Penelitian yang dilakukan Sardjito et al 2009 melaporkan Identifikasi agensia penyebab
penyakit dengan rep-PCR terbukti efektif dan efisien
dalam mengelompokkan
agensia penyebab utama Vibriosis pada ikan kerapu
serta mampu
membedakan hubungan
kekerabatan spesies Vibriosis. Hal ini ditunjang pula masih terbatasnya informasi
yang berkaitan dengan bakteri pathogen secara molekulerpholyphasic. Untuk itu perlu kajian
komperehensif tentang
identifikasi, karakterisasi
dan filogenetik
molekuler penyebab utama penyakit Vibriosis dan
virulensinya pada udang vannamei sangat diperlukan.
Tujuan dari penelitian ini adalah : Mengkaji bakteri apakah yang menjadi
penyebab utama
Vibriosis pada
udang vannameiwindu, dan Mengkaji tingkat
pathogenesitas bakteri agensia penyebab
Vibriosis pada udang vannameiwindu.
II. METODOLOGI PENELITIAN
2.1. Metode Penelitian
Metode yang dilakukan dalam penelitian ini adalah metode deskriptif eksploratif
2.2.Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2010 – Juli 2011. Pengambilan
sampel adalah di pertambakan Wakak Kendal yang merupakan tempat budidaya udang
vannamei Litopenaeus vannamei dan udang windu P. Monodon yang diduga terkena
Vibriosis, isolasi dilakukan di Laboratorium Kelautan Terpadu Fakultas Perikanan dan
Ilmu Kelautan
Universitas Diponegoro,
Semarang. Analisis biologi molekuler meliputi ekstraksi
DNA, rep-PCR,
16S rDNA.
Ekstraksi DNA dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Tanah dan Lingkungan, Fakultas
Pertanian, Universitas
Gajah Mada,
Yogyakarta. Rep-PCR dan PCR 16S rDNA dilakukan di Laboratorium Bioteknologi PAU
Magister, Universitas
Gajah Mada,
Yogyakarta. Sekuensing
dilakukan di
”MAKROGEN” Korea. Kemudian Uji Pathogenesitas dilakukan di Laboratorium
Kesehatan Ikan dan Penyakit di Balai Besar Pengembangan
Budidaya Air
Payau BBPBAP Jepara.
2.3. Tahapan Penelitian
Pada penelitian ini dilakukan beberapa 3 tahapan yaitu:
1. Pengambilan Sampel Udang
Sampel udang vannamei dan Udang windu di ambil dari pertambakan daerah Wakak,
Kendal. 2.
Sterilisasi alat Semua peralatan yang akan digunakan
dalam penelitian
disterilisasikan terlebih
dahulu. Peralatan mikrobiologi disterilisasi dengan oven pada suhu 171ºC selama 1,5 jam.
Alat-alat yang terbuat dari kaca sebelum
digunakan dicuci dan dikeringkan. Alat-alat tersebut kemudian dibungkus dengan kertas
dan disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121ºC selama 20 menit dan tekanan
1atm. Kemudian dikeringkan dengan oven. Sedangkan media disterilisasi pada suhu 121ºC
selama 15 menit dan tekanan 1atm.
3. Pembuatan Media TCBSA dan NA
4. Isolasi Bakteri
5. Pemurnian Bakteri
Identifikasi Isolat dengan Pendekatan Bio Molekuler
1. Ekstraksi DNA 2. Elektroforesis DNA
3. Amplifikasi DNA
4. Sekuensing DNA
5. Analisis Sequen 16S rDNA
Hasil sequen 16S rDNA selanjutnya dianalisa dan di edit dengan program
GENETIX Urakawa et al, 1999. Selanjutnya sekuen lengkap dari tiap isolat yang dipilih
akan dibandingkan dengan sekuen DNA pada DNA database bank. Marahiel et al, 1997;
Radjasa et al, 2005. Penelusuran akan dilakukan dengan sistem
internet, yaitu penelusuran melalui system BLAST
pada National
Centre For
Biotecnology Information,
National of
institute of Health, USA dan Ribosomal DNA Project pada University of Illionis USA,
dalam rangka
memperoleh presentasi
homologi dan untuk mengidentifikasi isolat.
Uji Pathogenesitas
1. Hewan uji Benih udang vannameiwindu yang
diperoleh dari hatchery skala rumah tangga dengan padat penebaran mengacu
pada Muliani dan Suryanti, 1998, sebanyak 10 ekortoples1 Liter air.
2. Uji pathogenesitas Uji pathogenesitas dilakukan pada
Isolat terpilih JTV 19, JTW 3, JTW 6 dan
satu kontrol dengan 3 kali ulangan, sehingga total digunakan toples sebanyak
15 buah. Dengan kepadatan bakteri 10
7
Standart Mc Farland. Dilakukan dengan metode
perendaman. Pengamatan
terhadap gejala klinis dan kelangsungan hidup selama seminggu.
Analisa Data
Data yang diperoleh adalah data kualitatif dan kuantitatif, data kuantitatif
adalah data dari hasil uji pathogenesitas Gejala
klinis, kelangsungan
hidup. Sedangkan data kualitatif dan hasil
sequensing. Data tersebut di analisa secara deskriptif
.
III. HASIL PEMBAHASAN
3.1. Hasil
