Pemurnian dan karakterisasi protein inhibitor RNA helikase virus hepatitis C

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PROTEIN INHIBITOR

RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

DARI Streptomyces chartreusis 5-095

AINUN HAIRANY

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2010

PERNYATAAN MENGENAI TESIS

DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095 adalah benar hasil karya saya sendiri dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Januari 2010

Ainun Hairany P052060061

ABSTRACT

AINUN HAIRANY. P052060061. Purification and characterization of hepatitis c virus RNA helicase inhibitor from Streptomyces chartreusis 5-095. Under the direction of ANJA MERYANDINI and ANDI UTAMA.

Hepatitis C virus (HCV) infection is the second most common chronic viral infection in the world with global prevalence. This infection is contribution to chronic hepatitis and liver cirrhosis, often leading to hepatocellular carcinoma. There is no effective drug and vaccine available against HCV. The current standard treatment, a combination of pegylated interferon-α with ribavirin, is limited by its suboptimal response rate in a significant patient population, side effects, and affordability. Therefore, development of effective drug is needed. One approach to find out the candidate of antiviral drug is to discover the inhibitor of enzyme that essential for virus replication, such as RNA helicase. Streptomyces chartreusis 5-095 produce the inhibitor of HCV RNA helicase. The aim of this study was to purify the protein inhibitor which has inhibition activity against ATPase activity of RNA helicase HCV from S. chartreusis 5-095. The supernatant of culture S. chartreusis 5-095 exhibited high inhibiton activity against ATPase activity of RNA helicase HCV (approximately 72%) at 10 days of incubation. The extracellular protein inhibitor was partially purified by procedures of precipitation with ammonium sulfate to 65% saturation and gel filtration (Sephadex G50) using methanol water solution (4:6) as an eluen. The purity of protein inhibitor was monitored by SDS PAGE. The protein inhibitor showed a relative molecular mass were estimated to be 14 kDa and increased the purity 23,08 fold than those of the crude protein. The specific activity and IC50 after

purification were 13,1338 U/mg and 0,0767 mg/mL, respectively. The activity of purified protein inhibitor showed its stability over pH range from 5-8 and optimum at pH 7,4. The inhibition activity showed its stability up to 70% at temperature 100 oC. The purified protein inhibitor relatively stable its activity at storage in the range of -20 oC to room temperature for 35 days.

Key words: Hepatitis c virus (HCV), RNA helicase, inhibitor, Streptomyces chartreusis 5-095.

RINGKASAN

AINUN HAIRANY. P052060061. Pemurnian dan karakterisasi protein inhibitor RNA helikase virus hepatitis c dari Streptomyces chartreusis 5-095. Dibawah bimbingan ANJA MERYANDINI dan ANDI UTAMA.

Virus hepatitis C merupakan virus berenvelop yang termasuk ke dalam genus hepacivirus, famili flaviviridae. Infeksi HCV menyebabkan penyakit hepatitis C kronis dan sirosis hati yang dapat berkembang menjadi kanker hati (hepatocellular carcinoma, HCC). Berdasarkan data WHO, hepatitis C telah diderita oleh sekitar 3% populasi dunia (180 juta jiwa) dan 2-4% penduduk Indonesia (7-8 juta jiwa).

Saat ini belum tersedia vaksin dan obat yang efektif untuk menanggulangi HCV. Pengembangan vaksin masih sulit dilakukan karena tingginya heterogenisitas dari genom RNA HCV dan partikel yang berasosiasi dengan lipoprotein inang dan imunoglobulin. Terapi yang tersedia adalah kombinasi interferon-α terpegilasi dengan ribavirin. Respon terhadap terapi ini masih belum optimal karena sangat bergantung pada genotipe HCV. Selain itu, terapi ini memberikan efek samping dan mahal.

Salah satu upaya untuk menanggulangi HCV adalah dengan pengembangan obat antivirus. Obat antivirus, antara lain, dapat diperoleh dengan menapis senyawa inhibitor yang dapat menghambat enzim yang berperan dalam replikasi HCV pada sel inang. Protease, RNA polimerase, dan RNA helikase merupakan target obat yang potensial, karena ketiga enzim ini mutlak diperlukan untuk replikasi virus. Salah satu penelitian yang sedang dikembangkan adalah penemuan inhibitor untuk RNA helikase.

RNA helikase merupakan enzim yang memisahkan untai ganda RNA menjadi untai tunggal dengan menggunakan energi yang dihasilkan dari hidrolisis ATP menjadi ADP. Oleh karena itu, RNA helikase selain memiliki aktivitas helikase (ATP-dependent helicase), juga memiliki aktivitas ikatan RNA (RNA binding) dan ATPase (RNA-stimulated ATPase).

