Karakterisasi Gen Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung Ayam Walik Ayam Leher Gundul dan Ayam Arab
KARAKTERISASI GEN PROLAKTIN (PRL) PADA AYAM
KAMPUNG AYAM WALIK AYAM LEHER
GUNDUL DAN AYAM ARAB
AYU FEBRIANI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi Gen
Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung Ayam Walik Ayam Leher Gundul dan
Ayam Arab adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Ayu Febriani
NIM D14090040
ABSTRAK
AYU FEBRIANI. Karakterisasi Gen Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung
Ayam Walik Ayam Leher Gundul dan Ayam Arab. Dibimbing oleh JAKARIA
dan MARIA ULFAH.
Ayam asli dan ayam lokal Indonesia merupakan plasma nutfah yang
memiliki potensi untuk dikembangkan.
Salah satu potensi yang dapat
dikembangkan adalah peningkatan produksi telur. Rendahnya produksi telur pada
ayam lokal disebabkan karena sifat mengeram yang masih tinggi. Sifat mengeram
dikendalikan oleh gen prolaktin (PRL). Saat ini data mengenai karakteristik gen
PRL pada ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab masih
terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik gen PRL pada
ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab. Sampel darah
diekstraksi untuk mendapatkan DNA kemudian dilakukan amplifikasi fragmen
gen prolaktin dengan teknik PCR. Sebanyak 20 sampel berhasil teramplifikasi
pada suhu annealing 60 °C selama 45 detik dan selanjutnya disekuensing. Hasil
sekuensing DNA dianalisis menggunakan program MEGA 5. Hasil analisis
sekuens fragmen gen prolaktin (PRL) menunjukan nilai kesamaan sebesar 98%99% dengan data sekuens gen prolaktin yang ada pada GenBank. Ditemukan 11
titik mutasi pada fragmen PRL dengan tipe mutasi delesi, insersi, transisi dan
transversi yang berpotensi sebagai single nucleotide polymorphism (SNP) baru.
Kata kunci: ayam lokal, gen prolaktin, single nucleotide polymorphism (SNP)
ABSTRACT
AYU FEBRIANI. Characterization of Prolactin (PRL) Gene in Ayam Kampung
Ayam Walik Ayam Leher Gundul and Ayam Arab. Supervised by JAKARIA and
MARIA ULFAH
Indigenous and local chicken germ plasm in Indonesia have a high potency
to be developed. One of the potency that can be developed is an improvement egg
production. Low egg production of those chickens can be increased by selecting
the in broodiness. Broodiness is controlled by prolactin gene (PRL). Since the
characteristics of PRL gene of kampung, walik, leher gundul and arab are still
limited refence, therefore this study aim to investigate the characteristic of PRL
gene on their. Blood samples were extracted to obtain DNA. PCR then was used
to amplified the fragment of PRL. A total of 20 samples successfully amplified
at annealing temperature of 60 °C for 45 seconds and then directly sequenced.
DNA sequencing results were analyzed using the MEGA 5 program. PRL gene in
this study had similarity of 98%-99% with the PRL gene sequence data available
on GenBank. This study also shows that there were 11 point mutation of PRL
gene’s fragment with the type of mutations were deletions, insertions, transitions
and transvertion. Those mutation types have potency as new single nucleotide
polymorphisms (SNPs).
Keywords: prolactin gene (PRL), single nucleotide polymorphism (SNP)
KARAKTERISASI GEN PROLAKTIN (PRL) PADA AYAM
KAMPUNG AYAM WALIK AYAM LEHER
GUNDUL DAN AYAM ARAB
AYU FEBRIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Karakteri sas i Gen Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung Ayam
Walik Ayarn Leher Gundul dan Ayarn Arab
Nama
: Ayu Febriani
NIM
: D14090040
Disetujui oleh
ｾｍｓｃａｧｲ
Tanggal Lulus:
1 2 SEI 2
Pernbirnbing II
Judul Skripsi : Karakterisasi Gen Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung Ayam
Walik Ayam Leher Gundul dan Ayam Arab
Nama
: Ayu Febriani
NIM
: D14090040
Disetujui oleh
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing I
Maria Ulfah, SPt MScAgr
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 sampai April 2013 ini ialah
Genetika Molekuler Ternak dengan judul Karakterisasi Gen Prolaktin (PRL) pada
Ayam Kampung Ayam Walik Ayam Leher Gundul dan Ayam Arab. Penelitian
ini didanai oleh Ibu Maria Ulfah, SPt MScAgr.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Jakaria SPt, MSi dan Ibu
Maria Ulfah SPt, MScAgr selaku pembimbing, serta Bapak Prof Dr Ir Cece
Sumantri MAgrSc yang telah banyak memberi saran. Terima kasih juga penulis
ucapkan kepada Bapak Dr Rudi Afnan SPt MScAgr dan Ibu Ir Widya Hermana
MSi yang telah banyak memberikan saran dan masukan serta kepada Bapak M.
Baihaqi SPt MSc atas masukannya. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Sdr Eryk Andreas, Sdr Irene dan Sdr Ferdy Saputra dari
Laboratorium Genetika Molekuler, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor
yang telah membantu pelaksanaan penelitian. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, nenek Baniar serta keluarga besar Mak Raminan,
atas segala doa dan kasih sayangnya. Tak lupa penulis mengucapkan terima kasih
kepada teman-teman Azyra atas kekeluargaannya dan teman-teman tim unggas
Tasya, Lusi dan Olin serta keluarga Golden Ranch atas kebersamaannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013
Ayu Febriani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Elektroforesis
Perunutan Produk PCR (Sekuensing)
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Prolaktin (PRL)
Karakteristik Gen Prolaktin (PRL)
Homologi Gen Prolaktin (PRL)
Komposisi Basa Nukleotida Gen Prolaktin (PRL)
Deteksi Mutasi Gen Prolaktin (PRL)
Jarak Genetik dan Pohon Filogenik Sekuens Fragmen Gen Prolaktin (PRL)
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
8
11
11
13
17
DAFTAR TABEL
1 Hasil Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) gen prolaktin
(PRL)
2 Rataan komposisi basa nukleotida sekuens fragmen gen prolaktin
(PRL) di promotor
3 Mutasi basa nukleotida pada fragmen gen prolaktin(PRL)
4 Jarak genetik fragmen gen prolaktin (PRL)
6
6
7
9
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Ayam kampung, ayam walik, ayamleher gundul dan ayam arab
Tahapan proses penelitian
Tahapan proses ekstraksi
Hasil elektroforesis produk PCR fragmen gen prolaktin (PRL) pada gel
agarose 1.5%
5 Hasil rekonstruksi pohon filogenik dengan metode Neighbor-Joining
berdasarkan fragmen prolaktin (PRL)
2
3
5
5
10
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ayam lokal sebagai plasma nutfah yang tersebar di seluruh Indonesia
memiliki potensi yang harus dikembangkan.
Berdasarkan data statistik
peternakan, populasi ayam lokal Indonesia pada tahun 2010 sebesar 257 544 000
ekor dan pada tahun 2011 meningkat menjadi 274 893 000 ekor (DPKH 2011).
Peningkatan populasi ayam lokal yang relatif lambat salah satunya disebabkan
oleh produksi telur yang relatif rendah. Rata-rata produksi telur ayam lokal
seperti ayam kampung hanya 47 butir/induk/tahun dengan pemeliharaan ektensif
dan 146 butir/induk/tahun dengan pemeliharaan intensif (Sulandari et al. 2007).
Rendahnya produksi telur ayam lokal salah satunya disebabkan oleh masih
tingginya sifat mengeram yang umumnya terdapat pada ayam lokal Indonesia.
Salah satu upaya untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan dengan
mengurangi atau menghilangkan sifat mengeram pada ayam.
Seleksi
konvensional untuk menghilangkan sifat mengeram telah dilakukan untuk
membentuk ayam ras petelur komersial, tapi membutuhkan waktu yang cukup
lama. Adanya teknologi molekuler, seleksi bisa dilakukan sedini mungkin dengan
waktu yang relatif cepat yaitu dengan adanya penanda sifat mengeram yang dapat
diketahui melalui gen prolaktin (PRL) yang berpengaruh terhadap sifat
mengeram.
Salah satu teknik yang dapat digunakan adalah karakterisasi terhadap gen
prolaktin (PRL). Blakely dan Bade (1991) menyatakan bahwa prolaktin
merupakan gen yang mengontrol sifat mengeram karena merupakan bagian
penting berfungsinya neuroendocrine yang menstimulir terjadinya peristiwa
mengeram. Terjadinya peristiwa mengeram ini karena promotor prolaktin
berfungsi mengaktifkan awal transkipsi ekspresi gen prolaktin. Jika terjadi mutasi
pada promotor prolaktin, gen prolaktin tidak dapat bekerja sehingga tidak terjadi
ekspresi mengeram (Sartika 2005).
Hal ini menunjukkan bahwa gen PRL merupakan gen utama yang
memiliki peran terhadap sifat mengeram sehingga dapat digunakan sebagai
penanda genetik dalam program seleksi ayam lokal Indonesia khususnya pada
ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul (legund) dan ayam arab. Hingga
saat ini data yang berhubungan dengan keragaman gen PRL pada ayam lokal
Indonesia masih terbatas, sehingga diperlukan penelitian ini untuk mengetahui
karakteristik dari gen PRL pada ayam lokal Indonesia.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen PRL pada ayam
kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab. Mengindentifikasi titik
mutasi pada gen prolaktin untuk dijadikan sebagai single nucleotide
polymorphism (SNP) baru.
