110
8. PEMBAHASAN UMUM
Peningkatan intensitas warna dan kadar lovastatin angkak, diupayakan dengan melakukan ko-kultur M .purpureus dengan khamir amilolitik indigenus.
Aplikasi ko-kultur pada produksi angkak dilakukan melalui beberapa tahapan meliputi : seleksi terhadap 16 strain khamir indigenus untuk mendapatkan khamir
yang memiliki aktivitas amilolitik, ko-kultur enam strain M. purpureus dengan khamir terpilih, analisis intensitas pigmen, kadar lovastatin dan sitrinin angkak,
analisis ekspresi gen yang berperan dalam biosintesis lovastatin, serta analisis stabilitas pigmen dan lovastatin oleh pengaruh suhu dan pH.
Sebanyak 16 isolat khamir telah diseleksi untuk mendapatkan khamir yang mempunyai aktivitas amilolitik. Hasil seleksi menunjukkan hanya satu isolat khamir
yang memiliki aktivitas amilolitik yaitu Endomycopsis burtonii. Secara umum sebagian besar khamir tidak memiliki aktivitas amilolitik, aktifitas yang biasanya
dimiliki adalah menghidrolisis gula menjadi alkohol Kelompok khamir yang mempunyai kemampuan amilolitik jumlahnya relatif sedikit antara lain
Schwaniomyces occidentalis, Saccharomycopsis fibuliger, Sacch diastiticus, Candida dan Pichia. Jenis-jenis khamir lainnya tidak memproduksi amilase. Enzim
amilase sebagai aktivitas amilolitik pada khamir, diproduksi secara ekstraseluler. Roosifta 2004.
Aplikasi ko-kultur M .purpureus dengan E. burtonii ternyata berhasil meningkatkan intensitas pigmen dan lovastatin angkak. Produksi pigmen merah
angkak menunjukkan peningkatan oleh penambahan E. burtonii pada waktu dan konsentrasi tertentu oleh semua strain M .purpureus dibanding tanpa ko-kultur
kontrol. Secara umum penambahan E.burtonii yang terlalu awal hari ke 2 pada semua level konsentrasi, menyebabkan penurunan produksi pigmen merah oleh
semua strain M .purpureus. Peningkatan intensitas pigmen merah baru terjadi pada penambahan E.burtonii hari ke 4 pada semua level konsentrasi oleh semua strain M
.purpureus, sedangkan pada penambahan E.burtonii hari ke 6 respon strain M
Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com
111
.purpureus bervariasi. Strain-strain TOS dan JmbA masih menunjukkan peningkatan intensitas pigmen merah, di sisi lain strain AID, JmbA3M, JmbA5K dan As3K relatif
tetap. Produksi pigmen merah tertinggi ditunjukkan oleh strain TOS dengan penambahan E.burtonii pada hari ke 6 dengan konsentrasi 10
4
cfuml. Penurunan produksi pigmen merah oleh penambahan E.burtonii yang
terlalu awal hari ke 2 diduga disebabkan oleh hal-hal sebagai berikut. Pada tahap awal mikroba membutuhkan fase adaptasi terhadap lingkungan pertumbuhannya.
Penambahan khamir pada tahap awal fermentasi, dapat mengganggu pertumbuhan M. purpureus. Kehadiran khamir pada awal pertumbuhan dapat menjadi kompetitor bagi
kapang. Lim et al. 2000 melaporkan bahwa masalah utama pada teknik ko-kultur, produksi pigmen dapat menurun disebabkan kehadiran S. cerevisiae dapat menekan
pertumbuhan M. purpureus bila penambahan S. cerevisiae terlalu awal dan dalam jumlah yang terlalu tinggi.
. Penelitian terdahulu oleh Shin et al 1998 melakukan ko-kultur antara M. purpureus dengan Saccharomyces cerevisiae rekombinan yang diinsert gen penghasil
enzim glukoamilase dari Aspergillus niger, dilaporkan terjadi peningkatan pigmen 30-40 kali dibanding monokultur pada kultur cair. Sebaliknya ko-kultur antara
Monascus dengan Bacillus cereus tidak terjadi peningkatan produksi pigmen. Beberapa enzim hidrolitik diproduksi oleh S. cerevisiae
rekombinan seperti glukoamilase berfungsi sebagai efektor. Enzim hidrolitik menyebabkan peningkatan
produksi pigmen berkaitan dengan kemampuannya mendegradasi dinding sel Monascus. Dengan adanya gangguan tersebut, menyebabkan Monascus melakukan
upaya pertahanan diri defense mechanism dengan memproduksi komponen- komponen hidrofobik seperti lovastatin dan pigmen.
