Analisis Komunitas Aktinobakteri Endofit Pegagan (Centella Asiatica L. Urban) Berdasarkan Gen 16s Rrna Dan Potensinya Sebagai Antidiabetes
ANALISIS KOMUNITAS AKTINOBAKTERI ENDOFIT
PEGAGAN (Centella asiatica L. Urban) BERDASARKAN
GEN 16S rRNA DAN POTENSINYA SEBAGAI
ANTIDIABETES
MEI ERNAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
vi
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Analisis Komunitas
Aktinobakteri Endofit Pegagan (Centella asiatica L. Urban) Berdasarkan Gen 16S
rRNA dan Potensinya sebagai Antidiabetes adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2016
Mei Ernawati
NIM G351124051
RINGKASAN
MEI ERNAWATI. Analisis Komunitas Aktinobakteri Endofit Pegagan (Centella
asiatica L. Urban) Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Potensinya sebagai
Antidiabetes. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan DEDY DURYADI
SOLIHIN.
Aktinobakteri endofit tanaman obat memiliki potensi sebagai sumber
beragam senyawa bioaktif termasuk antidiabetes. Pengetahuan tentang keragaman
genetik aktinobakteri endofit Centella asiatica penting sebagai dasar untuk
mengeksplorasi aktinobakteri endofit potensial dari tanaman tersebut. Analisis
keragaman melalui pendekatan metagenomik (culture-independent) dengan teknik
PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction - Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), merupakan langkah yang efisien dalam mempelajari komunitas
aktinobakteri endofit. Penelitian ini bertujuan mengkaji keragaman aktinobakteri
tanah rizosfer dan endofit C. asiatica melalui pendekatan metagenomik dengan
PCR-DGGE berdasarkan gen 16S rRNA dan gen inhibitor α-glukosidase.
DNA genom total tanah rizosfer dan jaringan tanaman diekstraksi
menggunakan Soil DNA Isolation Kit dan Genomic DNA Mini Kit (Plant). Gen
16S rRNA aktinobakteri diamplifikasi menggunakan teknik nested-PCR (27F,
16Sact1114R dan P338F-GC, P518R). Keragaman aktinobakteri berdasarkan gen
16S rRNA dianalisis dengan DGGE pada gel poliakrilamida. Produk PCR hasil
pemotongan pita DNA pada gel poliakrilamida disekuensing dan dianalisis
menggunakan software bioinformatika untuk konstruksi pohon filogenetik. Gen
penyandi inhibitor α-glukosidase di amplifikasi menggunakan primer vldA-F dan
vldA-R. Isolat Streptomyces sp. BWA 65 digunakan sebagai kontrol positif.
Hasil separasi produk gen 16S rRNA pada gel DGGE diperoleh 16 pita
dominan dari tanah rizosfer dan jaringan tanaman C. asiatica. Pola distribusi pita
menunjukkan bahwa komunitas aktinobakteri pada jaringan tanaman lebih
beragam dibandingkan dengan tanah rizosfer meskipun tidak berbeda secara
signifikan berdasarkan analisis Shannon-Wiener (2.176-2.57). Analisis BLAST.N
menunjukkan 7 pita berkerabat dengan famili Streptomycetaceae (83-100%), 5
pita adalah famili Micromonosporaceae (99-100%), 1 pita adalah famili
Gordoniaceae (99%), dan 3 pita lainnya masih dinyatakan sebagai unculturable
(87-99%). Dari famili tersebut diperoleh 6 genus, yaitu genus Streptomyces,
Micromonospora, Verrucosispora, Actinoplanes, Couchioplanes, dan Gordonia.
Persentase kemiripan terhadap strain pembanding dalam database menunjukkan
bahwa sebanyak 6, 5, 1, dan 4 spesies masing-masing sebesar 100, 99, 98, dan <
97%. Kemiripan < 97%, menarik untuk diungkap sebagai spesies aktinobakteri
endofit baru dari C. asiatica. Amplifikasi PCR gen inhibitor α-glukosidase
menunjukkan hasil positif pada sampel tanah rizosfer, akar dan daun C. asiatica.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa beragam aktinobakteri endofit dapat
ditemukan berasosiasi dengan C. asiatica dan dapat dipelajari lebih lanjut terkait
fungsinya dalam bidang kesehatan.
Kata kunci: 16S rRNA, aktinobakteri endofit, Centella asiatica, inhibitor αglukosidase, metagenomik, PCR-DGGE.