Hasil penapisan yang dilakukan oleh Puslit Bioteknologi-LIPI, diperoleh 16 dari 2000 isolat aktinomisetes yang memiliki kemampuan menghambat aktivitas RNA helikase dari HCV di dalam supernatannya. Isolat Streptomyces chartreusis 5-095 merupakan salah satu isolat yang memiliki aktivitas inhibisi tinggi.

Penelitian ini bertujuan untuk (1) mendapatkan senyawa murni dari S. chartreusis 5-095 yang bersifat inhibitor terhadap RNA helikase HCV, dan (2) mengkarakterisasi senyawa tersebut, meliputi stabilitas suhu, pH optimum, dan waktu penyimpanan, serta konsentrasi 50% penghambatan (IC50).

Pada penelitian ini, protein inhibitor dimurnikan dari supernatan S. chartreusis 5-095 dengan metoda pengendapan amonium sulfat pada kejenuhan 65% dan kromatografi gel filtrasi sephadex G50 dengan eluen larutan metanol air (4:6). Untuk mendapatkan fraksi aktif pada setiap tahap pemurnian, protein inhibitor diuji aktivitas inhibisinya terhadap aktivitas ATPase RNA helikase HCV. Kemurnian protein inhibitor dianalisis dengan SDS PAGE gel gradien.

Supernatan S. chartreusis 5-095 menunjukkan aktivitas inhibisi yang tinggi terhadap aktivitas ATPase RNA helikase (sekitar 72%) selama 10 hari masa

inkubasi. Analisis SDS PAGE gel gradien menunjukkan bobot molekul relatif dari protein inhibitor tersebut adalah sekitar 14 kDa dengan kemurnian meningkat hingga 23,08 kali dibandingkan supernatan awalnya. Protein inhibitor yang murni memiliki aktivitas spesifik dan IC50 sebesar 13,1338 U/mg dan 0,0767 mg/mL.

Aktivitas protein inhibitor relatif stabil pada kisaran pH 5-8 dan optimum pada pH 7,4 serta stabil pada penyimpanan di suhu -20 oC sampai suhu ruang. Protein inhibitor ini bersifat termostabil dengan aktivitas inhibisinya tetap stabil hingga 70% pada suhu 100 oC.

Kata kunci: Virus hepatitis c (HCV), RNA helikase, inhibitor, Streptomyces chartreusis 5-095

©Hak cipta milik IPB, tahun 2010 Hak cipta dilindungi UU

1.Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2.Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PROTEIN INHIBITOR

RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

DARI Streptomyces chartreusis 5-095

AINUN HAIRANY

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Departemen Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2010

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Tesis : Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095

Nama Mahasiswa : Ainun Hairany NIM : P052060061

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Anja Meryandini, M.S Ketua

Dr. Andi Utama, M.Sc Anggota

Diketahui An. Ketua Program Studi Bioteknologi

Dr. Ir. Suharsono, DEA

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bima, Nusa Tenggara Barat pada tanggal 06 Maret 1983. Penulis merupakan anak keenam dari enam bersaudara dari ayah yang bernama Ir. H. Rifai A. Wahab dan Ibu Hj. Siti Hadijah.

Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMU Negeri 1 Bima pada tahun 2000 dan pada tahun yang sama diterima masuk di Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Padjadjaran Bandung. Penulis menyelesaikan studi strata 1 pada tahun 2005 dan pada tahun yang sama mendapat kesempatan untuk bekerja sebagai staf pengajar tidak tetap di Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan (STIKES) Mataram, NTB. Pada tahun 2006 penulis melanjutkan pendidikan Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, pada Program Studi Bioteknologi.

Pada bulan Maret 2008 penulis menikah dengan Muhammad Anhar, M.Ap dan dikaruniai seorang putri bernama Amirah Nisrina.

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia, limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis yang berjudul Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya tesis ini, penulis mendapat banyak bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala ketulusan hati, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Dr. Anja Meryandini, M.S. selaku ketua komisi pembimbing yang dengan penuh kesabaran dan ketelitian memberikan ilmu, arahan, masukan selama penulis melaksanakan penelitian, hingga terselesaikannya tesisi ini.

2. Dr. Andi Utama, M.Sc. selaku anggota komisi pembimbing yang telah berkenan memberikan bantuan fasilitas penelitian, ilmu, bimbingan, pengarahan selama penelitian sehingga penulisan tesis ini dapat terselesaikan.

3. Dr. Puspita Lisdiyanti, Kepala Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Puslit Bioteknologi, LIPI, dan Dr. Yanti Widyastuti, project Leader LIPI-NITE Project 1, yang telah memberikan ijin kepada penulis untuk menggunakan fasilitas dan biakan Streptomyces chartreusis 5-095 yang merupakan koleksi Puslit Bioteknologi, LIPI.