Kandungan pigmen angkak terdiri dari pigmen merah, kuning dan jingga, namun produksi pigmen dalam angkak didominasi oleh pigmen merah dimana setelah
14 hari fermentasi, intensitas pigmen merah dapat mencapai 14,5 pada absorbansi 500 nm, disisi lain intensitas pigmen jingga dan kuning masing-masing hanya 8,5
pada absobansi 470 nm dan 8,9 pada absorbansi 410 nm
Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com
112
Kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur menunjukkan, bahwa keenam strain M. purpureus memberikan respon yang bervariasi spesifik strain terhadap
penambahan E. burtonii dengan jumlah dan waktu yang divariasikan. Beberapa strain seperti JmbA5K dan AID menunjukkan peningkatan produksi lovastatin mulai hari
ke 2 sampai hari ke 6 penambahan E. burtonii pada semua level konsentrasi. Disisi lain strain TOS pada penambahan E. burtonii pada hari ke 2 dengan konsentrasi 10
3
cfuml, justru menyebabkan penurunan kadar lovastatin, pada penambahan dengan konsentrasi 10
3
–10
4
cfuml, produksi lovastatin relatif tetap, kemudian menunjukkan peningkatan pada penambahan E. burtonii pada hari ke 4 dengan konsentrasi 10
3
– 10
5
cfuml serta hari ke 6 pada konsentrasi 10
4
cfuml. Berbeda lagi dengan strain mutan JmbA3M dan As3K, penambahan E. burtonii pada semua waktu dan semua
level konsentrasi, menyebabkan penurunan produksi lovastatin. Strain JmbA memberikan respon yang berbeda pula, pada hari ke 2 penambahan E. burtonii
dengan konsentrasi 10
3
cfuml menyebabkan penurunan kadar lovastatin, pada konsentrasi 10
4
cfuml produksi lovastatin menunjukkan peningkatan, kemudian menurun pada penambahan dengan konsentrasi 10
5
cfuml. Peningkatan produksi lovastatin terjadi pada penambahan E. burtonii pada hari ke 4 dengan konsentrasi
10
3
–10
4
cfuml, pada konsentrasi 10
5
cfuml, dan penambahan pada hari ke 6 pada semua level konsentrasi menyebabkan penurunan produksi lovastatin.
Untuk mengetahui hubungan sifat fenotipik produksi lovastatin dengan sifat genotipiknya, dilakukan analisis ekspresi gen lov B dari M. purpureus. Gen lovB
diketahui bertanggung jawab terhadap enzim lovastatin nonketida sintase LNKS yang menentukan tahap akhir perubahan ketida menjadi lovastatin Stocking dan
Williams, 2003. Dipilih tiga strain hasil ko-kultur yang menghasilkan lovastatin tinggi yaitu JMBA H410
3
, AID H210
4
, TOS H610
4
disertai masing-masing strain kontrol tanpa ko-kultur yaitu: JMBA k, AID k, TOS k. Isolasi dilakukan
terhadap total RNA yang mengandung fragmen-fragmen tRNA RNA transfer, rRNA RNA ribosom, dan mRNA messenger RNA, mengingat isolasi terhadap
fragmen mRNA sebagai fragmen pembawa pesan sangat sulit dan sensitif. Total
Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com
113
RNA dari semua strain yang diisolasi, menghasilkan kemurnian yang baik ditunjukkan dengan rasio absorbansi A
260nm
A
280nm
semua strain di atas 1,8. Hasil pengukuran konsentrasi total RNA terhadap isolat JMBA H4103, AID
H210
3
, TOS H610
4
dan kontrol tanpa ko-kultur yaitu JMBA k, AID k, TOS k, menunjukkan bahwa semua isolat mempunyai konsentrasi yang lebih tinggi dari
kontrol. Konsentrasi total RNA tertinggi ditunjukkan oleh strain TOS H610
4
strain TOS hasil ko-kultur dengan penambahan E. burtonii pada penambahan hari ke 6
dengan konsentrasi 10
4
yakni 1860 µg, konsentrasi tersebut tiga kali lipat lebih tinggi dibandingkan kontrol. Konsentrasi yang ditunjukkan oleh TOS H610
4
ini sesuai dengan kadar lovastatin yang diproduksi oleh strain TOS H610
4
2,19 sebagai pengaruh dari ko-kultur dengan E. burtonii yang mengalami peningkatan
dibanding kontrol 0,8. Demikian juga untuk strain AID H210
4
dan
JMBA H410
3
memiliki konsentrasi total RNA sekitar dua kali lebih tinggi dibanding kontrol. Konsentrasi total RNA dengan produksi lovastatin yang tinggi pada strain TOS
H610
4
kemungkinan berkaitan dengan hal-hal berikut. Total RNA didalamnya terkandung fragmen mRNA atau messenger RNA yang berfungsi sebagai pembawa
pesan atau informasi dalam sebuah gen untuk disampaikan kepada mesin pembuat protein atau enzim. Tiap-tiap mRNA dipergunakan sebagai cetakan untuk
membentuk molekul yang sesuai. Dengan semakin banyak jumlah mRNA ditunjukkan dengan konsentrasi total RNA yang tinggi, maka akan semakin banyak
pula molekul yang sesuai dalam hal ini lovastatin yang akan diproduksi Murray et al, 2003.