SUMMARY
MEI ERNAWATI. Community Analysis of Endophytic Actibacteria from
Pegagan (Centella asiatica L. Urban) Based on 16s rRNA gene and Its Potential
as an Antidiabetic. Supervised by YULIN LESTARI and DEDY DURYADI
SOLIHIN.
Endophytic actinobacteria of medicinal plants have potential as a source of
various bioactive compounds, including antidiabetic. The knowledge about the
genetic diversity of endophytic actinobacteria in Centella asiatica is important as
the basic information to explore potential endophytic actinobacteria from this
plant. Diversity analysis by a metagenomic approach (culture-independent) with
PCR-DGGE technique (Polymerase Chain Reaction - Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), is an efficient method in the study of endophytic actinobacteria
communities. This study aimed to assess the diversity of actinobacteria in
rhizosphere and endophyte of C. asiatica based on metagenomic approach using
PCR-DGGE of 16S rRNA and α-glucosidase inhibitor targeted-genes.
Total genomic DNA from the rhizosphere and plant tissue were extracted
using the Soil DNA Isolation Kit and Genomic DNA Mini Kit (Plant), followed
by PCR amplification of actinobacteria 16S rRNA gene using nested PCR
technique (27F, 16Sact1114R and P338F-GC, P518R). The diversity of
actinobacteria based on 16S rRNA gene was analyzed using the DGGE techniques
on polyacrylamide gels. PCR products of excised bands result from
polyacrylamide gel were sequenced and analyzed by bioinformatics software to
construct phylogenetic tree. Gene encoding α-glucosidase inhibitor was amplified
using vldA-F and vldA-R primers. Streptomyces sp. BWA 65 isolate was used as a
positive control.
The results of separation in DGGE gel showed 16 major bands from
rhizosphere and plant tissue. The bands distribution pattern showed that the
community of actinobacteria in the plant tissue was slightly more diverse than
rhizosphere , although it is not significantly different based on Shannon-Wiener
analysis. The BLAST.N analysis showed that 7 bands related to the family
Streptomycetaceae (83-100%), 5 bands related to Micromonosporaceae (99100%), 1 bands related to family Gordoniaceae (99%), and 3 bands still belonged
to unculturable (87-99%). There were 6 genera under those 3 families, i.e.
Streptomyces, Micromonospora, Verrucosispora, Actinoplanes, Couchioplanes,
and Gordonia. The percentage of strain similarity comparison to the database
showed that there were 6, 5, 1, and 4 bands were 100, 99, 98, and
PEGAGAN (Centella asiatica L. Urban) BERDASARKAN
GEN 16S rRNA DAN POTENSINYA SEBAGAI
ANTIDIABETES
MEI ERNAWATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
vi
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Analisis Komunitas
Aktinobakteri Endofit Pegagan (Centella asiatica L. Urban) Berdasarkan Gen 16S
rRNA dan Potensinya sebagai Antidiabetes adalah benar karya saya dengan
arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2016
Mei Ernawati
NIM G351124051
RINGKASAN
MEI ERNAWATI. Analisis Komunitas Aktinobakteri Endofit Pegagan (Centella
asiatica L. Urban) Berdasarkan Gen 16S rRNA dan Potensinya sebagai
Antidiabetes. Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan DEDY DURYADI
SOLIHIN.
Aktinobakteri endofit tanaman obat memiliki potensi sebagai sumber
beragam senyawa bioaktif termasuk antidiabetes. Pengetahuan tentang keragaman
genetik aktinobakteri endofit Centella asiatica penting sebagai dasar untuk
mengeksplorasi aktinobakteri endofit potensial dari tanaman tersebut. Analisis
keragaman melalui pendekatan metagenomik (culture-independent) dengan teknik
PCR-DGGE (Polymerase Chain Reaction - Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), merupakan langkah yang efisien dalam mempelajari komunitas
aktinobakteri endofit. Penelitian ini bertujuan mengkaji keragaman aktinobakteri
tanah rizosfer dan endofit C. asiatica melalui pendekatan metagenomik dengan
PCR-DGGE berdasarkan gen 16S rRNA dan gen inhibitor α-glukosidase.
DNA genom total tanah rizosfer dan jaringan tanaman diekstraksi
menggunakan Soil DNA Isolation Kit dan Genomic DNA Mini Kit (Plant). Gen
16S rRNA aktinobakteri diamplifikasi menggunakan teknik nested-PCR (27F,
16Sact1114R dan P338F-GC, P518R). Keragaman aktinobakteri berdasarkan gen
16S rRNA dianalisis dengan DGGE pada gel poliakrilamida. Produk PCR hasil
pemotongan pita DNA pada gel poliakrilamida disekuensing dan dianalisis
menggunakan software bioinformatika untuk konstruksi pohon filogenetik. Gen
penyandi inhibitor α-glukosidase di amplifikasi menggunakan primer vldA-F dan
vldA-R. Isolat Streptomyces sp. BWA 65 digunakan sebagai kontrol positif.
