alat destilasi penetapan
kadar air, tabung reaksi, corong, kertas saring, penjepit tabung, spatula, cawan
penguap, kertas perkamen, lumpang dan stamper, seperangkat alat bedah, oral
sonde, spuit, kandang mencit, neraca hewan, mikro pipet, dan spektrofotometer
UV-Vis (Shimadzu 1240).
3.1.2 Bahan - bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi daun mahkota
dewa, etanol 96%, akuades, tinta karbon (pelikan B17), CMC-Na, tablet Imboost®
(SOHO), natrium sitrat, asam asetat 1%, dan NaCl 0,9%. larutan kloral hidrat,
toluen, asam klorida 2 N, air suling, pereaksi Mayer (raksa (II) klorida dan kalium
Universitas Sumatera Utara
iodida), pereaksi Dragendorff (bismuth, asam nitrat, dan kalium iodida), pereaksi
Bauchardat (iodium dan kalium iodida), amil alkohol, metanol, natrium sulfat
anhidrat, asam klorida pekat, asam klorida encer, serbuk Mg, asam sulfat pekat,
timbal (II) asetat 0,4 M, kloroform, isopropanol, pereaksi Molish ( - naftol dan
asam nitrat), pereaksi besi (III) klorida, n-heksan, dan pereaksi LiebermanBourchard (asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat).
3.2
Hewan Uji
3.2.1 Etika Penanganan Hewan Uji
Etika penanganan hewan uji berdasarkan metode yang digunakan dalam
penelitian disesuaikan dengan kode etik di Komite Etik Penelitian Hewan
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam – Universitas Sumatera Utara
disetujui pelaksanaannya oleh Ketua Komite Etik Penelitian Hewan FMIPA USU,
surat hasil etika penangan hewan coba dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 40.
3.2.2 Jumlah Hewan Uji
Hewan percobaan yang akan digunakan adalah mencit jantan sebanyak 25
ekor, dengan berat rentang 20-30 gram.
3.3
Penyiapan Tanaman
Penyiapan tanaman meliputi pengumpulan tanamaan, identifikasi tanaman
dan pengolahan tanaman.
3.3.1 Pengumpulan tanaman
Pengumpulan
tanaman
dilakukan
secara
purposif
yaitu
tanpa
membandingkan tanaman yang sama dari daerah lain. Sampel yang diambil yaitu
Universitas Sumatera Utara
daun mahkota dewa yang masih segar dari Jl. Bunga Raya, Medan Sunggal, Kota
Medan, Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi tanaman
Tanaman yang digunakan adalah daun mahkota dewa yang telah
diidentifikasi Herbarium Medanense, Universitas Sumatera Utara. Surat hasil
identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 41.
3.3.3 Pengolahan tanaman
Daun mahkota dewa yang telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotoran,
selanjutnya dicuci dibawah air mengalir beberapa kali hingga bersih, kemudian
ditiriskan lalu disebarkan diatas perkamen sampai merata hingga airnya terserap,
setelah itu ditimbang dan diperoleh berat basahnya 2,5 kg, kemudian dikeringkan
dilemari pengering. Setelah sampel kering ditimbang berat keringnya dan
diperoleh berat keringnya 750 g. Kemudian sampel yang sudah kering dihaluskan
sampai menjadi serbuk dengan menggunakan blender, selanjutnya dimasukkan
dalam wadah plastik tertutup, serbuk sebelum dipakai disimpan ditempat kering
terlindung dari cahaya (Depkes RI, 1985).
3.4
Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan
mikroskopik, penetapan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol,
kadar abu total, dan kadar abu tidak larut asam (Depkes RI, 1995).
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi
simplisia daun mahkota dewa dengan cara memperhatikan warna, bentuk, dan
tekstur sampel.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia daun mahkota dewa
dilakukan dengan cara menaburkan simplisia diatas gelas preparat yang telah
diteteskan dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan gelas penutup kemudian
dilihat dibawah mikroskop.
3.4.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi (destilasi toluen).
Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung
penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik.
Cara Kerja
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama
2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian
volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml, lalu ke
dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang
seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Pada saat toluen mendidih,
setelah itu kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar
air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik.
Saat semua air terdestilasi, setelah itu dibilas bagian dalam pendingin dengan
toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume
air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai
dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air
dihitung dalam persen (WHO, 1998).
