80
Pengujian Ekspresi Gen Sambrook et al 1989
a. Isolasi total RNA : Pemecahan dinding sel M. purpureus, Homogenisasi,
Separasi dan Presipitasi RNA
Tiga strain M. purpureus JmbA H410
3
, AID H210
3
, TOS H610
4
ditumbuhkan pada media Malt Extract Agar MEA selama 7 hari pada suhu ±30 ˚C.
Masing-masing strain M. purpureus kontrol JmbA, AID, dan TOS juga
ditumbuhkan pada media dan kondisi suhu yang sama. Setelah terbentuk pigmen secara optimal 7 hari, kapang diremajakan kembali pada kondisi yang sama selama
3-4 hari untuk diisolasi RNA. Setelah kultur berumur 3-4 hari, dibekukan di dalam deep freezer
suhu ±-79 ˚C selama ± 20 menit kemudian dihaluskan dengan mortar
sampai halus. Sampel ditambah 1 ml reagen TRIzol, dan disentrifus pada 12.000 x g 10 menit, pada suhu 2-8
˚C. Supernatan diinkubasi selama 5 menit pada suhu 15- 30
˚C. Sampel kemudian ditambah kloroform 0,2 ml, ditutup rapat dan dikocok perlahan selama 15 detik, kemudian diinkubasi lagi selama 15 menit pada 15-30
˚C. Sentrifugasi dilakukan pada 12.000 x g selama 15 menit pada 2-8
˚C. Presipitasi RNA dilakukan dengan mencampur bagian yang tidak berwarna dengan 0,5 ml isopropil
alkohol isopropanol. Sampel diinkubasi pada 15-30 ˚C selama 10 menit, kemudian
disentrifus 12.000 x g selama 10 menit pada 2-8 ˚C. Jika belum terbentuk endapan
pelet, sampel disimpan selama 1 malam atau lebih di dalam pendingin.
b. Pencucian dan Pelarutan kembali RNA
Pelet RNA dicuci dengan etanol 75, kemudian dikering anginkan. RNA dilarutkan dalam aquades bebas RNAse aquades perlakuan DEPC:
diethylpyrocarbonate 0,01 vv, dikehendaki nilai absorbansi setelah pelarutan
lebih dari 1.6 A
260280
1,6. Inkubasi dilakukan selama 10 menit pada 55-60 ˚C.
Sampel dianalisis kemurnian dan konsentrasi RNA dengan spektrofotometer pada absorbansi 260 dan 280. Rasio serapan pada A 260280 lebih dari 1,8, menunjukkan
bahwa RNA total hasil isolasi adalah murni Sambrook et al,1989. Konsentrasi RNA total dihitung dengan rumus sebagai berikut [RNA total]=A
260
x 40µgml x fp,
81
A
260
=nilai absorban RNA pada panjang gelombang 260nm, 40µgml= nilai faktor konversi 1 unit absorban pada 260 nm sebanding dengan 40µg RNA per ml,
fp=faktor pengenceran Wilson dan Walker 2000.
c. Elektroforesis gel agarosa
Kategori