Biosintesis lovastatin telah diketahui dimulai dari asetil KoA dan malonil koA menjadi beberapa ketida 2 sampai 9 dimana didalamnya terlibat beberapa gen-gen
penting diantaranya lovB dan lovC Stocking dan Williams, 2003. Gen lovB diketahui bertanggungjawab terhadap enzim lovastatin nonketide sintase LNKS
yang menentukan tahap akhir perubahan ketida menjadi lovastatin, sedangkan lovC berperan dalam tahap awal perubahan asetil koA dan malonil koA menjadi triketida
dan tetraketida. Semua strain menunjukkan ekspresi gen lov B yakni gen penghasil lovastatin. Ekspresi gen lov B yang ditunjukkan berukuran 200 pb pasang basa.
Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com
114
Sifat fenotipik M. purpureus TOS H610
4
yang mampu memproduksi lovastatin tinggi ko-kultur dengan E. burtonii, sejalan dengan sifat genotipiknya, yang
ditunjukkan dengan tingginya intensitas ekspresi gen penghasil lovastatin. Aplikasi angkak sebagai pigmen alami dan ingredien pangan fungsional
secara luas pada bidang pangan, dibutuhkan informasi karakteristik kestabilannya terutama terhadap pengaruh temperatur dan pH. Dipilih satu strain M. purpureus hasil
ko-kultur yang menghasilkan pigmen merah dan lovastatin tertinggi yaitu TOS H610
4
disertai kontrol TOS untuk dianalisis stabilitasnya terhadap berbagai variasi suhu 70, 100, 121˚C dengan berbagai waktu kontak 15, 30, dan 45 menit dan pH
3,0, 5,0, 7,0 dengan berbagai waktu kontak 2, 4, 6, dan 8 jam. Pigmen merah angkak yang diproduksi oleh M. purpureus TOS baik secara monokultur maupun
secara ko-kultur dengan E. burtonii bersifat stabil pada suhu tinggi 70-121˚C dengan waktu kontak cukup lama 15-45 menit. Kestabilan pigmen merah angkak
hasil ko-kultur M. purpureus TOS dengan E. burtonii oleh pengaruh suhu, sangat potensial untuk tujuan aplikasi secara luas pada produk olahan pangan, mengingat
proses pengolahan pangan secara umum melibatkan penggunaan suhu yang relatif tinggi, misalnya pada makanan kaleng yang disterilisasi pada suhu 121˚C dengan
lama waktu 15-45 menit. Aplikasi pigmen merah angkak juga dapat digunakan sebagai pengganti nitrit pada produk olahan daging. Fabre et al. 1993 melaporkan
bahwa pigmen angkak lebih stabil dibanding pewarna yang biasa digunakan untuk mewarnai produk-produk daging seperti garam-garam nitrit. Shin 2005 juga
melaporkan bahwa pigmen angkak secara umum mempunyai kemampuan mewarnai yang kuat dan produk pangan yang diberi warna angkak memiliki penampilan yang
baik terhadap panas. Pigmen angkak juga stabil terhadap sinar radiasi maupun ultraviolet. Faktor-faktor seperti oksidasi, logam, alkalinitas dan keasaman
berpengaruh kecil terhadap intensitas warna pigmen angkak.