4. Santi Ratnakomala, M.Si atas sumbangan waktu, pemikiran, literatur dan semangatnya.

5. Segenap Staf pengajar di Program Studi Bioteknologi, SPs-IPB atas segala ilmu yang diberikan, beserta seluruh staf administrasi dan staf laboratorium atas segala bantuannya selama penulis menjalankan tugas belajar di IPB.

6. Yang tercinta suamiku M. Anhar, M.AP. dan anakku Amirah Nisrina, orang tua, dan saudara-saudaraku yang dengan kasih sayang dan tulus

inkubasi. Analisis SDS PAGE gel gradien menunjukkan bobot molekul relatif dari protein inhibitor tersebut adalah sekitar 14 kDa dengan kemurnian meningkat hingga 23,08 kali dibandingkan supernatan awalnya. Protein inhibitor yang murni memiliki aktivitas spesifik dan IC50 sebesar 13,1338 U/mg dan 0,0767 mg/mL. Aktivitas protein inhibitor relatif stabil pada kisaran pH 5-8 dan optimum pada pH 7,4 serta stabil pada penyimpanan di suhu -20 oC sampai suhu ruang. Protein inhibitor ini bersifat termostabil dengan aktivitas inhibisinya tetap stabil hingga 70% pada suhu 100 oC.

Kata kunci: Virus hepatitis c (HCV), RNA helikase, inhibitor, Streptomyces chartreusis 5-095

©Hak cipta milik IPB, tahun 2010 Hak cipta dilindungi UU

1.Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2.Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PROTEIN INHIBITOR

RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

DARI

Streptomyces chartreusis

5-095

AINUN HAIRANY

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Departemen Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2010

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Tesis : Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095

Nama Mahasiswa : Ainun Hairany

NIM : P052060061

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Anja Meryandini, M.S Ketua

Dr. Andi Utama, M.Sc Anggota

Diketahui An. Ketua Program Studi Bioteknologi

Dr. Ir. Suharsono, DEA

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bima, Nusa Tenggara Barat pada tanggal 06 Maret 1983. Penulis merupakan anak keenam dari enam bersaudara dari ayah yang bernama Ir. H. Rifai A. Wahab dan Ibu Hj. Siti Hadijah.

Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMU Negeri 1 Bima pada tahun 2000 dan pada tahun yang sama diterima masuk di Jurusan Kimia, FMIPA, Universitas Padjadjaran Bandung. Penulis menyelesaikan studi strata 1 pada tahun 2005 dan pada tahun yang sama mendapat kesempatan untuk bekerja sebagai staf pengajar tidak tetap di Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan (STIKES) Mataram, NTB. Pada tahun 2006 penulis melanjutkan pendidikan Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, pada Program Studi Bioteknologi.

Pada bulan Maret 2008 penulis menikah dengan Muhammad Anhar, M.Ap dan dikaruniai seorang putri bernama Amirah Nisrina.

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia, limpahan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis yang berjudul Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095.

Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Selama menjalani perkuliahan hingga terselesaikannya tesis ini, penulis mendapat banyak bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan segala ketulusan hati, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:

1. Dr. Anja Meryandini, M.S. selaku ketua komisi pembimbing yang dengan penuh kesabaran dan ketelitian memberikan ilmu, arahan, masukan selama penulis melaksanakan penelitian, hingga terselesaikannya tesisi ini.

2. Dr. Andi Utama, M.Sc. selaku anggota komisi pembimbing yang telah berkenan memberikan bantuan fasilitas penelitian, ilmu, bimbingan, pengarahan selama penelitian sehingga penulisan tesis ini dapat terselesaikan.

3. Dr. Puspita Lisdiyanti, Kepala Bidang Biologi Sel dan Jaringan, Puslit Bioteknologi, LIPI, dan Dr. Yanti Widyastuti, project Leader LIPI-NITE Project 1, yang telah memberikan ijin kepada penulis untuk menggunakan fasilitas dan biakan Streptomyces chartreusis 5-095 yang merupakan koleksi Puslit Bioteknologi, LIPI.

4. Santi Ratnakomala, M.Si atas sumbangan waktu, pemikiran, literatur dan semangatnya.

5. Segenap Staf pengajar di Program Studi Bioteknologi, SPs-IPB atas segala ilmu yang diberikan, beserta seluruh staf administrasi dan staf laboratorium atas segala bantuannya selama penulis menjalankan tugas belajar di IPB.

6. Yang tercinta suamiku M. Anhar, M.AP. dan anakku Amirah Nisrina, orang tua, dan saudara-saudaraku yang dengan kasih sayang dan tulus