2
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah analisis pada 20 ekor ayam yang
meliputi ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab.
Penerapan teknologi sekuensing DNA untuk menentukan karakteristik dan titik
mutasi pada fragmen gen prolaktin. Analisis data dilakukan dengan menggunakan
metode Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) nukleotida.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan April 2013.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian
Pemuliaan dan Genetika Ternak, Depertemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, IPB.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel darah ayam sebanyak 20 yang
terdiri dari ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab
(koleksi Maria Ulfah, SPt MScAgr, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor).
Gambar 1 Ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab
Bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA darah adalah sampel darah, air
destilata, 1 x STE (5M NaCl, 2M tris HCL, 0.2M EDTA), Sodium Dodesil Sulfat
(SDS) 10%, proteinase K (5mg/ml), phenol, Chloroform Isoamil Alkohol (CIAA),
NaCl 5M, EtOH absolut, buffer TE 80% (tris EDTA) dan tissue. Bahan yang
digunakan dalam amplifikasi DNA adalah sampel DNA, PCR buffer, MgCl2,
dNTP (Deoxy Nukleotida Triposfat), primer, Taq DNA Polymerase, air destilata
dan pasangan primer.
Primer yang akan digunakan dalam penelitian ini berdasarkan penelitian Cui
et al. (2006). Forward 5’AGAGGCAGCCCAGGCATTTTAC-3’ dan Reverse
5’CCTGGGTCTGGTTTGGAAATTG-3’dengan panjang produk PCR 439 pb.
Bahan yang digunakan untuk elekroforesis dengan agarose gel 1.5% adalah
larutan 0.5 x TBE (Tris-Borat EDTA) 30 ml, serbuk agarose 0.45 gram, EtBr 2.5
3
μl, sampel DNA hasil PCR, loading dye (0.01% Xylene Cyanol, 0.01%
Bromtimol Blue, 50% gliserol), dan marker 100 bp.
Alat
Peralatan yang digunakan untuk ekstraksi DNA dari darah ayam adalah
tabung Eppendorf 1.5 ml, satu set mikro pipet dan tip, gunting, vortex mixer
sentrifuge, rotary mixer, inkubator, refrigerator dan freezer. Alat-alat yang
digunakan dalam amplifikasi DNA adalah satu set micropippet dan tip, mesin
PCR thermocycler, sentrifuge, rak, vortex dan tabung eppendorf. Peralatan yang
digunakan untuk elektroforesis dengan agarose gel diantaranya satu set tray pencetak
gel, timbangan digital, power supply 100 volt, satu set micropippet dan tip, beaker
glass, microwave, stirrer, dan UV Transilluminator.
Prosedur Analisis Data
Secara umum tahapan prosedur penelitian mulai dari persiapan sampel
sampai analisis penelitian dapat digambarkan pada bagan di bawah ini:
Gambar 2 Tahapan proses penelitian
Ekstraksi DNA
Secara umum tahapan prosedur penelitian mulai dari persiapan sampel
sampai analisis penelitian dapat digambarkan pada bagan di bawah ini:
Gambar 3 Tahapan proses ekstraksi
4
Ekstraksi DNA yang dilakukan mengacu pada Sambrook et al. (1989)
yang dimodifikasi. Sampel darah sebanyak 100 µl ditambahkan dengan 1 000 µl
air destilata, kemudian disentrifugasi 8000 rpm selama lima menit hingga
terbentuk endapan. Endapan tersebut ditambahkan dengan 1 x STE sebanyak 300
µl, 40 µl 10% SDS dan 10 µl proteinase K 5mg/ml lalu diinkubasi pada suhu 55
ºC selama dua jam dan digoyang pelan. Setelah itu ditambahkan 400 µl phenol,
400 µl CIAA dan 40 µl NaCl 5M, kemudian digoyang pelan pada suhu ruang
selama satu jam.
Sampel kemudian disentrifugasi selama lima menit dengan kecepatan 12
000 rpm. Cairan bening pada lapisan atas dipindahkan ke tabung yang baru
sebanyak 400 µl dan ditambahkan dengan EtOH absolut sebanyak 800 µl dan
NaCl 5 M sebanyak 40 µl, kemudian dibekukan selama 12 jam. Sampel
kemudian disentrifugasi selama lima menit dengan kecepatan 12 000 rpm dan
akan terbentuk endapan putih. Endapan putih ditiriskan dan ditambahkan dengan
100 µl TE 80%.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi dilakukan pada sampel hasil ekstraksi. Sebanyak 1 µl sampel
hasil eksraksi dimasukkan ke dalam tabung PCR. Sampel ditambahkan dengan
premix yang terbuat dari campuran 28.7µl air destilata, 3.5 µl 10 x PCR buffer,
0.5 µl MgCl2, 0.2 µl enzim Taq polymerase, dan 0.5 µl dNTPs dan 0.6 µl.
Campuran DNA dan premix diinkubasi dengan mesin PCR thermocycler. Proses
amplifikasi terdiri dari tahapan pertama yaitu proses predenaturasi pada suhu 95
ºC selama 5 menit. Tahapan kedua yang terdiri dari 35 siklus yaitu denaturasi
pada 95 ºC selama 30 detik, annealing pada suhu 60 ºC selama 45 detik dan
pemanjangan awal (ektensi) pada suhu 72 ºC selama 1 menit. Tahapan terakhir
adalah pemanjangan primer (ekstensi akhir) pada suhu 72 ºC selama 5 menit.
Elektroforesis
DNA hasil amplifikasi dielelektroforesis menggunakan agarose gel dengan
konsentrasi 1.5%. Sebanyak 0.45 g serbuk agarose ditambahkan dengan 30 ml,
0.5 x TBE. Campuran tersebut dipanaskan di microwave selama 5 menit hingga
mendidih dan distirer agar uapnya hilang. Setelah itu, ditambahkan dengan 2.5 μl
EtBr, kemudian dicetak pada cetakan hingga mengeras. Kemudian, masingmasing sampel DNA hasil PCR diambil sebanyak 5 μl ditambahkan dengan 1 μl
loading dye dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur di dalam gel, kemudian
running pada larutan 0.5 x TBE dengan voltase 100 volt selama kurang lebih 30 45 menit. Setelah itu, diberi sinar UV pada UV Transilluminator sehingga pitapita DNA akan terlihat. Pita-pita DNA yang terlihat berarti sampel berhasil
diamplifikasi dan dapat digunakan untuk tahapan selanjutnya.
Perunutan Produk PCR (Sekuensing)
Sampel yang sudah teramplifikasi selanjutnya siap untuk disekuensing.
Sekuensing dilakukan di perusahaan jasa pelayanan sekuensing (1st Base) dengan
menggunakan mesin Applied Biosystem dengan menggunakan metode Sanger.
5
Analisis Data
Perunutan dan pensejajaran hasil sekuen dengan runutan baku dari
GenBank dilakukan dengan menggunakan program MEGA5 (Tamura et al. 2012).
Hasil sekuens fragmen gen prolaktin dianalisis kesamaannya dengan acuan
sekuens yang ada di GenBank menggunakan aplikasi Basic Local Aligment
Search Tool (BLAST) (Altchul et al. 1990) [www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/]. Jarak
genetik diukur dengan menggunakan analisis Pairwise Distance Calculation.
Pohon filogenetik dibentuk dengan metode Neighbor-joining dengan
menggunakan prinsip pengelompokan taksa berdasarkan nilai jarak evolusioner
pasangan-pasangan operational taxonomy unit dengan setiap percabangannya di
dalam pohon filogeni berevolusi pada kecepatan yang berbeda (Hartl 2000).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Prolaktin (PRL)
Gen prolaktin (PRL) pada ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul
dan ayam arab berhasil diamplifikasi pada suhu annealing 60 ºC selama 45 detik
dengan panjang fragmen gen 439 pb (Gambar 1).
Gambar 4 Hasil elektroforesis produk PCR fragmen gen prolaktin
(PRL) pada gel agarose 1.5% Keterangan: M=Marker
Persentase keberhasilan gen prolaktin teramplifikasi dalam penelitian ini
adalah 100% karena sebanyak 20 sampel yang terdiri dari 5 ayam kampung, 5
ayam walik, 4 ayam leher gudul dan 6 ayam arab berhasil diamplifikasi
semuanya. Viljoen et al. (2005) menyatakan bahwa keberhasilan dalam
amplifikasi DNA tergantung pada interaksi komponen PCR dalam konsentrasi
yang tepat seperti suhu annealing, konsentrasi Mg2+, konsentrasi primer dan
konsentrasi DNA target.
6
Karakteristik Gen Prolaktin
Homologi Gen Prolaktin
Hasil analisis homologi/kesamaan fragmen gen prolaktin dilakukan untuk
menunjukkan kesamaan sekuens DNA gen prolaktin yang diteliti dengan yang ada
di GenBank. Analisis kesamaan fragmen gen prolaktin dilakukan dengan
menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Tabel 1). Hasil
analisis menunjukkan bahwa fragmen gen prolaktin (PRL) yang diteliti memiliki
tingkat kesamaan 98%-99% dengan gen prolaktin (PRL) yang ada di GenBank.
