d. Suhu penyimpanan kulit buah manggis sampai proses ekstraksi
e. Waktu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium UNAIR
f. Suhu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium UNAIR
3.5 Defenisi Operasional
NO VARIABEL
DEFINISI OPERASIONAL
CARA UKUR HASIL
UKUR SKALA
UKUR
Variabel Bebas
1 Ekstrak kulit
manggis pelarut etanol
100, 50, 25,
12,5, 6,25 dan 3,125
Ekstrak kulit manggis pelarut
etanol adalah ekstrak yang
diperoleh dengan
melakukan ekstraksi kulit
manggis yang telah dimaserasi
dengan pelarut etanol sehingga
diperoleh ekstrak kental
Hasil maserat diuapkan
dengan Vacuum
Rotary Evaporator
pada tekanan 1 ATM dan
diperoleh ekstrak kental
kulit manggis pelarut etanol.
Dalam satuan liter
l Rasio
Variabel Tergantung
2 KHM Kadar
Hambat Minimal
KHM adalah konsentrasi
minimal bahan coba yang
mampu Dengan
menggunakan metode
pengenceran dilusi
Dalam satuan
CFU ml Colony
forming Rasio
menghambat pertumbuhan
bakteri setelah diinkubasi 24
jam dan tidak tumbuh koloni
bakteri pada media
perbenihan unit
milliliter
3 KBM Kadar
Bunuh Minimal
KBM adalah konsentrasi
minimal bahan coba yang dapat
membunuh 99,9 atau
100 bakteri setelah
dilakukan uji dilusi selama 24
jam Dengan
menghitung jumlah koloni
bakteri pada media padat
dengan menggunakan
metode Drop Plate Mills
Mesra Dalam
satuan CFU ml
Colony forming
unit milliliter
Rasio
3.6 Bahan dan Alat Penelitian 3.6.1 Bahan Penelitian
- Kulit buah manggis sebanyak 1 kg Sibolangit, Medan - Pelarut etanol 70 5 liter Kimia Farma, Indonesia
- Suspensi E. faecalis ATCC 29212 UGM, Indonesia - Media Mueller Hinton Agar Difco, USA
3.6.2 Alat Penelitian
- Timbangan Home Line, China - Kertas perkamen 3 kajang
- Blender Panasonic, Japan - Kapas 250 gram Bio Panca, Indonesia
- Kertas saring Whatman no 42, England - Aluminium foil 1 gulungan Total Wrap, Indonesia
- Perkolator - Erlenmeyer Pyrex, USA
- Vaccum Rotary Evaporator Heidolph VV 2000, Germany - Blender Panasonic, Japan
- Kertas saring Whatman no.42, England - Autoklaf Tomy, Japan
- Electronic Balance Ohyo JP2 6000,Japan - Vortexwhirli mixer Iwaki model TM-100, Japan
- Kaca pembesar Ootsuka ENV-CL, Japan - Pipet mikro dan tips Gilson, France
- Inkubator CO
2
Sanyo, Japan - Piring petri Pyrex, Japan
3.7 Prosedur Pengambilan dan Pengumpulan Data 3.7.1 Prosedur Pembuatan Ekstrak kulit buah manggis
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan sampel dari daerah lain. Tumbuhan yang digunakan adalah buah manggis
yang diperoleh dari Sibolangit, Medan. Bahan baku yang digunakan adalah kulit buah manggis sebanyak 1000 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih di bawah air
yang mengalir, ditimbang, lalu diiris halus setebal ± 0,3 mm dan dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari. Sampel yang telah kering kemudian diblender
sampai menjadi serbuk simplisia sebanyak 300 gram. Kemudian dimasukkan ke
dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 70. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel.
Setelah 3 jam, dilanjutkan dengan proses perkolasi. Perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas secukupnya pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas
kapas tersebut diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator
dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dengan sendok dan di atasnya dilapisi selapis kertas saring. Kemudian etanol 70 dituangkan ke dalam perkolator dan massa
disaring dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari untuk mengetahui apakah
perkolator sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam.