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Penetapan kadar sari larut air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan, dimaserasi selama 24 jam
dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml) dalam
labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama
18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan
pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Hitung kadar dalam persen sari yang larut
dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (Depkes RI,
1995).
3.4.5 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimasersi selama 24
jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20
ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasarkan rata yang
telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Kadar
sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara
(Depkes RI, 1995).
3.4.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama
dimasukkan dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran
dilakukan pada suhu 600oC selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang
sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan diudara (Depkes RI, 1995).
Universitas Sumatera Utara
3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu didinginkan dengan 25 ml
asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring dengan kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas,
dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu
yang tidak larut asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan diudara (Depkes
RI, 1995).
3.5
Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia daun mahkota dewa meliputi
pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, tanin, saponin dan
steroid/triterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia daun mahkota dewa ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian
ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas
penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh
dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan
0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi:
1. Tabung 1 ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
2. Tabung 2 ditambahkan 2 tetes pereaksi Bauchardat
3. Tabung 3 ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Akaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit
dua dari tiga percobaan diatas (Depkes RI, 1995).
Universitas Sumatera Utara
3.5.2 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia daun mahkota dewa ditambahkan 100 ml
air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat
yang diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu ditambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1
ml HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoid
positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol
(Farnsworth, 1966).
3.5.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia daun mahkota dewa ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari
dengan 30 ml campuran etanol 95 % dengan air (7:3) dan 10 ml asam klorida 2 N,
direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat
ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok,
didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20
ml campuran isopropanol dan kloroform (2:3). Pada kumpulan sari tambahkan
natrium sulfat anhidrat, disaring dan uapkan pada suhu 500C. Sisanya dilarutkan
dalam 2 ml metanol. Larutan ini digunakan untuk percobaan berikut : 0,1 ml
larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas
air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara
perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung,
terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan
gula (Depkes RI, 1995).
3.5.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu
filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi (III) klorida. Terjadi
Universitas Sumatera Utara
warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.5.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia daun mahkota
dewa dimasukkan ke
dalam tabung reaksi ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
selama 10 detik. Jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1-10 cm yang stabil
tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan satu tetes asam
klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.5.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia daun mahkota dewa dimaserasi dengan 20
ml eter selama 2 jam, disaring, setelah itu filtrat yang diperoleh diuapkan dengan
menggunakan cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 2 tetes pereaksi
Lieberman-Bourchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah
menjadi biru atau hijau menunjukkan adanya steroid/triterpenoid yang terkandung
di dalam simplisia atau ekstrak (Farnsworth, 1966).
3.6
Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa (EEDMD)
Pembuatan ekstrak etanol daun mahkota dewa dilakukan dengan cara
maserasi bertingkat menggunakan pelarut etanol 96% dengan prosedur sebagai
berikut: sebanyak 500 g residu serbuk simplisia dari maserasi sebelumnya
menggunakan etil asetat dikeringkan lalu dimaserasi dengan pelarut etanol
sebanyak 3750 ml, ditutup, dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya,
sambil sesekali diaduk. Kemudian disaring dan maserat yang diperoleh
ditampung. Residu diekstraksi kembali menggunakan etanol sebanyak 1250 ml,
dimasukkan dalam bejana dan disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya
selama 2 hari, kemudian dienaptuangkan (Depkes RI, 1979). Seluruh maserat
Universitas Sumatera Utara
digabung dan dipekatkan dengan alat rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari
40ºC. Diperoleh ekstrak kental sebanyak 83,6 g. Rendemen yang diperoleh
16,72%.
3.7
Uji Efek Imunomodulator
Uji efek imunomodulator meliputi penyiapan kontrol, bahan uji, penyiapan
hewan percobaan, dan uji bersihan karbon. Penyiapan kontrol dan bahan uji
meliputi pembuatan suspensi CMC-Na 1%, suspensi Imboost®, suspensi karbon,
dan suspensi EEDMD 50 mg/kg bb, 100 mg/kg bb, dan 200 mg/kg bb.
3.7.1 Pembuatan suspensi CMC-Na 1%
Sebanyak 1 g CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling
panas sebanyak 20 ml didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang
transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air,
kemudian dituang ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambah air suling sampai
batas tanda (Anief, 2000).