Hal ini menunjukkan bahwa fragmen DNA yang dianalisis benar merupakan
fragmen DNA gen prolaktin.
Tabel 1 Hasil Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) gen prolaktin (PRL)
Kode Akses
AY588294
AY588301
AY588308
AY588315
Deskripsi
Gen Prolaktin dari G. gallus (White Leghorn)
Gen Prolaktin dari G. gallus (Yangshan)
Gen Prolaktin dari G. gallus (Taihe Silkies)
Gen Prolaktin dari G. gallus (White Recessive
Rocks)
Homologi (%)
99
98
98
98
Widayat dan Subositi (2010) menyatakan analisis BLAST memiliki cara
kerja yaitu membandingkan satu input sekuen dengan semua sekuen yang ada di
database GenBank dengan tujuan untuk memastikan bahwa sekuen yang dianalisis
adalah fragmen gen prolaktin (PRL).
Komposisi Basa Nukleotida Gen Prolaktin
Fragmen gen prolaktin (PRL) yang diteliti adalah daerah promotor dengan
panjang produk 439 pb. Komposisi basa nukleotida dari ayam kampung, ayam
walik, ayam leher gundul dan ayam arab relatif sama (Tabel 2).
Tabel 2 Rataan komposisi basa nukleotida sekuens fragmen gen prolaktin (PRL)
di promotor
Sampel
Jumlah Sampel
AY588301 (GB)
AY588308 (GB)
AY588294 (GB)
Ayam arab
Ayam leher gundul
Ayam kampung
Ayam walik
1
1
1
6
4
5
5
T(U)
32.5
32.5
32.5
32.7
32.6
32.7
32.6
C
20.2
20.1
20.4
20.4
20.4
20.1
20.3
Persentase (%)
A
G A+T C+G
29.0 18.3 61.5 38.5
29.2 18.2 61.7 38.3
29.0 18.1 61.5 38.5
29.1 17.8 61.8 38.2
29.0 18.0 61.6 38.4
29.0 18.1 61.8 38.2
29.3 17.8 61.9 38.1
Keterangan : GB = GenBank
Jumlah basa nukleotida A+T memiliki frekuensi yang lebih tinggi dari pada
basa nukleotida C+G karena sekuen yang diteliti merupakan daerah promotor gen
yang merupakan titik awal terjadinya proses transkripsi. Proses transkripsi
7
memerlukan utas tunggal sementara itu DNA memiliki utas ganda yang diikat
oleh ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen merupakan ikatan yang lemah sehingga
mudah dilepas dan mudah terbentuk kembali. Akibatnya, pasangan utas ganda
DNA mudah terurai menjadi utas tunggal, karena basa nukleotida A+T memiliki
dua ikatan hidrogen sedangkan G+C memiliki tiga ikatan hidrogen. Hal ini
menyebabkan A+T memiliki ikatan yang lebih lemah dari pada G+C sehingga
mudah diuraikan oleh enzim yang berperan dalam proses transkipsi (Yusuf 2001).
Deteksi Mutasi Gen Prolaktin
Sekuens fragmen gen
digunakan untuk melihat titik
fragmen sekuens gen prolaktin
delesi, insersi, perubahan basa
menjadi C (Tabel 3).
prolaktin (PRL) yang dianalisis juga dapat
mutasi. Hasil setelah dilakukan pensejajaran
ditemukan mutasi basa nukleotida yang bersifat
C menjadi T, G menjadi basa A, dan basa G
Tabel 3 Mutasi basa nukleotida pada fragmen gen prolaktin (PRL) di promotor
Posisi
Mutasi (pb)
29
63
94
162
256
298
301
316
367
372
403
Ayam
Lokal Cina
(GenBank)
G
C
Mutasi
Jenis Ayam
Ayam
Ayam
Ayam
Kampung Walik
Leher
Gundul
Ayam
Arab
─
─
─
─
C
C>T
C
T
G
G
A
T
G
G
A
T>C
G>A
G>A
A>G
C
C
T>C
G
G
A
A
G
C
G
A
G
C>T
G
A
G>A
C>T
G>C
A
G
C>T
G>C
A>C
G
C>T
G>C
─
─
─
Keterangan: acces number GenBank AY588301, ─ : delesi
─
T>C
G>A
G>A
A>G
Berdasarkan hasil penelitian ditemukan 11 titik mutasi dengan variasi
yang berbeda antara ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam
arab. Mutasi yang terjadi pada fragmen gen prolaktin termasuk ke dalam tipe
delesi, insersi, tranversi dan transisi. Mutasi tipe transisi yang terjadi yaitu
perubahan basa nukleotida T menjadi C, dan G menjadi A sedangkan mutasi tipe
tranversi yaitu perubahan basa nukleotida G menjadi C (Tabel 3). Mutasi transisi
terjadi karena adanya perubahan antara basa purin (adenin dan guanin) dengan
basa purin lainnya atau antara basa pirimidin (timin dan sitosin) dengan pirimidin
lainnya (Nei 1987). Mutasi tipe tranversi terjadi karena adanya perubahan antara
basa purin menjadi pirimidin. Yunita (2009) menyatakan mutasi tipe delesi
terjadi karena pasangan basa tertentu menghilang sehingga terjadi perubahan
susunan basa nukleotida. Hasil penelitian menunjukkan adanya delesi pada basa
8
G di posisi 29 dari produk PCR gen prolaktin. Mutasi tipe insersi terjadi karena
adanya penyisipan basa tertentu (Camphel et al. 2002). Ditemukan mutasi tipe
insersi spesifik pada ayam leher gundul di posisi 94 yaitu insersi basa C.
Ditemukan 7 titik mutasi yang tidak mengubah asam amino (silent
mutation) dan 4 titik mutasi yang menyebabkan terjadinya perubahan asam amino
(missense). Mutasi tipe delesi pada titik 29 menyebabkan terjadi perubahan asam
amino gliserin menjadi alanin. Mutasi tipe insersi basa C pada titik 94
menyebabkan perubahan asam amino alanin menjadi arginin. Mutasi transisi basa
T menjadi C pada titik 162 menyebabkan terjadinya perubahan asam amino valin
menjadi alanin. Mutasi tipe transversi basa G menjadi C pada titik 403
menyebabkan perubahan asam amino valin menjadi leusin.
Terjadinya perubahan ini menyebabkan perubahan fungsi gen. Noor
(2008) menyatakan bahwa jika suatu gen mengalami mutasi maka terjadi
perubahan kimia basa nukleotida yang mengakibatkan berubahnya fungsi gen.
Perubahan basa G menjadi A yang spesifik pada ayam walik dan ayam arab dan
lebih spesifik lagi pada ayam arab yang menyebabkan perubahan fungsi gen yang
spesifik pada ayam arab, karena secara fenotipe ayam arab tidak memiliki sifat
mengeram. Adanya mutasi ini memungkinkan hilangnya sifat mengeram pada
ayam arab. Hal ini menungkinkan bahwa gen prolaktin (PRL) dapat dijadikan
sebagai Single Nucleotide Polymorphism (SNP).
Kwok (2003) menyatakan bahwa Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
umumnya merupakan perbedaan basa tunggal DNA antar individu. Pendeteksian
perbedaan basa ini terjadi pada penyisipan/penghilangan satu atau beberapa basa.
Hasil titik mutasi ini dapat dijadikan SNP tapi harus dibuktikan lagi dengan
melakukan pengujian polimorfik. Salah satu dapat dilakukan dengan melakukan
pengujian dengan enzim yang dikenal dengan teknik PCR-RFLP (Polymerase
Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism). Tujuannya agar
diketahui keragaman gen PRL sehingga dapat digunakan sebagai Marker Assited
Selection (MAS) yaitu dapat dimanfaatkan dalam program pemuliaan sebagai gen
kandidat untuk seleksi dalam menghasilkan ayam petelur yang unggul.
Jarak Genetik dan Pohon Filogenetik Sekuens Fragmen Gen Prolaktin
Analisis jarak genetik bertujuan untuk menunjukkan seberapa besar
perbedaan genetik antara dua haplotipe yang berbeda (Wisesa et al. 2012 ).
Berdasarkan hasil analisis yang dilakukan pada fragmen gen prolaktin didapat
jarak genetik terendah adalah 0.000 dan yang tertinggi adalah 0.005 (Tabel 4).
Matrik jarak genetik menunjukkan bahwa semakin besar nilai jarak genetik,
semakin besar perbedaan basa nukleotidanya sehingga semakin jauh pula
hubungan kekerabatannya.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ayam yang diteliti terdapat pada
kelompok yang sama, kecuali ayam walik 5 yang memiliki jarak genetik yang
berbeda. Hal ini karena perbedaan jenis ayam walik yaitu ayam walik 5
merupakan ayam ketawa yang memiliki bulu yang terbalik. Jarak genetik ayam
yang diteliti juga dibandingkan dengan jarak genetik White Leghorn, White
Recessive Rock, Yangshan, Taihe Silkies yang diakses melalui GenBank. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa ayam lokal yang diteliti memiliki jarak genetik
yang sama dengan ayam White Leghorn, White Recessive Rock, Yangshan, Taihe
Silkies.