Pengaruh pH terhadap stabilitas pigmen merah angkak monokultur dan ko- kultur menunjukkan bahwa, pH 7,0 dengan waktu kontak 2-8 jam tidak
mempengaruhi stabilitas pigmen merah angkak monokultur maupun hasil ko-kultur p0,05. Sebaliknya pada pH asam pH 3,0 dan 5,0 dengan waktu kontak 2-8 jam,
Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com
115
menyebabkan penurunan secara nyata intensitas pigmen merah angkak monokultur maupun hasil ko-kultur. Kestabilan intensitas pigmen merah angkak pada pH netral,
sangat potensial untuk tujuan aplikasi pada produk olahan makanan dan minuman yang pHnya netral. Timotius 2004 juga melaporkan bahwa pigmen merah dan
kuning angkak lebih stabil terhadap panas pada pH tinggi daripada pH asam. Fabre et al 1993 juga menyatakan bahwa pigmen merah angkak lebih stabil pada kondisi
alkali dan paling sensitif terhadap pH asam. Carvalho et al 2005 menyatakan bahwa penurunan pigmen lebih cepat pada pH rendah, kemungkinan berhubungan
dengan percepatan interaksi air dengan pigmen oleh adanya asam seperti rusaknya ikatan ester dari rubropunktamin atau monaskorubramin.
Kadar lovastatin angkak monokultur dan ko-kultur oleh pengaruh suhu menunjukkan bahwa perlakuan suhu 70˚C, 100˚C, 121˚C dengan waktu kontak15-45
menit dan suhu 70˚C-121˚C dengan waktu kontak 15 dan 30 menit, tidak mempengaruhi kadar lovastatin angkak yang diproduksi secara monokultur maupun
secara ko-kultur p0,05. Apabila waktu pemanasan pada suhu 121˚C diperpanjang hingga 45 menit, maka menyebabkan penurunan kadar lovastatin angkak ko-kultur
p0,05.
Penurunan kadar lovastatin angkak akibat perlakuan sampai suhu tertentu, kemungkinan disebabkan oleh kerusakan pada struktur lovastatin. Lovastatin
mempunyai kerangka utama poliketida, suatu cincin hidroksiheksahidronaptalen, pada rantai sisi C6 dan C8, terikat metilbutirat dan suatu hidroksilakton. Akibat
perlakuan panas dimungkinkan terjadi kerusakan pada gugus penyusun lovastatin, antara lain akibat terlepasnya gugus yang menyusun kerangka poliketida yang berupa
cincin hidroksiheksahidronaptalen. Juga dimungkinkan terjadi kerusakan ikatan rangkap pada struktur tersebut atau menyebabkan ikatan rangkap terbuka Simpson,
1985.
Meskipun terjadi penurunan kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur M purpureus TOS dengan E. burtonii oleh pengaruh perlakuan suhu121˚C dengan
waktu kontak 45 menit, namun kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur tersebut masih lebih tinggi dibandingkan kadar lovastatin angkak penelitian-penelitian sebelumnya.
Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com
116
Angkak hasil ko-kultur dengan kadar lovastatin yang masih relatif tinggi, memiliki potensi yang cukup tinggi untuk diaplikasikan pada produk-produk pangan sekaligus
sebagai pangan fungsional. Disamping itu, produk angkak hasil ko-kultur berpeluang sebagai salah satu sumber lovastatin yang sangat potensial dan relatif murah.
Lovastatin merupakan bahan bioaktif kelompok statin yang sangat penting dalam perkembangan biomedis Altieri,2001. Sudah lama lovastatin dikenal sebagai
senyawa penurun kolesterol dengan melakukan penghambatan enzim HMG-CoA reductase 3-hidroksi metilglutaril CoA reduktase yang berperan penting dalam
biosintesis kolesterol . Sampai saat ini Indonesia masih tergantung pada impor bahan ini.
Kadar lovastatin angkak monokultur dan ko-kultur oleh pengaruh perlakuan pH. Perlakuan pH 3,0, 5,0 dan 7,0 pada semua waktu kontak tidak
mempengaruhi stabilitas kadar lovastatin angkak monokultur dan pH 7,0 pada semua waktu kontak terhadap angkak ko-kultur, tidak mempengaruhi kadar lovastatin
angkak dan ko-kultur p0,05. Sedangkan pH 3,0 dan pH 5,0 pada semua waktu kontak, menyebabkan penurunan kadar lovastatin angkak hasil ko-kultur p0,05.
Lovastatin angkak hasil ko-kultur M purpureus TOS dengan E. burtonii memiliki karakteristik stabil pada pH netral, dan tidak stabil atau mengalami
penurunan pada pH asam 3,0 dan 5,0. Aplikasi angkak secara luas pada produk pangan diupayakan pada kondisi
pH netral 7,0 dan dihindari penggunaan pada produk pangan yang mempunyai pH asam untuk mencegah penurunan kadar lovastatin angkak.
Created with Print2PDF. To remove this line, buy a license at: http:www.software602.com
117
9. SIMPULAN DAN SARAN
Kategori