3.7.2 Pembuatan media bakteri Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media Mueller Hinton Agar, sebanyak
12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri 20 mlPetri, lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media
yang telah masak, disterilkan didalam autoklaf selama 15 menit dengn tekanan udara 2 ATM suhu 121°C. Setelah disterilkan, media disimpan dalam lemari pendingin.
Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
3.7.3 Pembiakan spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO
2
. Enterococcus faecalis yang digunakan adalah specimen stem-cell E.faecalis ATCC 29212 yang telah dibiakkan secara murni pada media MHA yang
telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakkan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur
disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9 sampai diperoleh kekeruhan sesuai standard 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 10
8
CFUml. Gambar 12. Proses Perkolasi
kulit manggis Gambar 13. Penguapan ekstrak
cair dengan vacuum rotavapor
3.7.4 Penentuan KHM bahan coba
Bahan coba ekstrak kulit buah manggis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125. Dari masing-masing konsentrasi
tersebut diambil sebayak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah
dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks.
Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO
2
dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung- tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing
bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan yang merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau
bahan uji apapun yang mampu menghambat pertumbuhan Enterococcus faecalis dalam media perbenihan setelah dinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman
dalam media perbenihan tersebut. 3.7.5 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah
koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100, 50, 25, 12,5, 6,25 dan 3,125 dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi
di atas divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Mueller Hinton Agar, direplikasi 6 petri, diamkan selama 15-20 menit
sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24
jam. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri.
Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang
dipakai adalah CFU Colony Forming Unit ml cairan suspensi.
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor
pengali. Oleh karena itu, karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitugan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dlakukan
dilusi maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50μl, maka hasil perhitungan harus
dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standard CFUml.
3.8 Analisa Data