9
Tabel 4 Jarak genetik fragmen gen prolaktin (daerah promotor) pada ayam lokal Indonesia
10
Pohon filogeni merupakan salah satu metode yang digunakan untuk
mengetahui keanekaragaman makhluk hidup melalui rekonstruksi hubungan
kekerabatan. Konsep filogeni adalah mengelompokkan organisme yang memiliki
kesamaan karakter yang dianggap memiliki hubungan yang dekat yang diturunkan
dari nenek moyangnya (Pradipta 2012).
Gambar 5 Hasil rekonstruksi pohon filogenetik dengan metode Neighbor Joining
berdasarkan fragmen gen prolaktin (PRL)
Berdasarkan fragmen gen prolaktin sepanjang 439 pb didapat hasil
rekonstruksi pohon filogenetik ke dalam 2 kelompok. Yangshan (AY588301),
Taihe Silkies (AY588308), White Leghorn (AY588294), White Recessive Rocks
(AY588315), ayam yang diteliti terletak pada kelompok yang sama kecuali ayam
walik 5 yang terpisah (Gambar 2). Hal ini karena perbedaan jenis ayam walik
yang diteliti yaitu ayam walik 5 merupakan ayam ketawa yang memiliki bulu
yang terbalik. Adanya perbedaan kelompok ini menunjukkan bahwa ayam walik
5 masih tergolong ayam ketawa yang memiliki rumpun yang berbeda dengan
ayam lainnya yang diteliti. Hasil rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan
fragmen gen prolaktin sepanjang 439 pb ini memiliki tingkat keseragaman yang
11
tinggi antar individu yang diteliti sehingga kurang tepat digunakan sebagai
penanda untuk membedakan ayam yang diteliti.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penelitian karakterisasi gen prolaktin (PRL) dilakukan pada ayam kampung,
ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab dengan panjang fragmen gen
prolaktin 439 pb yang terletak pada promotor. Fragmen gen prolaktin (PRL) yang
diteliti memiliki tingkat kesamaan 98%-99% dengan fragmen gen prolaktin yang
ada di GenBank dan ditemukan 11 titik mutasi. Tipe mutasi yang ditemukan
meliputi delesi, insersi, transversi dan transisi yang memiliki variasi pada masingmasing ayam serta spesifik pada ayam walik dan ayam arab. Titik mutasi ini
berpotensi untuk dijadikan sebagai Single Nucleotida Polymorphism (SNP).
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk polimorfisme gen prolaktin (PRL)
pada ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab sesuai
dengan mutasi yang telah ditemukan, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai
Marker Assited Selection (MAS) dan diperlukan penelitian pada daerah fragmen
ekson dan intron yang lainnya gen prolaktin (PRL).
DAFTAR PUSTAKA
Altchul SF, Gish W, Miller W, Mayers EW, Lipman DJ. 1997. Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
Blakely J, Bade DH. 1991. Ilmu Peternakan. Edisi Ke-4. Yogyakarta (ID): Gadjah
Mada University Pr.
Camphel AN, Jane RB, Lawrence MG. 2002. Biology. Fifth Edition: England
(GB). Benjamin Cummings.
Cui JX, Du HL, Liang Y, Deny XM, Li N, Zhany XQ. 2006. Association of
polymorphism in the promoter region of chicken prolactin with age
production. Poult. Sc. 85: 26-31.
[DPKH] Direktorat Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan. 2012. Statistik
Peternakan dan Kesehatan Hewan 2012. Jakarta (ID): Direktoral Jendral
Peternakan dan Kesehatan Hewan.
Harlt DL. 2000. A Primer of Population Genetic. 3rd ed. Sunderland (GB):
Sinauer Association.
Kwok PY. 2003. Single Nucleotide Polymorphism Method and Protocols. New
Jersey (US): Humana Press Inc.
Nei M. 1987. Moleculer Evolutionary Genetics. New York (US): Culumbia
University Pr.
Noor RR. 2008. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
12
Pradipta Y. 2012. Studi molekuler untuk menentukan kekerabatan genus zingiber
varietas zerumbet [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Moleculer Cloning: Laboratory
Manual. USA (US): CSH Laboratory Pr.
Sartika T. 2005. Peningkatan mutu bibit ayam kampong melalui seleksi dan
pengkajian penggunaan penanda genetik promoter prolaktin dalam
MAS/Market Assisted Selection untuk mempercepat proses seleksi
[disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Sulandari S, Zein MSA, Sri P, Sartika T, Maria A, Widjastuti T, Sujana E,
Darana S, Setiawan I, Garnida D 2007. Sumberdaya genetik ayam lokal
Indonesia. Dalam buku Keragaman Sumber Daya Hayati Ayam Lokal
Indonesia: Manfaat dan Potensi. Pusat Penelitian Biologi. Bogor (ID): LIPI
Press.
Tamura K, Kumar S. 2012. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis
Software. Arizona (US): Arizona State University.
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnostic PCR Handbook.
Netherland (NT): Springer.
Widayat T, Subositi D. 2010. Kekerabatan filogenik buah Makassar (Brucea
javanica) berdasarkan gen ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksidase
[makalah]. Jakarta (ID). Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbangkes, Departemen
Kesehatan.
Wisesa DGNA, Pemayun OGT, Mahardika IGNK. 2012. Analisis sekuens DLoop DNA mitokontria sapi Bali dan banteng dibandingkan dengan bangsa
sapi lain di dunia. Indonesia Med. Ver. 1 (2): 281-292.
Yunita R. 2009. Pemanfaatan variasi somaklonal dan seleksi in vitro dalam
perakitan tanaman toleran cekaman abiotik. J. Litbang Pertanian. 28(4),
2009.
Yusuf M. 2001. Genetika 1: Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta (ID): CV Sagung
Seto.
13
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil pensejajaran sekuen gen prolaktin (promotor) dengan GenBank
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
------------------TTACCTCCTGGCCTTTGTGAATGCCTTCCTTTGTTATCTAATCTCTGATATTAATGAAAACTGTGTTTTATTTTG-GCACTA
------------------...........................................................................-......
------------------...........................................................................-......
------------------...........................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................C......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCCAGGCCCAGGTT..........-.................................T..............................-......
14
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CTTATCAACTCCTCAAAATGACAAGAATAGCAAAGTAGTAAATGAAAGAGCAAATGATGAGTTGAGAAATGTCGTTCCTTTTTTTCACAGGACTCCTCTA
.............................................................Y......................................
.............................................................C......................................
.............................................................Y......................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.............................................................C......................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.............................................................Y......................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ACGTTATAAGACACAAGGATTTTTCAGTCTTACCTGTAATATCTTGGATGGAGAAGATGAATTAAATCAAGAGCACAAACCATGTATGTGTGATTTAGAA
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.................................................................................................A..
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................R.........................................R..
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
15
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.................................................................................................A..
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................A.........................................A..
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GACAGCTATCTTTCCACCATCCATTCTAGTGTTTTGGCTGTGGCCCTGTTCTTAGTGCCTTGATCAGATTACACTTATCTCAGCTGGAGGCAACTACTTC
.......................................................................Y............................
.......................................................................T............................
.......................................................................Y............................
A..............M.......................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
R......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
A.................................................................A.................................
16
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
410
420
430
440
....|....|....|....|....|....|....|....|
GTGTACTCAGTAAGGCCTCAATTTCCAAAGCAGACCCAGG
..S.....................................
..C.....................................
..S..........................S..........
..C.....................................
........................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Koto Malintang, Sumatera Barat pada tanggal 24
Februari 1991 dari ayah Erizal dan ibu Nur Asnini. Penulis adalah putri pertama
dari dua bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Lareh Sago
Halaban dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian
Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan diterima di
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis dipercaya menjadi asisten praktikum
Teknologi Pengolahan Telur dan Daging Unggas pada tahun ajaran 2012/2013.
Penulis juga aktif di Himpunan Mahasiswa Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan (HIMAPROTER). Penulis juga aktif dalam dunia jurnalistik sebagai
staff marketing majalah pangan dan gizi EMULSI. Penulis juga pernah terlibat
dalam berbagai kepanitian semasa kuliah. Penulis juga aktif mengikuti lomba
karya tulis ilmiah. Diantaranya penulis meraih Medali Perak dalam Pekan Ilmiah
Mahasiswa Nasional (PIMNAS XXV) di Yogyakarta dalam Program Kreativitas
Mahasiswa di Bidang Penelitian tahun 2012. Program magang yang diikuti
penulis yaitu di PT. D-Farm Agriprima. Penulis juga dipercaya menjadi penyaji
materi Penulisan Proposal PKM dalam kajian P4 FORCES IPB pada tahun 2012.
KAMPUNG AYAM WALIK AYAM LEHER
GUNDUL DAN AYAM ARAB
AYU FEBRIANI
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi Gen
Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung Ayam Walik Ayam Leher Gundul dan
Ayam Arab adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, September 2013
Ayu Febriani
NIM D14090040
ABSTRAK
AYU FEBRIANI. Karakterisasi Gen Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung
Ayam Walik Ayam Leher Gundul dan Ayam Arab. Dibimbing oleh JAKARIA
dan MARIA ULFAH.
Ayam asli dan ayam lokal Indonesia merupakan plasma nutfah yang
memiliki potensi untuk dikembangkan.