3.7.2 Pembuatan Suspensi Imboost®
Satu tablet Imboost® mengandung 250 mg bahan aktif, sebanyak 2 tablet
Imboost® (500 mg) dimasukkan ke dalam lumpang, digerus. Kemudian
ditambahkan dengan suspensi CMC-Na 1% secukupnya dan dihomogenkan. Lalu
dituangkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dan dicukupkan dengan suspensi
CMC- Na 1% hingga garis tanda. Suspensi dihomogenkan kembali dengan cara
dikocok ringan. Diperoleh konsentrasi suspensi Imboost® 0,5%.
3.7.3 Pembuatan Suspensi Karbon
Suspensikan 1,6 ml tinta pelikan (B17) ke dalam 8,4 ml suspensi CMC-Na
1% b/v dalam larutan fisiologis NaCl (Faradilla, 2014).
Universitas Sumatera Utara
3.7.4 Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun mahkota dewa (EEDMD)
Sebanyak 50 mg EEDMD dimasukkan ke dalam lumping dan ditambahkan
suspensi CMC-Na 1% sedikit demi sedikit sambal digerus sampai homogen lalu
dimasukkan ke labu tentukur 10 ml. Volume dicukupkan dengan suspensi CMCNa 1% sampai garis tanda. Prosedur yang sama dilakukan untuk pembuatan
suspensi EEDMD 100, dan 200 mg/kg bb.
3.7.5 Pengujian efek imunomodulator
Efek imunomodulator ekstrak etanol daun mahkota dewa (EEDMD)
ditentukan
menggunakan
metode
bersihan
karbon
dengan
mengukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 640,5
nm.
Sejumlah 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan. Tiap
kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Hewan dikelompokkan sebagai berikut:
Kelompok I
: diberi sediaan suspensi CMC-Na 1 %.
Kelompok II
: diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 50 mg/kg bb
Kelompok III
: diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 100 mg/kg bb
Kelompok IV : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 200 mg/kg bb
Kelompok V
: diberi sediaan suspensi Imboost® dengan dosis 32,5 mg/kg bb
Tiap kelompok diberikan ekstrak uji secara oral satu kali sehari selama 7
hari berturut-turut. Pada hari ke-8 dilakukan pengambilan darah dan penyuntikan
suspensi karbon. Dipotong tiap ujung ekor mencit dan darah diambil melalui
ujung ekor mencit. Darah ditampung ke dalam tube yang telah terisi Na-sitrat,
kemudian darah diambil 25µl dan ditambahkan dengan 4 ml asam asetat 1% ke
dalam kuvet, darah pertama ini dipakai sebagai blanko (menit 0). Kemudian 0,1
ml/10 g BB suspensi karbon disuntikkan secara intravena melalui pembuluh darah
Universitas Sumatera Utara
di ekor, dan pada menit ke-5, 10, 15, dan 20 setelah penyuntikkan karbon,
dilakukan pengambilan darah, ditampung ke dalam tube yang telah terisi Na-sitrat
kemudian diambil sebanyak 25µ l, ditambahkan dengan 4 ml asam asetat 1%,
kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UVVisible pada panjang gelombang 640,5 nm. Setelah dua belas jam diambil
darahnya, mencit dikorbankan, kemudian organ hati dan limfa mencit diisolasi
dan ditimbang (Wagner, 1991)
Dihitung konstanta kecepatan eliminasi karbon (K), indeks fagositosis (α)
dan indeks stimulasi dengan menggunakan rumus:
Konstanta kecepatan eliminasi karbon (K)
Indeks Fagositosis
Indeks Stimulasi
= Log OD5 – Log OD20
t 2 – t1
= K 1/3 x berat hewan
Berat hati + berat limfa
=
Indeks fagositosis kelompok uji
Indeks fagositosis kelompok kontrol
Dimana :
OD10 adalah absorbansi pada menit ke-5
OD20 adalah absorbansi pad menit ke-20
t1 adalah waktu pertama pengambilan darah
t2 adalah waktu terakhir pengambilan darah
Indeks fagositosis dan indeks stimulasi dari tiap kelompok uji dibandingkan
dengan kelompok kontrol (Shukla, dkk., 2009).
