13. Inkubator CO
2
Sanyo, Japan 14.
Pipet mikro Gilson, France 15.
Piring petri Pyrex, Japan
4.6 Tempat dan Waktu Penelitian 4.6.1 Tempat Penelitian
1. Laboratorium Obat Tradisional Farmasi USU 2. Laboratorium Lembaga Pusat Penyakit Tropis UNAIR
4.6.2 Waktu penelitian
Waktu penelitian adalah 6 bulan November 2011 April 2012
4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Pegagan
Pegagan dicuci bersih dengan air mengalir lalu diambil seluruh bagian yang berada di atas tanah kecuali akar dan stolonnya Gambar 4 kemudian ditimbang
sebanyak 3 kg Gambar 5 lalu dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40
C selama 3 hari. Tanaman dikatakan sudah kering apabila bagian tanaman hancur ketika diremas Gambar 6. Pegagan yang telah kering kemudian ditimbang kembali,
dihaluskan dengan blender Gambar 7, diayak dan didapat simplisia Gambar 8 lalu diletakkan dalam wadah dan tuangkan etanol 96 sebanyak 1500 ml untuk
merendam simplisia Gambar 9 dan didiamkan selama 1 jam dengan suhu 25 C.
Massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dengan sendok, kemudian tuangkan etanol 96 sebanyak 300 ml dan
Universitas Sumatera Utara
disaring dengan selapis kertas saring, biarkan sampai cairan mulai menetes untuk mengetahui apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik. Perkolator ditutup dan
dilakukan maserasi selama 24 jam. Perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan ±
20 tetesmenit Gambar 10, etanol ditambahkan berulang-ulang secukupnya hingga selalu terdapat selapis cairan penyari diatas simplisia sampai didapat 10 liter ekstrak
cair. Ekstrak cair diuapkan dengan alat vacuum rotavapor Gambar 11 pada suhu 46°C selama 5 jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari. Penguapan dengan vaccum
rotavapor dilakukan selama 4 hari karena jumlah keseluruhan ekstrak cair yang
diperoleh adalah 10 liter, sampai diperoleh ekstrak kental dengan konsistensi seperti madu. Ekstrak pegagan dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup lalu disimpan di
tempat yang sejuk.
Gambar 4. Bagian pegagan yang diambil Gambar 5. Penimbangan pegagan
1 cm
Universitas Sumatera Utara
Gambar 6. Pengeringan pegagan dalam lemari pengering
Gambar 7. Penghalusan pegagan kering dengan blender
Gambar 8. Simplisia pegagan Gambar 9. Perendaman simplisia
Gambar 10. Proses perkolasi pegagan
Gambar 11. Penguapan ekstrak cair dengan vacuum rotavapor
Universitas Sumatera Utara
4.7.2 Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak pegagan dalam pelarut etanol ditimbang menggunakan electronic balance
dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth MHB. Mula-mula dilarutkan 1 gram
ekstrak kental pegagan ke dalam 1 ml MHB untuk mendapatkan konsentrasi 100 ekstrak pegagan. Kemudian diambil setengah dari konsentrasi 100 dan dilarutkan
dalam 1 ml MHB agar diperoleh konsentrasi 50, dan seterusnya sampai didapat konsentrasi 3,125. Masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung dan
diberi label.
4.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Mueller Hinton Agar
MHA. Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam petri 20 mlpetri lalu media disterilkan dalam autoklaf selama
15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121 C. Kemudian media dimasukkan
kedalam inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak. Jika media steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan spesimen.
4.7.4 Pembiakan Spesimen
E.faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel E.faecalis ATCC 29212
yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil
beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9
Universitas Sumatera Utara
hingga konsentrasi 10
6
CFU ml CFU: Colony Forming Unit atau setara dengan 0,5
Mc Farland Standard .
4.7.5 Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ekstrak etanol pegagan yang diuji dalam penelitian ini adalah 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Dari masing-masing konsentrasi
ekstrak etanol pegagan dari pengenceran yang telah dilakukan tersebut, ambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri
dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian dicampur dengan vorteks, lalu diinkubasi pada suhu 37
C selama 24 jam pada inkubator CO
2
. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektrofotometer, lalu bandingkan tabung-tabung tersebut dengan
kontrol untuk menentukan nilai KHM.
4.7.6 Penentuan KBM Bahan Coba
Dari hasil prosedur penentuan nilai KHM dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plate Miles Mesra yaitu ekstrak etanol
pegagan 100, 50, 25, 12,5, 6,25, dan 3,125. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas dicampur
dengan vorteks dan diambil 50 µ l dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam MHA, dilakukan 4 replikasi, diamkan selama 15-20 menit.
Setelah mengering diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C selama 24
jam.
Universitas Sumatera Utara
Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk
koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri
pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni
bakteri merupakan konsentrasi awal sebelum dilakukan dilusi maka faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri
pada media padat sebanyak 50 µ l, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar CFUml.
Contoh cara perhitungan koloni bakteri pada bahan coba dengan metode Drop Plate Miles Mesra
adalah : • Ambil 50 µl bahan coba dengan mikropipet dan diteteskan pada MHA. Setelah
diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada media dihitung. • Jika tetesan berjumlah 5 koloni, maka jumlah kuman pada sampel cair tersebut
adalah : 5 x 1 faktor pengenceran x 20 faktor pengali = 100 CFU ml
4.8 Analisis Data