Salah satu potensi yang dapat
dikembangkan adalah peningkatan produksi telur. Rendahnya produksi telur pada
ayam lokal disebabkan karena sifat mengeram yang masih tinggi. Sifat mengeram
dikendalikan oleh gen prolaktin (PRL). Saat ini data mengenai karakteristik gen
PRL pada ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab masih
terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui karakteristik gen PRL pada
ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab. Sampel darah
diekstraksi untuk mendapatkan DNA kemudian dilakukan amplifikasi fragmen
gen prolaktin dengan teknik PCR. Sebanyak 20 sampel berhasil teramplifikasi
pada suhu annealing 60 °C selama 45 detik dan selanjutnya disekuensing. Hasil
sekuensing DNA dianalisis menggunakan program MEGA 5. Hasil analisis
sekuens fragmen gen prolaktin (PRL) menunjukan nilai kesamaan sebesar 98%99% dengan data sekuens gen prolaktin yang ada pada GenBank. Ditemukan 11
titik mutasi pada fragmen PRL dengan tipe mutasi delesi, insersi, transisi dan
transversi yang berpotensi sebagai single nucleotide polymorphism (SNP) baru.
Kata kunci: ayam lokal, gen prolaktin, single nucleotide polymorphism (SNP)
ABSTRACT
AYU FEBRIANI. Characterization of Prolactin (PRL) Gene in Ayam Kampung
Ayam Walik Ayam Leher Gundul and Ayam Arab. Supervised by JAKARIA and
MARIA ULFAH
Indigenous and local chicken germ plasm in Indonesia have a high potency
to be developed. One of the potency that can be developed is an improvement egg
production. Low egg production of those chickens can be increased by selecting
the in broodiness. Broodiness is controlled by prolactin gene (PRL). Since the
characteristics of PRL gene of kampung, walik, leher gundul and arab are still
limited refence, therefore this study aim to investigate the characteristic of PRL
gene on their. Blood samples were extracted to obtain DNA. PCR then was used
to amplified the fragment of PRL. A total of 20 samples successfully amplified
at annealing temperature of 60 °C for 45 seconds and then directly sequenced.
DNA sequencing results were analyzed using the MEGA 5 program. PRL gene in
this study had similarity of 98%-99% with the PRL gene sequence data available
on GenBank. This study also shows that there were 11 point mutation of PRL
gene’s fragment with the type of mutations were deletions, insertions, transitions
and transvertion. Those mutation types have potency as new single nucleotide
polymorphisms (SNPs).
Keywords: prolactin gene (PRL), single nucleotide polymorphism (SNP)
KARAKTERISASI GEN PROLAKTIN (PRL) PADA AYAM
KAMPUNG AYAM WALIK AYAM LEHER
GUNDUL DAN AYAM ARAB
AYU FEBRIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Peternakan
pada
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN
FAKULTAS PETERNAKAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Karakteri sas i Gen Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung Ayam
Walik Ayarn Leher Gundul dan Ayarn Arab
Nama
: Ayu Febriani
NIM
: D14090040
Disetujui oleh
ｾｍｓｃａｧｲ
Tanggal Lulus:
1 2 SEI 2
Pernbirnbing II
Judul Skripsi : Karakterisasi Gen Prolaktin (PRL) pada Ayam Kampung Ayam
Walik Ayam Leher Gundul dan Ayam Arab
Nama
: Ayu Febriani
NIM
: D14090040
Disetujui oleh
Dr Jakaria, SPt MSi
Pembimbing I
Maria Ulfah, SPt MScAgr
Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam
penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 sampai April 2013 ini ialah
Genetika Molekuler Ternak dengan judul Karakterisasi Gen Prolaktin (PRL) pada
Ayam Kampung Ayam Walik Ayam Leher Gundul dan Ayam Arab. Penelitian
ini didanai oleh Ibu Maria Ulfah, SPt MScAgr.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr Jakaria SPt, MSi dan Ibu
Maria Ulfah SPt, MScAgr selaku pembimbing, serta Bapak Prof Dr Ir Cece
Sumantri MAgrSc yang telah banyak memberi saran. Terima kasih juga penulis
ucapkan kepada Bapak Dr Rudi Afnan SPt MScAgr dan Ibu Ir Widya Hermana
MSi yang telah banyak memberikan saran dan masukan serta kepada Bapak M.
Baihaqi SPt MSc atas masukannya. Di samping itu, penghargaan penulis
sampaikan kepada Sdr Eryk Andreas, Sdr Irene dan Sdr Ferdy Saputra dari
Laboratorium Genetika Molekuler, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor
yang telah membantu pelaksanaan penelitian. Ungkapan terima kasih juga
disampaikan kepada ayah, ibu, nenek Baniar serta keluarga besar Mak Raminan,
atas segala doa dan kasih sayangnya. Tak lupa penulis mengucapkan terima kasih
kepada teman-teman Azyra atas kekeluargaannya dan teman-teman tim unggas
Tasya, Lusi dan Olin serta keluarga Golden Ranch atas kebersamaannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2013
Ayu Febriani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur
Ekstraksi DNA
Amplifikasi DNA
Elektroforesis
Perunutan Produk PCR (Sekuensing)
Analisis Data
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Prolaktin (PRL)
Karakteristik Gen Prolaktin (PRL)
Homologi Gen Prolaktin (PRL)
Komposisi Basa Nukleotida Gen Prolaktin (PRL)
Deteksi Mutasi Gen Prolaktin (PRL)
Jarak Genetik dan Pohon Filogenik Sekuens Fragmen Gen Prolaktin (PRL)
SIMPULAN DAN SARAN
DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN
RIWAYAT HIDUP
vii
vii
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
6
6
6
7
8
11
11
13
17
DAFTAR TABEL
1 Hasil Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) gen prolaktin
(PRL)
2 Rataan komposisi basa nukleotida sekuens fragmen gen prolaktin
(PRL) di promotor
3 Mutasi basa nukleotida pada fragmen gen prolaktin(PRL)
4 Jarak genetik fragmen gen prolaktin (PRL)
6
6
7
9
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
Ayam kampung, ayam walik, ayamleher gundul dan ayam arab
Tahapan proses penelitian
Tahapan proses ekstraksi
Hasil elektroforesis produk PCR fragmen gen prolaktin (PRL) pada gel
agarose 1.5%
5 Hasil rekonstruksi pohon filogenik dengan metode Neighbor-Joining
berdasarkan fragmen prolaktin (PRL)
2
3
5
5
10
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Ayam lokal sebagai plasma nutfah yang tersebar di seluruh Indonesia
memiliki potensi yang harus dikembangkan.
Berdasarkan data statistik
peternakan, populasi ayam lokal Indonesia pada tahun 2010 sebesar 257 544 000
ekor dan pada tahun 2011 meningkat menjadi 274 893 000 ekor (DPKH 2011).
Peningkatan populasi ayam lokal yang relatif lambat salah satunya disebabkan
oleh produksi telur yang relatif rendah. Rata-rata produksi telur ayam lokal
seperti ayam kampung hanya 47 butir/induk/tahun dengan pemeliharaan ektensif
dan 146 butir/induk/tahun dengan pemeliharaan intensif (Sulandari et al. 2007).
Rendahnya produksi telur ayam lokal salah satunya disebabkan oleh masih
tingginya sifat mengeram yang umumnya terdapat pada ayam lokal Indonesia.
Salah satu upaya untuk mengatasi hal tersebut dapat dilakukan dengan
mengurangi atau menghilangkan sifat mengeram pada ayam.
Seleksi
konvensional untuk menghilangkan sifat mengeram telah dilakukan untuk
membentuk ayam ras petelur komersial, tapi membutuhkan waktu yang cukup
lama. Adanya teknologi molekuler, seleksi bisa dilakukan sedini mungkin dengan
waktu yang relatif cepat yaitu dengan adanya penanda sifat mengeram yang dapat
diketahui melalui gen prolaktin (PRL) yang berpengaruh terhadap sifat
mengeram.
Salah satu teknik yang dapat digunakan adalah karakterisasi terhadap gen
prolaktin (PRL). Blakely dan Bade (1991) menyatakan bahwa prolaktin
merupakan gen yang mengontrol sifat mengeram karena merupakan bagian
penting berfungsinya neuroendocrine yang menstimulir terjadinya peristiwa
mengeram. Terjadinya peristiwa mengeram ini karena promotor prolaktin
berfungsi mengaktifkan awal transkipsi ekspresi gen prolaktin. Jika terjadi mutasi
pada promotor prolaktin, gen prolaktin tidak dapat bekerja sehingga tidak terjadi
ekspresi mengeram (Sartika 2005).
Hal ini menunjukkan bahwa gen PRL merupakan gen utama yang
memiliki peran terhadap sifat mengeram sehingga dapat digunakan sebagai
penanda genetik dalam program seleksi ayam lokal Indonesia khususnya pada
ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul (legund) dan ayam arab. Hingga
saat ini data yang berhubungan dengan keragaman gen PRL pada ayam lokal
Indonesia masih terbatas, sehingga diperlukan penelitian ini untuk mengetahui
karakteristik dari gen PRL pada ayam lokal Indonesia.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi gen PRL pada ayam
kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab. Mengindentifikasi titik
mutasi pada gen prolaktin untuk dijadikan sebagai single nucleotide
polymorphism (SNP) baru.
2
Ruang Lingkup Penelitian
Ruang lingkup penelitian ini adalah analisis pada 20 ekor ayam yang
meliputi ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab.