3.8
Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 22
untuk menentukan homogenitas dan normalitasnya dengan uji ANAVA satu arah
(One-Way ANOVA) dan untuk mengetahui perbedaan rata-rata diantara
perlakuan. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji Tukey
HSD untuk mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan
nilai signifikansi (p0,05). Pada menit ke-10
menunjukkan laju eliminasi karbon CMC-Na 1% berbeda signifikan (p0,05) dengan Imboost® 32,5 mg/kg bb.
0.09
0.08
0.07
Absorbansi
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
5
10
15
20
Menit keCMC Na 1%
EEDMD 50 mg/kg bb
EEDMD 100 mg/kg bb
EEDMD 200 mg/kg bb
Imboost 32,5 mg/kg bb
Gambar 4.1 Grafik rata-rata laju eliminasi karbon
Pada menit ke-15 menunjukkan laju eliminasi karbon CMC-Na 1%
berbeda signifikan (p0,05) dengan EEDMD 200 mg/kg bb tetapi
Universitas Sumatera Utara
berbeda signifikan dengan EEDMD 50 mg/kg bb dan 100 mg/kg bb. EEDMD 200
mg/kg bb berbeda signifikan (p0,05) dengan
EEDMD 50 mg/kg bb.
Pada menit ke-20 menunjukkan laju eliminasi karbon CMC-Na 1%
berbeda signifikan (p
METODE PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental meliputi pengumpulan bahan,
pengolahan bahan, pembuatan ekstrak etanol daun mahkota dewa, penyiapan
hewan percobaan (mencit), penyiapan bahan kontrol dan uji, dan pengujian efek
imunomodulator terhadap aktivitas fagositosis dengan metode bersihan karbon.
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biofarmasetika dan Farmakokinetika
dan Laboratorium Farmakognosi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
Data hasil penelitian dianalisis dengan program SPSS 22 menggunakan uji OneWay ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Tuckey.
3.1
Alat dan Bahan
3.1.1 Alat - alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas
laboratorium, blender, rotary evaporator, seperangkat alat destilasi penetapan
kadar air, tabung reaksi, corong, kertas saring, penjepit tabung, spatula, cawan
penguap, kertas perkamen, lumpang dan stamper, seperangkat alat bedah, oral
sonde, spuit, kandang mencit, neraca hewan, mikro pipet, dan spektrofotometer
UV-Vis (Shimadzu 1240).
3.1.2 Bahan - bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi daun mahkota
dewa, etanol 96%, akuades, tinta karbon (pelikan B17), CMC-Na, tablet Imboost®
(SOHO), natrium sitrat, asam asetat 1%, dan NaCl 0,9%. larutan kloral hidrat,
toluen, asam klorida 2 N, air suling, pereaksi Mayer (raksa (II) klorida dan kalium
Universitas Sumatera Utara
iodida), pereaksi Dragendorff (bismuth, asam nitrat, dan kalium iodida), pereaksi
Bauchardat (iodium dan kalium iodida), amil alkohol, metanol, natrium sulfat
anhidrat, asam klorida pekat, asam klorida encer, serbuk Mg, asam sulfat pekat,
timbal (II) asetat 0,4 M, kloroform, isopropanol, pereaksi Molish ( - naftol dan
asam nitrat), pereaksi besi (III) klorida, n-heksan, dan pereaksi LiebermanBourchard (asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat).
3.2
Hewan Uji
3.2.1 Etika Penanganan Hewan Uji
Etika penanganan hewan uji berdasarkan metode yang digunakan dalam
penelitian disesuaikan dengan kode etik di Komite Etik Penelitian Hewan
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam – Universitas Sumatera Utara
disetujui pelaksanaannya oleh Ketua Komite Etik Penelitian Hewan FMIPA USU,
surat hasil etika penangan hewan coba dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 40.
3.2.2 Jumlah Hewan Uji
Hewan percobaan yang akan digunakan adalah mencit jantan sebanyak 25
ekor, dengan berat rentang 20-30 gram.
3.3
Penyiapan Tanaman
Penyiapan tanaman meliputi pengumpulan tanamaan, identifikasi tanaman
dan pengolahan tanaman.
