Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan

37 agarose dan 10 10x MOPS Memelink et al. 1994. RNA diisolasi berdasarkan Chomczynski dan Sacchi 1987 menggunakan bufer ekstraksi yang terdiri dari 4 M guanidium thiosianat, 20 mM sodium sitrat, 0.5 sarkosyl, 0.1 M β- mercaptoethanol. Total RNA sebanyak 10 μg dari bibit padi berdaun empat dipakai untuk tiap sumur. Hibridisasi untuk Northern blot dilakukan berdasarkan Memelink et al. 1994. Berdasarkan analisis Northern dipilih salah satu gen HD- Zip padi yang memperlihatkan respon terhadap cekaman kekeringan untuk tujuan karakterisasi. Beberapa gen seperti salT dan Oshsp16.9 dipakai untuk mengontrol kondisisebagai kontrol cekaman yang diberikan. Gen salT terekspresi kuat pada saat cekaman osmosis seperti kekeringan, salinitas, dan ABA Claes et al. 1990. Gen salT merupakan gen ideal yang dapat dipakai sebagai kontrol untuk mengontrol pemberian kekeringan pada tanaman padi. Gen Oshsp16.9 terinduksi kuat pada saat cekaman kejut-panas . selanjutnya dipilih untuk mengontrol proses cekaman kejut-panas yang diberikan.

3.1.2 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan

Berdasarkan penapisan gen-gen HD-Zip tanaman padi, dipilih satu gen HD- Zip yang memperlihatkan respons terhadap kekeringan yaitu gen Oshox4 sebagai gen yang akan dikarakterisasi. Urutan asam amino protein Oshox4 disejajarkan dengan protein Antp dan bZip untuk mendapatkan gambaran kesamaan urutan nukleotida dengan protein homeobox dan daerah motif leusin zipper. Selanjutnya karakterisasi gen dilakukan dengan membuat padi transgenik dari padi kultivar Nipponbare dan ArabidopsisA. thaliana melalui tiga buah pendekatan yaitu analisis peningkatan, penurunan, dan pola ekspresi gen Oshox4. A Meningkatkan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif dari 35S CaMV A.1 Konstruksi gen 35S- Oshox4 Untuk meningkatkan ekspresi gen Oshox4 maka promoter dari gen Oshox4 disubstitusi dengan promoter dari 35S-CaMV Gambar 11 sesuai dengan prosedur yang didiskripsikan oleh Sambrook dan Russel 2001 , yang selanjutnya Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic 38 disebut 35S-Oshox4. Promoter 35S dari CaMV difusikan dengan cDNA dari gen yang dianalisis Oshox4. Poly-A dari 35S digunakan sebagai terminator. Fragmen cDNA Oshox4 dari pSKBlueScript disisipkan pada sisi KpnIEcoRI vektor pRT104 yang mengandung promoter 35S ganda dan polyA dari 35S sebagai terminator. Cassette lengkap 35S ganda-Oshox4-polyA 35S disisipkan pada vektor biner pC1300 pada sisi HindIII. Manipulasi atau penggandaan plasmid biner pC1300 dilakukan dengan memasukkan plasmid ke dalam bakteri E.coli strain DH5 α. Plasmid diintroduksi pada E. coli yang kompeten dengan menggunakan cara kejut panas seperti dijelaskan dalam Sambrook dan Russel 2001. Bakteri E.coli dikulturkan sampai mencapai OD 600 = 0.3-0.4 pada media LB cair. Suspensi bakteri diendapkan dengan sentrifugasi dan diresuspensi pada 50 mM CaCl 2 seperdelapan volume awal. Suspensi bakteri pada 50mM CaCl 2 disentrifugasi dan endapan sel bakteri diresuspensi pada 50mM CaCl 2 mengandung 15 gliserol seperduapuluh-lima volume awal. Sebanyak 200 μl sel suspensi bakteri dipakai untuk proses transformasi plasmid ke dalam bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens . Plasmid dimasukkan ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 untuk transformasi tanaman padi dan LBA1115 untuk transformasi tanaman ArabidopsisA. thaliana dengan menggunakan metode tri-parental mating . E. coli strain pRK2013 digunakan sebagai helper untuk memindahkan vektor biner dari E. coli DH5 α  ke Agrobacterium A. tumefaciens LBA4404 dan LBA1115. Tiga kultur bakteri yang terdiri dari E.coli dengan plasmid biner, bakteri helper, dan Agrobacterium A. tumefaciens yang akan menjadi inang dicampurkan selama 16 jam pada suhu ruang. Campuran bakteri dikulturkan pada medium agar LB dengan antibiotik yang sesuai untuk plasmid rekombinan untuk mendapat koloni tunggal. Kultur bakteri diinkubasi pada suhu 28 o C selama tiga hari. Koloni tunggal mengandung plasmid rekombinan diverifikasi dengan menggunakan gel agarose elektroforesis. Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic 39 Gambar 11 Peta restriksi dari konstruksi untuk meningkatkan ekspresi gen Oshox 4, 35S-Oshox4. Oshox4: cDNA koordinat 1-1197, 35S terminator: polyA dari 35S. 2 x 35S promoter: promoter ganda yang terdiri dari dua buah promoter 35S. A.2 Transformasi 35S- Oshox4 ke tanaman padi dan ArabidopsisA. thaliana A.2.1 Transformasi 35S- Oshox4 ke tanaman padi Kultur Agrobacterium A. tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung konstruksi gen 35S-Oshox4 ditumbuhkan pada medium ko-kultivasi mengandung asetosiringon 100 mM sampai OD = 1. Populasi bakteri ini selanjutnya dipakai untuk proses transformasi. Transformasi T-DNA AgrobacteriumA. tumefaciens ke tanaman padi dilakukan melalui kalus embriogenik. Kalus embriogenik yang berasal dari skutelum diinduksi dengan memakai 2,4-D untuk merangsang pembentukan kalus direndam pada kultur bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens selama 15 menit pada suhu ruang. Kalus ditransfer ke medium padat dan diinkubasi selama 72 jam pada ruang gelap suhu 25 o C. Seleksi antibiotik dilakukan untuk membedakan antara tanaman transgenik dan non-transgenik dengan menggunakan antibiotik higromisin 50 mgl. Setelah dilakukan seleksi selama 2-3 minggu, tunas dan akar diinduksi dengan menempatkan kalus pada kondisi terang 12 jam dan gelap 12 jam pada medium regenerasi yang mengandung IAA indole acetic acid 0.5 mgL dan BAP 6-benzilaminopurin 3 mgL. Sebagai kontrol untuk melihat pengaruh insersi T-DNA pada tanaman padi dilakukan transformasi dengan konstruksi cassette DR5-GUS. Tanaman transgenik padi hasil transformasi yang mengandung ekspresi Oshox 4 yang berlebih dipakai untuk melihat pengaruh gen tersebut pada fenotipe padi. Padi transgenik ditumbuhkan dengan metode hidroponik menggunakan Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic 40 media hidroponik produk dari Luasa. Pengamatan dilakukan secara berkala berdasarkan periode perkembangan padi kontrol padi transgenik dengan plasmid kosong atau tanpa mengandung gen Oshox4. Benih tanaman padi transgenik T ditanam dan diamati kemampuan berkecambahnya generasi T 1 . Ekspresi gen Oshox 4 pada kedua tanaman padi transgenik perlakuan dan kontrol diverifikasi menggunakan analisis Northern yang dilakukan seperti pada prosedur sebelumnya hal 33 . Fenotipe padi transgenik overekspresi Oshox4 diamati dengan melihat pertumbuhan vegetatif dan generatif padi. Selanjutnya tanaman padi yang menunjukkan fenotipe overekspresi Oshox4 diisolasi jaringannya untuk analisis histologi lebih lanjut. Ukuran sel diukur menggunakan program ImageJ. Preparat disiapkan dengan mengawetkan jaringan pada plastik Histo-Technik Technovit 7100. Jaringan difiksasi pada 0.1 M bufer fosfat mengandung 2 gluteraldehida selama satu jam. Dehidrasi berturut-turut dilakukan menggunakan 70, 80, 90, 96, dan 10 alkohol selama satu jam pada suhu ruang. Imbibisi Technovit dilakukan dalam dua tahap dimulai dengan Technovit:alkohol = 1:1 dan dilanjutkan Technovit 100 selama masing-masing satu malam. Pemotongan dilakukan dengan pisau gelas sudut 45 o menggunakan mikrotom dari Leica. Pewarnaan kontras dilakukan dengan menggunakan 0.5 safranin. A.2.2 Transformasi 35S- Oshox4 ke ArabidopsisA. thaliana Tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana yang mengandung35S-Oshox4. dibuat untuk menguji potensi aplikasi Oshox4 dalam meningkatkan ketahanan saat cekaman kekeringan. Transformasi 35S-Oshox4 ke dalam tanaman Arabidopsis A. thaliana