47
4.7.2 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media MHA sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlpetri, lalu dipanaskan
diatas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM,
suhu 151°C. Setelah disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu
dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
4.7.3 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah spesimen F.nucleatum ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang
telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur
disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml.
4.7.4 Penentuan KHM bahan coba
Bahan coba ekstrak buah mahkota dewa yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100,50, 25, 12,5, 6,25. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil
sebanyak 50 μl lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai
Universitas Sumatera Utara
48
konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-
masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung- tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tesebut
dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok
perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan F.nucleatum dalam media perbenihan
setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
4.7.5 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100,50, 25, 12,5, 6,25 dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut
masing-masing divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke
dalam media padat Mueller Hinton Agar direplikasi 6 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37°C selama 24 jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel
bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni,
Universitas Sumatera Utara
49
bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor
pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor
pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50
μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
Universitas Sumatera Utara
50
BAB 5 HASIL PENELITIAN
5.1 Ekstraksi Buah Mahkota Dewa
Ekstrak etanol buah mahkota dewa yang diperoleh berasal dari 1000 gram buah mahkota dewa yang kemudian dihaluskan menjadi bentuk simplisia. Simplisia
tersebut kemudian diperkolasi dengan menggunakan pelarut etanol 96 sebanyak 5 liter yang sudah di redestilisasi. Didapat maserat cair sebanyak 4 liter dari proses
tersebut. Kemudian maserat cair diuapkan dalam alat vacuum rotary evaporator, sehingga dihasilkan ekstrak kental buah mahkota dewa.
Gambar 11. Ekstrak etanol buah mahkota dewa konsentrasi 100
Universitas Sumatera Utara
Kategori