3.3.1 Pengumpulan tanaman
Pengumpulan
tanaman
dilakukan
secara
purposif
yaitu
tanpa
membandingkan tanaman yang sama dari daerah lain. Sampel yang diambil yaitu
Universitas Sumatera Utara
daun mahkota dewa yang masih segar dari Jl. Bunga Raya, Medan Sunggal, Kota
Medan, Sumatera Utara.
3.3.2 Identifikasi tanaman
Tanaman yang digunakan adalah daun mahkota dewa yang telah
diidentifikasi Herbarium Medanense, Universitas Sumatera Utara. Surat hasil
identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 2, halaman 41.
3.3.3 Pengolahan tanaman
Daun mahkota dewa yang telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotoran,
selanjutnya dicuci dibawah air mengalir beberapa kali hingga bersih, kemudian
ditiriskan lalu disebarkan diatas perkamen sampai merata hingga airnya terserap,
setelah itu ditimbang dan diperoleh berat basahnya 2,5 kg, kemudian dikeringkan
dilemari pengering. Setelah sampel kering ditimbang berat keringnya dan
diperoleh berat keringnya 750 g. Kemudian sampel yang sudah kering dihaluskan
sampai menjadi serbuk dengan menggunakan blender, selanjutnya dimasukkan
dalam wadah plastik tertutup, serbuk sebelum dipakai disimpan ditempat kering
terlindung dari cahaya (Depkes RI, 1985).
3.4
Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik dan
mikroskopik, penetapan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol,
kadar abu total, dan kadar abu tidak larut asam (Depkes RI, 1995).
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi
simplisia daun mahkota dewa dengan cara memperhatikan warna, bentuk, dan
tekstur sampel.
Universitas Sumatera Utara
3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia daun mahkota dewa
dilakukan dengan cara menaburkan simplisia diatas gelas preparat yang telah
diteteskan dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan gelas penutup kemudian
dilihat dibawah mikroskop.
3.4.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi (destilasi toluen).
Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung, tabung
penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik.
Cara Kerja
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama
2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian
volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml, lalu ke
dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang
seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Pada saat toluen mendidih,
setelah itu kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar
air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik.
Saat semua air terdestilasi, setelah itu dibilas bagian dalam pendingin dengan
toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume
air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai
dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air
dihitung dalam persen (WHO, 1998).
Universitas Sumatera Utara
3.4.4 Penetapan kadar sari larut air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan, dimaserasi selama 24 jam
dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml) dalam
labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama
18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan
pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Hitung kadar dalam persen sari yang larut
dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (Depkes RI,
1995).
3.4.5 Penetapan kadar sari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimasersi selama 24
jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20
ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasarkan rata yang
telah ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Kadar
sari larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara
(Depkes RI, 1995).
3.4.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama
dimasukkan dalam krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara,
kemudian diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran
dilakukan pada suhu 600oC selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang
sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah
dikeringkan diudara (Depkes RI, 1995).
Universitas Sumatera Utara
3.4.7 Penetapan kadar abu tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu didinginkan dengan 25 ml
asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring dengan kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas,
dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu
yang tidak larut asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan diudara (Depkes
RI, 1995).
3.5
Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia daun mahkota dewa meliputi
pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, tanin, saponin dan
steroid/triterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia daun mahkota dewa ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian
ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas
penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh
dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan
0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi:
1. Tabung 1 ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
2. Tabung 2 ditambahkan 2 tetes pereaksi Bauchardat
3. Tabung 3 ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Akaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit
dua dari tiga percobaan diatas (Depkes RI, 1995).
Universitas Sumatera Utara
3.5.2 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia daun mahkota dewa ditambahkan 100 ml
air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat
yang diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu ditambahkan 0,1 g serbuk Mg dan 1
ml HCl pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoid
positif jika terjadi warna merah, kuning, jingga pada lapisan amil alkohol
(Farnsworth, 1966).
3.5.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia daun mahkota dewa ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari
dengan 30 ml campuran etanol 95 % dengan air (7:3) dan 10 ml asam klorida 2 N,
direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat
ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok,
didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20
ml campuran isopropanol dan kloroform (2:3). Pada kumpulan sari tambahkan
natrium sulfat anhidrat, disaring dan uapkan pada suhu 500C. Sisanya dilarutkan
dalam 2 ml metanol. Larutan ini digunakan untuk percobaan berikut : 0,1 ml
larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas
air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara
perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung,
terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan
gula (Depkes RI, 1995).