Penerapan teknologi sekuensing DNA untuk menentukan karakteristik dan titik
mutasi pada fragmen gen prolaktin. Analisis data dilakukan dengan menggunakan
metode Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) nukleotida.
METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan April 2013.
Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian
Pemuliaan dan Genetika Ternak, Depertemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, IPB.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel darah ayam sebanyak 20 yang
terdiri dari ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab
(koleksi Maria Ulfah, SPt MScAgr, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor).
Gambar 1 Ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab
Bahan yang digunakan untuk ekstraksi DNA darah adalah sampel darah, air
destilata, 1 x STE (5M NaCl, 2M tris HCL, 0.2M EDTA), Sodium Dodesil Sulfat
(SDS) 10%, proteinase K (5mg/ml), phenol, Chloroform Isoamil Alkohol (CIAA),
NaCl 5M, EtOH absolut, buffer TE 80% (tris EDTA) dan tissue. Bahan yang
digunakan dalam amplifikasi DNA adalah sampel DNA, PCR buffer, MgCl2,
dNTP (Deoxy Nukleotida Triposfat), primer, Taq DNA Polymerase, air destilata
dan pasangan primer.
Primer yang akan digunakan dalam penelitian ini berdasarkan penelitian Cui
et al. (2006). Forward 5’AGAGGCAGCCCAGGCATTTTAC-3’ dan Reverse
5’CCTGGGTCTGGTTTGGAAATTG-3’dengan panjang produk PCR 439 pb.
Bahan yang digunakan untuk elekroforesis dengan agarose gel 1.5% adalah
larutan 0.5 x TBE (Tris-Borat EDTA) 30 ml, serbuk agarose 0.45 gram, EtBr 2.5
3
μl, sampel DNA hasil PCR, loading dye (0.01% Xylene Cyanol, 0.01%
Bromtimol Blue, 50% gliserol), dan marker 100 bp.
Alat
Peralatan yang digunakan untuk ekstraksi DNA dari darah ayam adalah
tabung Eppendorf 1.5 ml, satu set mikro pipet dan tip, gunting, vortex mixer
sentrifuge, rotary mixer, inkubator, refrigerator dan freezer. Alat-alat yang
digunakan dalam amplifikasi DNA adalah satu set micropippet dan tip, mesin
PCR thermocycler, sentrifuge, rak, vortex dan tabung eppendorf. Peralatan yang
digunakan untuk elektroforesis dengan agarose gel diantaranya satu set tray pencetak
gel, timbangan digital, power supply 100 volt, satu set micropippet dan tip, beaker
glass, microwave, stirrer, dan UV Transilluminator.
Prosedur Analisis Data
Secara umum tahapan prosedur penelitian mulai dari persiapan sampel
sampai analisis penelitian dapat digambarkan pada bagan di bawah ini:
Gambar 2 Tahapan proses penelitian
Ekstraksi DNA
Secara umum tahapan prosedur penelitian mulai dari persiapan sampel
sampai analisis penelitian dapat digambarkan pada bagan di bawah ini:
Gambar 3 Tahapan proses ekstraksi
4
Ekstraksi DNA yang dilakukan mengacu pada Sambrook et al. (1989)
yang dimodifikasi. Sampel darah sebanyak 100 µl ditambahkan dengan 1 000 µl
air destilata, kemudian disentrifugasi 8000 rpm selama lima menit hingga
terbentuk endapan. Endapan tersebut ditambahkan dengan 1 x STE sebanyak 300
µl, 40 µl 10% SDS dan 10 µl proteinase K 5mg/ml lalu diinkubasi pada suhu 55
ºC selama dua jam dan digoyang pelan. Setelah itu ditambahkan 400 µl phenol,
400 µl CIAA dan 40 µl NaCl 5M, kemudian digoyang pelan pada suhu ruang
selama satu jam.
Sampel kemudian disentrifugasi selama lima menit dengan kecepatan 12
000 rpm. Cairan bening pada lapisan atas dipindahkan ke tabung yang baru
sebanyak 400 µl dan ditambahkan dengan EtOH absolut sebanyak 800 µl dan
NaCl 5 M sebanyak 40 µl, kemudian dibekukan selama 12 jam. Sampel
kemudian disentrifugasi selama lima menit dengan kecepatan 12 000 rpm dan
akan terbentuk endapan putih. Endapan putih ditiriskan dan ditambahkan dengan
100 µl TE 80%.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi dilakukan pada sampel hasil ekstraksi. Sebanyak 1 µl sampel
hasil eksraksi dimasukkan ke dalam tabung PCR. Sampel ditambahkan dengan
premix yang terbuat dari campuran 28.7µl air destilata, 3.5 µl 10 x PCR buffer,
0.5 µl MgCl2, 0.2 µl enzim Taq polymerase, dan 0.5 µl dNTPs dan 0.6 µl.
Campuran DNA dan premix diinkubasi dengan mesin PCR thermocycler. Proses
amplifikasi terdiri dari tahapan pertama yaitu proses predenaturasi pada suhu 95
ºC selama 5 menit. Tahapan kedua yang terdiri dari 35 siklus yaitu denaturasi
pada 95 ºC selama 30 detik, annealing pada suhu 60 ºC selama 45 detik dan
pemanjangan awal (ektensi) pada suhu 72 ºC selama 1 menit. Tahapan terakhir
adalah pemanjangan primer (ekstensi akhir) pada suhu 72 ºC selama 5 menit.
Elektroforesis
DNA hasil amplifikasi dielelektroforesis menggunakan agarose gel dengan
konsentrasi 1.5%. Sebanyak 0.45 g serbuk agarose ditambahkan dengan 30 ml,
0.5 x TBE. Campuran tersebut dipanaskan di microwave selama 5 menit hingga
mendidih dan distirer agar uapnya hilang. Setelah itu, ditambahkan dengan 2.5 μl
EtBr, kemudian dicetak pada cetakan hingga mengeras. Kemudian, masingmasing sampel DNA hasil PCR diambil sebanyak 5 μl ditambahkan dengan 1 μl
loading dye dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur di dalam gel, kemudian
running pada larutan 0.5 x TBE dengan voltase 100 volt selama kurang lebih 30 45 menit. Setelah itu, diberi sinar UV pada UV Transilluminator sehingga pitapita DNA akan terlihat. Pita-pita DNA yang terlihat berarti sampel berhasil
diamplifikasi dan dapat digunakan untuk tahapan selanjutnya.
Perunutan Produk PCR (Sekuensing)
Sampel yang sudah teramplifikasi selanjutnya siap untuk disekuensing.
Sekuensing dilakukan di perusahaan jasa pelayanan sekuensing (1st Base) dengan
menggunakan mesin Applied Biosystem dengan menggunakan metode Sanger.
5
Analisis Data
Perunutan dan pensejajaran hasil sekuen dengan runutan baku dari
GenBank dilakukan dengan menggunakan program MEGA5 (Tamura et al. 2012).
Hasil sekuens fragmen gen prolaktin dianalisis kesamaannya dengan acuan
sekuens yang ada di GenBank menggunakan aplikasi Basic Local Aligment
Search Tool (BLAST) (Altchul et al. 1990) [www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/]. Jarak
genetik diukur dengan menggunakan analisis Pairwise Distance Calculation.
Pohon filogenetik dibentuk dengan metode Neighbor-joining dengan
menggunakan prinsip pengelompokan taksa berdasarkan nilai jarak evolusioner
pasangan-pasangan operational taxonomy unit dengan setiap percabangannya di
dalam pohon filogeni berevolusi pada kecepatan yang berbeda (Hartl 2000).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi Gen Prolaktin (PRL)
Gen prolaktin (PRL) pada ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul
dan ayam arab berhasil diamplifikasi pada suhu annealing 60 ºC selama 45 detik
dengan panjang fragmen gen 439 pb (Gambar 1).
Gambar 4 Hasil elektroforesis produk PCR fragmen gen prolaktin
(PRL) pada gel agarose 1.5% Keterangan: M=Marker
Persentase keberhasilan gen prolaktin teramplifikasi dalam penelitian ini
adalah 100% karena sebanyak 20 sampel yang terdiri dari 5 ayam kampung, 5
ayam walik, 4 ayam leher gudul dan 6 ayam arab berhasil diamplifikasi
semuanya. Viljoen et al. (2005) menyatakan bahwa keberhasilan dalam
amplifikasi DNA tergantung pada interaksi komponen PCR dalam konsentrasi
yang tepat seperti suhu annealing, konsentrasi Mg2+, konsentrasi primer dan
konsentrasi DNA target.
6
Karakteristik Gen Prolaktin
Homologi Gen Prolaktin
Hasil analisis homologi/kesamaan fragmen gen prolaktin dilakukan untuk
menunjukkan kesamaan sekuens DNA gen prolaktin yang diteliti dengan yang ada
di GenBank. Analisis kesamaan fragmen gen prolaktin dilakukan dengan
menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Tabel 1). Hasil
analisis menunjukkan bahwa fragmen gen prolaktin (PRL) yang diteliti memiliki
tingkat kesamaan 98%-99% dengan gen prolaktin (PRL) yang ada di GenBank.
Hal ini menunjukkan bahwa fragmen DNA yang dianalisis benar merupakan
fragmen DNA gen prolaktin.