Setelah 24 jam, bagian ujung perkulator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetesmenit.
Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai
perkolat yang dihasilkan berwarna jernih dimana diperoleh ekstrak cair sebanyak 3,5 liter. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan
Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan 1 ATM dengan temperatur 50°C. Setelah sehingga diperoleh ekstrak kental kulit buah manggis sebanyak 50 gram.
Gambar 6. Pengeringan dalam lemari pengering
Gambar 5. Pemotongan kulit manggis
Gambar 4. Penimbangan berat basah kulit manggis
Gambar 7. Kulit manggis kering
Gambar 9. Penumbukan kulit manggis yang
kering
Gambar 10. Penghalusan kulit manggis dengan
blender Gambar 11. Perendaman
simplisia Gambar 8. Penimbangan berat
kering kulit manggis
3.7.2 Pembuatan media bakteri Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Mueller Hinton Agar, sebanyak
12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlPetri, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media
yang telah masak, disterilkan didalam autoklaf selama 15 menit dengn tekanan udara 2 ATM suhu 121°C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin.
Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
3.7.3 Pembiakan spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Enterococcus faecalis yang digunakan adalah specimen stem-cell E.faecalis ATCC 29212 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang
telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakkan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur
disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standard 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml. Gambar 12. Proses Perkolasi
kulit manggis Gambar 13. Penguapan ekstrak
cair dengan vacuum rotavapor
3.7.4 Penentuan KHM bahan coba
Bahan coba ekstrak kulit buah manggis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Dari masing-masing konsentrasi
tersebut diambil sebayak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah
dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks.
Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung- tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing
bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan yang merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau
bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis dalam media perbenihan setelah dinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman
dalam media perbenihan tersebut. 3.7.5 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125 dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi
di atas divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Mueller Hinton Agar, direplikasi 6 petri, diamkan selama 15-20 menit
sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24
jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri.
Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang
dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor
pengali. Oleh karena itu, karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitugan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dlakukan
dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50μl, maka hasil perhitungan harus
dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standard CFUml.
3.8 Analisa Data
Data dari setiap pemeriksan dianalisis dengan memakai uji statistik yaitu: 1. Uji analisis varians satu arah ANOVA, untuk mengetahui efek
antibakteri ekstrak kulit manggis terhadap pertumbuhan E. faecalis. 2. Uji Least Significant Difference LSD, untuk melihat perbedaan efek
antibakteri antar kelompok perlakuan.
BAB 4 HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstraksi kulit buah manggis
Ekstrak etanol kulit buah manggis diperoleh dari 1000 gram kulit buah manggis yang kemudian dikeringkan dan dihaluskan menjadi bentuk simplisia
sebanyak 300 gram. Simplisia tersebut kemudian diperkolasi dengan menggunakan pelarut etanol 70 sebanyak 5 liter. Didapat maserat cair sebanyak 3,5 liter dari
proses tersebut. Kemudian maserat cair diuapkan dalam alat vacuum rotary evaporator sehingga dihasilkan ekstrak kental kulit buah manggis Gambar 14
sebanyak 50 gram.
Gambar 14. Ekstrak kental etanol kulit
buah manggis
4.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Pengujian efektivitas antibakteri dilakukan dengan mengamati perubahan kekeruhan pada tiap konsentrasi bahan coba. Dimulai dari konsentrasi 100, 50,
25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Penetapan konsentrasi berdasarkan pada standard Laboratorium Tropical Disease, UNAIR dengan metode pengenceran ganda dilusi.
Perubahan yang terjadi ditandai dengan hasil biakan mulai tampak jernih bila dibandingkan dengan kontrol Mac Farland Gambar 15 yang diinkubasi 24 jam.
Selanjutnya dilakukan penghitungan jumlah koloni bakteri menggunakan metode