3.5.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu
filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml
larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi (III) klorida. Terjadi
Universitas Sumatera Utara
warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.5.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia daun mahkota
dewa dimasukkan ke
dalam tabung reaksi ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
selama 10 detik. Jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1-10 cm yang stabil
tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan satu tetes asam
klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Depkes RI, 1995).
3.5.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia daun mahkota dewa dimaserasi dengan 20
ml eter selama 2 jam, disaring, setelah itu filtrat yang diperoleh diuapkan dengan
menggunakan cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 2 tetes pereaksi
Lieberman-Bourchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah
menjadi biru atau hijau menunjukkan adanya steroid/triterpenoid yang terkandung
di dalam simplisia atau ekstrak (Farnsworth, 1966).
3.6
Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa (EEDMD)
Pembuatan ekstrak etanol daun mahkota dewa dilakukan dengan cara
maserasi bertingkat menggunakan pelarut etanol 96% dengan prosedur sebagai
berikut: sebanyak 500 g residu serbuk simplisia dari maserasi sebelumnya
menggunakan etil asetat dikeringkan lalu dimaserasi dengan pelarut etanol
sebanyak 3750 ml, ditutup, dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya,
sambil sesekali diaduk. Kemudian disaring dan maserat yang diperoleh
ditampung. Residu diekstraksi kembali menggunakan etanol sebanyak 1250 ml,
dimasukkan dalam bejana dan disimpan di tempat yang terlindung dari cahaya
selama 2 hari, kemudian dienaptuangkan (Depkes RI, 1979). Seluruh maserat
Universitas Sumatera Utara
digabung dan dipekatkan dengan alat rotary evaporator pada suhu tidak lebih dari
40ºC. Diperoleh ekstrak kental sebanyak 83,6 g. Rendemen yang diperoleh
16,72%.
3.7
Uji Efek Imunomodulator
Uji efek imunomodulator meliputi penyiapan kontrol, bahan uji, penyiapan
hewan percobaan, dan uji bersihan karbon. Penyiapan kontrol dan bahan uji
meliputi pembuatan suspensi CMC-Na 1%, suspensi Imboost®, suspensi karbon,
dan suspensi EEDMD 50 mg/kg bb, 100 mg/kg bb, dan 200 mg/kg bb.
3.7.1 Pembuatan suspensi CMC-Na 1%
Sebanyak 1 g CMC ditaburkan ke dalam lumpang yang berisi air suling
panas sebanyak 20 ml didiamkan selama 15 menit hingga diperoleh massa yang
transparan, digerus hingga berbentuk gel dan diencerkan dengan sedikit air,
kemudian dituang ke dalam labu tentukur 100 ml, ditambah air suling sampai
batas tanda (Anief, 2000).
3.7.2 Pembuatan Suspensi Imboost®
Satu tablet Imboost® mengandung 250 mg bahan aktif, sebanyak 2 tablet
Imboost® (500 mg) dimasukkan ke dalam lumpang, digerus. Kemudian
ditambahkan dengan suspensi CMC-Na 1% secukupnya dan dihomogenkan. Lalu
dituangkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dan dicukupkan dengan suspensi
CMC- Na 1% hingga garis tanda. Suspensi dihomogenkan kembali dengan cara
dikocok ringan. Diperoleh konsentrasi suspensi Imboost® 0,5%.
3.7.3 Pembuatan Suspensi Karbon
Suspensikan 1,6 ml tinta pelikan (B17) ke dalam 8,4 ml suspensi CMC-Na
1% b/v dalam larutan fisiologis NaCl (Faradilla, 2014).
Universitas Sumatera Utara
3.7.4 Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun mahkota dewa (EEDMD)
Sebanyak 50 mg EEDMD dimasukkan ke dalam lumping dan ditambahkan
suspensi CMC-Na 1% sedikit demi sedikit sambal digerus sampai homogen lalu
dimasukkan ke labu tentukur 10 ml. Volume dicukupkan dengan suspensi CMCNa 1% sampai garis tanda. Prosedur yang sama dilakukan untuk pembuatan
suspensi EEDMD 100, dan 200 mg/kg bb.