Hasil separasi produk gen 16S rRNA pada gel DGGE diperoleh 16 pita
dominan dari tanah rizosfer dan jaringan tanaman C. asiatica. Pola distribusi pita
menunjukkan bahwa komunitas aktinobakteri pada jaringan tanaman lebih
beragam dibandingkan dengan tanah rizosfer meskipun tidak berbeda secara
signifikan berdasarkan analisis Shannon-Wiener (2.176-2.57). Analisis BLAST.N
menunjukkan 7 pita berkerabat dengan famili Streptomycetaceae (83-100%), 5
pita adalah famili Micromonosporaceae (99-100%), 1 pita adalah famili
Gordoniaceae (99%), dan 3 pita lainnya masih dinyatakan sebagai unculturable
(87-99%). Dari famili tersebut diperoleh 6 genus, yaitu genus Streptomyces,
Micromonospora, Verrucosispora, Actinoplanes, Couchioplanes, dan Gordonia.
Persentase kemiripan terhadap strain pembanding dalam database menunjukkan
bahwa sebanyak 6, 5, 1, dan 4 spesies masing-masing sebesar 100, 99, 98, dan <
97%. Kemiripan < 97%, menarik untuk diungkap sebagai spesies aktinobakteri
endofit baru dari C. asiatica. Amplifikasi PCR gen inhibitor α-glukosidase
menunjukkan hasil positif pada sampel tanah rizosfer, akar dan daun C. asiatica.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa beragam aktinobakteri endofit dapat
ditemukan berasosiasi dengan C. asiatica dan dapat dipelajari lebih lanjut terkait
fungsinya dalam bidang kesehatan.
Kata kunci: 16S rRNA, aktinobakteri endofit, Centella asiatica, inhibitor αglukosidase, metagenomik, PCR-DGGE.
SUMMARY
MEI ERNAWATI. Community Analysis of Endophytic Actibacteria from
Pegagan (Centella asiatica L. Urban) Based on 16s rRNA gene and Its Potential
as an Antidiabetic. Supervised by YULIN LESTARI and DEDY DURYADI
SOLIHIN.
Endophytic actinobacteria of medicinal plants have potential as a source of
various bioactive compounds, including antidiabetic. The knowledge about the
genetic diversity of endophytic actinobacteria in Centella asiatica is important as
the basic information to explore potential endophytic actinobacteria from this
plant. Diversity analysis by a metagenomic approach (culture-independent) with
PCR-DGGE technique (Polymerase Chain Reaction - Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis), is an efficient method in the study of endophytic actinobacteria
communities. This study aimed to assess the diversity of actinobacteria in
rhizosphere and endophyte of C. asiatica based on metagenomic approach using
PCR-DGGE of 16S rRNA and α-glucosidase inhibitor targeted-genes.
Total genomic DNA from the rhizosphere and plant tissue were extracted
using the Soil DNA Isolation Kit and Genomic DNA Mini Kit (Plant), followed
by PCR amplification of actinobacteria 16S rRNA gene using nested PCR
technique (27F, 16Sact1114R and P338F-GC, P518R). The diversity of
actinobacteria based on 16S rRNA gene was analyzed using the DGGE techniques
on polyacrylamide gels. PCR products of excised bands result from
polyacrylamide gel were sequenced and analyzed by bioinformatics software to
construct phylogenetic tree. Gene encoding α-glucosidase inhibitor was amplified
using vldA-F and vldA-R primers. Streptomyces sp. BWA 65 isolate was used as a
positive control.
The results of separation in DGGE gel showed 16 major bands from
rhizosphere and plant tissue. The bands distribution pattern showed that the
community of actinobacteria in the plant tissue was slightly more diverse than
rhizosphere , although it is not significantly different based on Shannon-Wiener
analysis. The BLAST.N analysis showed that 7 bands related to the family
Streptomycetaceae (83-100%), 5 bands related to Micromonosporaceae (99100%), 1 bands related to family Gordoniaceae (99%), and 3 bands still belonged
to unculturable (87-99%). There were 6 genera under those 3 families, i.e.
Streptomyces, Micromonospora, Verrucosispora, Actinoplanes, Couchioplanes,
and Gordonia. The percentage of strain similarity comparison to the database
showed that there were 6, 5, 1, and 4 bands were 100, 99, 98, and