Tabel 1 Hasil Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) gen prolaktin (PRL)
Kode Akses
AY588294
AY588301
AY588308
AY588315
Deskripsi
Gen Prolaktin dari G. gallus (White Leghorn)
Gen Prolaktin dari G. gallus (Yangshan)
Gen Prolaktin dari G. gallus (Taihe Silkies)
Gen Prolaktin dari G. gallus (White Recessive
Rocks)
Homologi (%)
99
98
98
98
Widayat dan Subositi (2010) menyatakan analisis BLAST memiliki cara
kerja yaitu membandingkan satu input sekuen dengan semua sekuen yang ada di
database GenBank dengan tujuan untuk memastikan bahwa sekuen yang dianalisis
adalah fragmen gen prolaktin (PRL).
Komposisi Basa Nukleotida Gen Prolaktin
Fragmen gen prolaktin (PRL) yang diteliti adalah daerah promotor dengan
panjang produk 439 pb. Komposisi basa nukleotida dari ayam kampung, ayam
walik, ayam leher gundul dan ayam arab relatif sama (Tabel 2).
Tabel 2 Rataan komposisi basa nukleotida sekuens fragmen gen prolaktin (PRL)
di promotor
Sampel
Jumlah Sampel
AY588301 (GB)
AY588308 (GB)
AY588294 (GB)
Ayam arab
Ayam leher gundul
Ayam kampung
Ayam walik
1
1
1
6
4
5
5
T(U)
32.5
32.5
32.5
32.7
32.6
32.7
32.6
C
20.2
20.1
20.4
20.4
20.4
20.1
20.3
Persentase (%)
A
G A+T C+G
29.0 18.3 61.5 38.5
29.2 18.2 61.7 38.3
29.0 18.1 61.5 38.5
29.1 17.8 61.8 38.2
29.0 18.0 61.6 38.4
29.0 18.1 61.8 38.2
29.3 17.8 61.9 38.1
Keterangan : GB = GenBank
Jumlah basa nukleotida A+T memiliki frekuensi yang lebih tinggi dari pada
basa nukleotida C+G karena sekuen yang diteliti merupakan daerah promotor gen
yang merupakan titik awal terjadinya proses transkripsi. Proses transkripsi
7
memerlukan utas tunggal sementara itu DNA memiliki utas ganda yang diikat
oleh ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen merupakan ikatan yang lemah sehingga
mudah dilepas dan mudah terbentuk kembali. Akibatnya, pasangan utas ganda
DNA mudah terurai menjadi utas tunggal, karena basa nukleotida A+T memiliki
dua ikatan hidrogen sedangkan G+C memiliki tiga ikatan hidrogen. Hal ini
menyebabkan A+T memiliki ikatan yang lebih lemah dari pada G+C sehingga
mudah diuraikan oleh enzim yang berperan dalam proses transkipsi (Yusuf 2001).
Deteksi Mutasi Gen Prolaktin
Sekuens fragmen gen
digunakan untuk melihat titik
fragmen sekuens gen prolaktin
delesi, insersi, perubahan basa
menjadi C (Tabel 3).
prolaktin (PRL) yang dianalisis juga dapat
mutasi. Hasil setelah dilakukan pensejajaran
ditemukan mutasi basa nukleotida yang bersifat
C menjadi T, G menjadi basa A, dan basa G
Tabel 3 Mutasi basa nukleotida pada fragmen gen prolaktin (PRL) di promotor
Posisi
Mutasi (pb)
29
63
94
162
256
298
301
316
367
372
403
Ayam
Lokal Cina
(GenBank)
G
C
Mutasi
Jenis Ayam
Ayam
Ayam
Ayam
Kampung Walik
Leher
Gundul
Ayam
Arab
─
─
─
─
C
C>T
C
T
G
G
A
T
G
G
A
T>C
G>A
G>A
A>G
C
C
T>C
G
G
A
A
G
C
G
A
G
C>T
G
A
G>A
C>T
G>C
A
G
C>T
G>C
A>C
G
C>T
G>C
─
─
─
Keterangan: acces number GenBank AY588301, ─ : delesi
─
T>C
G>A
G>A
A>G
Berdasarkan hasil penelitian ditemukan 11 titik mutasi dengan variasi
yang berbeda antara ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam
arab. Mutasi yang terjadi pada fragmen gen prolaktin termasuk ke dalam tipe
delesi, insersi, tranversi dan transisi. Mutasi tipe transisi yang terjadi yaitu
perubahan basa nukleotida T menjadi C, dan G menjadi A sedangkan mutasi tipe
tranversi yaitu perubahan basa nukleotida G menjadi C (Tabel 3). Mutasi transisi
terjadi karena adanya perubahan antara basa purin (adenin dan guanin) dengan
basa purin lainnya atau antara basa pirimidin (timin dan sitosin) dengan pirimidin
lainnya (Nei 1987). Mutasi tipe tranversi terjadi karena adanya perubahan antara
basa purin menjadi pirimidin. Yunita (2009) menyatakan mutasi tipe delesi
terjadi karena pasangan basa tertentu menghilang sehingga terjadi perubahan
susunan basa nukleotida. Hasil penelitian menunjukkan adanya delesi pada basa
8
G di posisi 29 dari produk PCR gen prolaktin. Mutasi tipe insersi terjadi karena
adanya penyisipan basa tertentu (Camphel et al. 2002). Ditemukan mutasi tipe
insersi spesifik pada ayam leher gundul di posisi 94 yaitu insersi basa C.
Ditemukan 7 titik mutasi yang tidak mengubah asam amino (silent
mutation) dan 4 titik mutasi yang menyebabkan terjadinya perubahan asam amino
(missense). Mutasi tipe delesi pada titik 29 menyebabkan terjadi perubahan asam
amino gliserin menjadi alanin. Mutasi tipe insersi basa C pada titik 94
menyebabkan perubahan asam amino alanin menjadi arginin. Mutasi transisi basa
T menjadi C pada titik 162 menyebabkan terjadinya perubahan asam amino valin
menjadi alanin. Mutasi tipe transversi basa G menjadi C pada titik 403
menyebabkan perubahan asam amino valin menjadi leusin.
Terjadinya perubahan ini menyebabkan perubahan fungsi gen. Noor
(2008) menyatakan bahwa jika suatu gen mengalami mutasi maka terjadi
perubahan kimia basa nukleotida yang mengakibatkan berubahnya fungsi gen.
Perubahan basa G menjadi A yang spesifik pada ayam walik dan ayam arab dan
lebih spesifik lagi pada ayam arab yang menyebabkan perubahan fungsi gen yang
spesifik pada ayam arab, karena secara fenotipe ayam arab tidak memiliki sifat
mengeram. Adanya mutasi ini memungkinkan hilangnya sifat mengeram pada
ayam arab. Hal ini menungkinkan bahwa gen prolaktin (PRL) dapat dijadikan
sebagai Single Nucleotide Polymorphism (SNP).
Kwok (2003) menyatakan bahwa Single Nucleotide Polymorphism (SNP)
umumnya merupakan perbedaan basa tunggal DNA antar individu. Pendeteksian
perbedaan basa ini terjadi pada penyisipan/penghilangan satu atau beberapa basa.
Hasil titik mutasi ini dapat dijadikan SNP tapi harus dibuktikan lagi dengan
melakukan pengujian polimorfik. Salah satu dapat dilakukan dengan melakukan
pengujian dengan enzim yang dikenal dengan teknik PCR-RFLP (Polymerase
Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism). Tujuannya agar
diketahui keragaman gen PRL sehingga dapat digunakan sebagai Marker Assited
Selection (MAS) yaitu dapat dimanfaatkan dalam program pemuliaan sebagai gen
kandidat untuk seleksi dalam menghasilkan ayam petelur yang unggul.
Jarak Genetik dan Pohon Filogenetik Sekuens Fragmen Gen Prolaktin
Analisis jarak genetik bertujuan untuk menunjukkan seberapa besar
perbedaan genetik antara dua haplotipe yang berbeda (Wisesa et al. 2012 ).
Berdasarkan hasil analisis yang dilakukan pada fragmen gen prolaktin didapat
jarak genetik terendah adalah 0.000 dan yang tertinggi adalah 0.005 (Tabel 4).
Matrik jarak genetik menunjukkan bahwa semakin besar nilai jarak genetik,
semakin besar perbedaan basa nukleotidanya sehingga semakin jauh pula
hubungan kekerabatannya.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ayam yang diteliti terdapat pada
kelompok yang sama, kecuali ayam walik 5 yang memiliki jarak genetik yang
berbeda. Hal ini karena perbedaan jenis ayam walik yaitu ayam walik 5
merupakan ayam ketawa yang memiliki bulu yang terbalik. Jarak genetik ayam
yang diteliti juga dibandingkan dengan jarak genetik White Leghorn, White
Recessive Rock, Yangshan, Taihe Silkies yang diakses melalui GenBank. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa ayam lokal yang diteliti memiliki jarak genetik
yang sama dengan ayam White Leghorn, White Recessive Rock, Yangshan, Taihe
Silkies.
9
Tabel 4 Jarak genetik fragmen gen prolaktin (daerah promotor) pada ayam lokal Indonesia
10
Pohon filogeni merupakan salah satu metode yang digunakan untuk
mengetahui keanekaragaman makhluk hidup melalui rekonstruksi hubungan
kekerabatan. Konsep filogeni adalah mengelompokkan organisme yang memiliki
kesamaan karakter yang dianggap memiliki hubungan yang dekat yang diturunkan
dari nenek moyangnya (Pradipta 2012).