3.7.5 Pengujian efek imunomodulator
Efek imunomodulator ekstrak etanol daun mahkota dewa (EEDMD)
ditentukan
menggunakan
metode
bersihan
karbon
dengan
mengukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 640,5
nm.
Sejumlah 25 ekor mencit dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan. Tiap
kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Hewan dikelompokkan sebagai berikut:
Kelompok I
: diberi sediaan suspensi CMC-Na 1 %.
Kelompok II
: diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 50 mg/kg bb
Kelompok III
: diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 100 mg/kg bb
Kelompok IV : diberi sediaan suspensi EEDMD dengan dosis 200 mg/kg bb
Kelompok V
: diberi sediaan suspensi Imboost® dengan dosis 32,5 mg/kg bb
Tiap kelompok diberikan ekstrak uji secara oral satu kali sehari selama 7
hari berturut-turut. Pada hari ke-8 dilakukan pengambilan darah dan penyuntikan
suspensi karbon. Dipotong tiap ujung ekor mencit dan darah diambil melalui
ujung ekor mencit. Darah ditampung ke dalam tube yang telah terisi Na-sitrat,
kemudian darah diambil 25µl dan ditambahkan dengan 4 ml asam asetat 1% ke
dalam kuvet, darah pertama ini dipakai sebagai blanko (menit 0). Kemudian 0,1
ml/10 g BB suspensi karbon disuntikkan secara intravena melalui pembuluh darah
Universitas Sumatera Utara
di ekor, dan pada menit ke-5, 10, 15, dan 20 setelah penyuntikkan karbon,
dilakukan pengambilan darah, ditampung ke dalam tube yang telah terisi Na-sitrat
kemudian diambil sebanyak 25µ l, ditambahkan dengan 4 ml asam asetat 1%,
kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UVVisible pada panjang gelombang 640,5 nm. Setelah dua belas jam diambil
darahnya, mencit dikorbankan, kemudian organ hati dan limfa mencit diisolasi
dan ditimbang (Wagner, 1991)
Dihitung konstanta kecepatan eliminasi karbon (K), indeks fagositosis (α)
dan indeks stimulasi dengan menggunakan rumus:
Konstanta kecepatan eliminasi karbon (K)
Indeks Fagositosis
Indeks Stimulasi
= Log OD5 – Log OD20
t 2 – t1
= K 1/3 x berat hewan
Berat hati + berat limfa
=
Indeks fagositosis kelompok uji
Indeks fagositosis kelompok kontrol
Dimana :
OD10 adalah absorbansi pada menit ke-5
OD20 adalah absorbansi pad menit ke-20
t1 adalah waktu pertama pengambilan darah
t2 adalah waktu terakhir pengambilan darah
Indeks fagositosis dan indeks stimulasi dari tiap kelompok uji dibandingkan
dengan kelompok kontrol (Shukla, dkk., 2009).
3.8
Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 22
untuk menentukan homogenitas dan normalitasnya dengan uji ANAVA satu arah
(One-Way ANOVA) dan untuk mengetahui perbedaan rata-rata diantara
perlakuan. Jika terdapat perbedaan, dilanjutkan dengan menggunakan uji Tukey
HSD untuk mengetahui variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan
nilai signifikansi (p0,05). Pada menit ke-10
menunjukkan laju eliminasi karbon CMC-Na 1% berbeda signifikan (p0,05) dengan Imboost® 32,5 mg/kg bb.
0.09
0.08
0.07
Absorbansi
0.06
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
5
10
15
20
Menit keCMC Na 1%
EEDMD 50 mg/kg bb
EEDMD 100 mg/kg bb
EEDMD 200 mg/kg bb
Imboost 32,5 mg/kg bb
Gambar 4.1 Grafik rata-rata laju eliminasi karbon
Pada menit ke-15 menunjukkan laju eliminasi karbon CMC-Na 1%
berbeda signifikan (p0,05) dengan EEDMD 200 mg/kg bb tetapi
Universitas Sumatera Utara
berbeda signifikan dengan EEDMD 50 mg/kg bb dan 100 mg/kg bb. EEDMD 200
mg/kg bb berbeda signifikan (p0,05) dengan
EEDMD 50 mg/kg bb.
Pada menit ke-20 menunjukkan laju eliminasi karbon CMC-Na 1%
berbeda signifikan (p