Gambar 5 Hasil rekonstruksi pohon filogenetik dengan metode Neighbor Joining
berdasarkan fragmen gen prolaktin (PRL)
Berdasarkan fragmen gen prolaktin sepanjang 439 pb didapat hasil
rekonstruksi pohon filogenetik ke dalam 2 kelompok. Yangshan (AY588301),
Taihe Silkies (AY588308), White Leghorn (AY588294), White Recessive Rocks
(AY588315), ayam yang diteliti terletak pada kelompok yang sama kecuali ayam
walik 5 yang terpisah (Gambar 2). Hal ini karena perbedaan jenis ayam walik
yang diteliti yaitu ayam walik 5 merupakan ayam ketawa yang memiliki bulu
yang terbalik. Adanya perbedaan kelompok ini menunjukkan bahwa ayam walik
5 masih tergolong ayam ketawa yang memiliki rumpun yang berbeda dengan
ayam lainnya yang diteliti. Hasil rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan
fragmen gen prolaktin sepanjang 439 pb ini memiliki tingkat keseragaman yang
11
tinggi antar individu yang diteliti sehingga kurang tepat digunakan sebagai
penanda untuk membedakan ayam yang diteliti.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Penelitian karakterisasi gen prolaktin (PRL) dilakukan pada ayam kampung,
ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab dengan panjang fragmen gen
prolaktin 439 pb yang terletak pada promotor. Fragmen gen prolaktin (PRL) yang
diteliti memiliki tingkat kesamaan 98%-99% dengan fragmen gen prolaktin yang
ada di GenBank dan ditemukan 11 titik mutasi. Tipe mutasi yang ditemukan
meliputi delesi, insersi, transversi dan transisi yang memiliki variasi pada masingmasing ayam serta spesifik pada ayam walik dan ayam arab. Titik mutasi ini
berpotensi untuk dijadikan sebagai Single Nucleotida Polymorphism (SNP).
Saran
Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk polimorfisme gen prolaktin (PRL)
pada ayam kampung, ayam walik, ayam leher gundul dan ayam arab sesuai
dengan mutasi yang telah ditemukan, sehingga dapat dimanfaatkan sebagai
Marker Assited Selection (MAS) dan diperlukan penelitian pada daerah fragmen
ekson dan intron yang lainnya gen prolaktin (PRL).
DAFTAR PUSTAKA
Altchul SF, Gish W, Miller W, Mayers EW, Lipman DJ. 1997. Basic local
alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.
Blakely J, Bade DH. 1991. Ilmu Peternakan. Edisi Ke-4. Yogyakarta (ID): Gadjah
Mada University Pr.
Camphel AN, Jane RB, Lawrence MG. 2002. Biology. Fifth Edition: England
(GB). Benjamin Cummings.
Cui JX, Du HL, Liang Y, Deny XM, Li N, Zhany XQ. 2006. Association of
polymorphism in the promoter region of chicken prolactin with age
production. Poult. Sc. 85: 26-31.
[DPKH] Direktorat Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan. 2012. Statistik
Peternakan dan Kesehatan Hewan 2012. Jakarta (ID): Direktoral Jendral
Peternakan dan Kesehatan Hewan.
Harlt DL. 2000. A Primer of Population Genetic. 3rd ed. Sunderland (GB):
Sinauer Association.
Kwok PY. 2003. Single Nucleotide Polymorphism Method and Protocols. New
Jersey (US): Humana Press Inc.
Nei M. 1987. Moleculer Evolutionary Genetics. New York (US): Culumbia
University Pr.
Noor RR. 2008. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya.
12
Pradipta Y. 2012. Studi molekuler untuk menentukan kekerabatan genus zingiber
varietas zerumbet [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Moleculer Cloning: Laboratory
Manual. USA (US): CSH Laboratory Pr.
Sartika T. 2005. Peningkatan mutu bibit ayam kampong melalui seleksi dan
pengkajian penggunaan penanda genetik promoter prolaktin dalam
MAS/Market Assisted Selection untuk mempercepat proses seleksi
[disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Sulandari S, Zein MSA, Sri P, Sartika T, Maria A, Widjastuti T, Sujana E,
Darana S, Setiawan I, Garnida D 2007. Sumberdaya genetik ayam lokal
Indonesia. Dalam buku Keragaman Sumber Daya Hayati Ayam Lokal
Indonesia: Manfaat dan Potensi. Pusat Penelitian Biologi. Bogor (ID): LIPI
Press.
Tamura K, Kumar S. 2012. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis
Software. Arizona (US): Arizona State University.
Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnostic PCR Handbook.
Netherland (NT): Springer.
Widayat T, Subositi D. 2010. Kekerabatan filogenik buah Makassar (Brucea
javanica) berdasarkan gen ribulosa-1,5-bifosfat karboksilase/oksidase
[makalah]. Jakarta (ID). Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbangkes, Departemen
Kesehatan.
Wisesa DGNA, Pemayun OGT, Mahardika IGNK. 2012. Analisis sekuens DLoop DNA mitokontria sapi Bali dan banteng dibandingkan dengan bangsa
sapi lain di dunia. Indonesia Med. Ver. 1 (2): 281-292.
Yunita R. 2009. Pemanfaatan variasi somaklonal dan seleksi in vitro dalam
perakitan tanaman toleran cekaman abiotik. J. Litbang Pertanian. 28(4),
2009.
Yusuf M. 2001. Genetika 1: Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta (ID): CV Sagung
Seto.
13
LAMPIRAN
Lampiran 1 Hasil pensejajaran sekuen gen prolaktin (promotor) dengan GenBank
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
------------------TTACCTCCTGGCCTTTGTGAATGCCTTCCTTTGTTATCTAATCTCTGATATTAATGAAAACTGTGTTTTATTTTG-GCACTA
------------------...........................................................................-......
------------------...........................................................................-......
------------------...........................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................C......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
TGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCAGCCCAGGCATT..........-................................................................-......
AGAGGCCAGGCCCAGGTT..........-.................................T..............................-......
14
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
CTTATCAACTCCTCAAAATGACAAGAATAGCAAAGTAGTAAATGAAAGAGCAAATGATGAGTTGAGAAATGTCGTTCCTTTTTTTCACAGGACTCCTCTA
.............................................................Y......................................
.............................................................C......................................
.............................................................Y......................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.............................................................C......................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.............................................................Y......................................
.............................................................C......................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
ACGTTATAAGACACAAGGATTTTTCAGTCTTACCTGTAATATCTTGGATGGAGAAGATGAATTAAATCAAGAGCACAAACCATGTATGTGTGATTTAGAA
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.................................................................................................A..
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................R.........................................R..
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
15
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.................................................................................................A..
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................A.........................................A..
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
GACAGCTATCTTTCCACCATCCATTCTAGTGTTTTGGCTGTGGCCCTGTTCTTAGTGCCTTGATCAGATTACACTTATCTCAGCTGGAGGCAACTACTTC
.......................................................................Y............................
.......................................................................T............................
.......................................................................Y............................
A..............M.......................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
R......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
.......................................................................T............................
....................................................................................................
....................................................................................................
A.................................................................A.................................
16
AY588301_Yangshan
AY588308_Taihe_Silkies
AY588294_White_Leghorn
AY588315_White_Recessive_Rocks
Ayam_Arab_1
Ayam_Arab_2
Ayam_Arab_3
Ayam_Arab_4
Ayam_Arab_5
Ayam_Arab_6
Ayam_Legund_1
Ayam_Legund_2
Ayam_Legund_3
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
410
420
430
440
....|....|....|....|....|....|....|....|
GTGTACTCAGTAAGGCCTCAATTTCCAAAGCAGACCCAGG
..S.....................................
..C.....................................
..S..........................S..........
..C.....................................
........................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
Ayam_Legund_4
Ayam_Kampung_1
Ayam_Kampung_2
Ayam_Kampung_3
Ayam_Kampung_4
Ayam_Kampung_5
Ayam_Walik_1
Ayam_Walik_2
Ayam_Walik_3
Ayam_walik_4
Ayam_Walik_5
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
........................................
..C.....................................
..C.....................................
........................................
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Koto Malintang, Sumatera Barat pada tanggal 24
Februari 1991 dari ayah Erizal dan ibu Nur Asnini. Penulis adalah putri pertama
dari dua bersaudara. Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Lareh Sago
Halaban dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian
Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) dan diterima di
Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis dipercaya menjadi asisten praktikum
Teknologi Pengolahan Telur dan Daging Unggas pada tahun ajaran 2012/2013.
Penulis juga aktif di Himpunan Mahasiswa Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan (HIMAPROTER). Penulis juga aktif dalam dunia jurnalistik sebagai
staff marketing majalah pangan dan gizi EMULSI. Penulis juga pernah terlibat
dalam berbagai kepanitian semasa kuliah. Penulis juga aktif mengikuti lomba
karya tulis ilmiah. Diantaranya penulis meraih Medali Perak dalam Pekan Ilmiah
Mahasiswa Nasional (PIMNAS XXV) di Yogyakarta dalam Program Kreativitas
Mahasiswa di Bidang Penelitian tahun 2012. Program magang yang diikuti
penulis yaitu di PT. D-Farm Agriprima. Penulis juga dipercaya menjadi penyaji
materi Penulisan Proposal PKM dalam kajian P4 FORCES IPB pada tahun 2012.