dilakukan seperti dijelaskan oleh Clough dan Bent 1998 yang telah dimodifikasi. Tanaman Arabidopsis A. thaliana ditumbuhkan pada kondisi 25 o C. Suspensi 5 ml bakteri AgrobacteriumA. tumefaciens mengandung plasmid rekombinan hasil kultur selama tiga hari pada 28 o C disentrifugasi. Pelet hasil sentrifugasi dilarutkan dalam 1 ml LB Sambrook Russel 2001 cair mengandung asetosiringon. Suspensi bakteri dioleskan pada bunga ArabidopsisA. thaliana yang belum mekar. Benih ArabidopsisA. thaliana diseleksi pada media MS Sambrook Russel 2001 setengah konsentrasi tanpa Formatted: Subscript Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic 41 sukrosa dan mengandung antibiotik higromisin 25 mgl. Untuk kontrol pengaruh insersi T-DNA pada Arabidopsis A. thaliana dilakukan transformasi konstruksi pC1300 yang akan menyisipkan T-DNA mengandung 35S-hph. . Tanaman transgenik selanjutnya dipindahkan ke rumah kaca dengan media tanam yang terdiri dari campuran tanah, kompos, dan pasir dengan komposisi 1:1:1 untuk menghasilkan benih. A.3. Uji kekeringan tanaman transgenik ArabidopsisA. thalaina 35S- Oshox4 Benih dari 10 tanaman transgenik independen ArabidopsisA. thaliana 35S- Oshox 4 dan 5 tanaman transgenik independen ArabidopsisA. thaliana 35S-hph kontrol diseleksi pada media MS setengah konsentrasi tanpa sukrosa mengandung antibiotik higromisin 25 mgl. Tanaman transgenik Arabidopsis A. thaliana dipindahkan dari medium agar MS ke medium tanah dengan kompisisi kompos:pasir = 1:1. Tanaman transgenik ditanam berdampingan dengan dua kali ulangan masing-masing ulangan terdiri dari 20 individu tanaman. Tanaman diaklimatisasi pada kondisi rumah kaca selama satu minggu. Perlakuan cekaman kekeringan diaplikasikan setelah pertumbuhan tanaman Arabidopsis A. thaliana cukup kuat untuk kondisi di lapang rumah kaca. Kelompok tanaman kontrol disiram air setiap hari. Sedangkan pada kelompok tanaman perlakuan, pemberian air dihentikan untuk memberikan pengaruh cekaman selama periode kekeringan 21 dan 30 hari Gambar 12. Pemberian air kembali dilakukan setelah tanaman mengalami kondisi kekeringan selama 21 hari dan 30 hari, ketikadimana tanaman sudah mulai menampakkan gejala layu permanen. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk memantau kondisi tanaman Arabidopsis A. thaliana yang mengalami kekeringan. Setelah periode 21 dan 30 hari kekeringan pengamatan dilakukan terhadap tingkat survival tanaman yaitu tanaman yang berhasil melewati periode kritis kondisi kekeringan dan menampakkan gejala pertumbuhan kembali. Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic 42 Gambar 12 Denah perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana 35S-Oshox4. X: tanaman transgenik. 20 Dua puluh tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana 35S-Oshox4 ditanam dalam satu buah pot. Dua buah kelompok tanaman dipakai dalam percobaan ini untuk tiap-tiap galur yang dipakai. B Menurunkan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi RNA interference B.1 Konstruksi vektor Pasangan basa sepanjang kira-kira 430 bp dari daerah pengkode ujung C protein HD-Zip Oshox4 diisolasi dengan menggunakan PCR polymerase chain reaction selanjutnya disebutSELANJUTNYA DISEBUT RNAi-Oshox4. PCR dilakukan dengan memakai cDNA Oshox4 dari pBlueScript sebagai cetakan template. Primer yang digunakan adalah primer forward dengan urutan basa CGCTCGAGGGATCCGGCGGCGGCGAGCTTCACGTCGGTG dan primer Formatted Table Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic 43 reverse GGGGAATTCAAGCTTTAGTGTTTTCCAACTCTCTCTCTCG. Kondisi PCR meliputi denaturasi awal 95 o C selama 2 menit yang dilakukan sebanyak satu kali. Kondisi 95 o C ini masih dipertahankan selama 0. 30 detikmenit untuk proses denaturasi secara sempurna. Penempelan primer pada cetakan dilakukan pada kondisi suhu 55 o C selama 0. 45 detikmenit, dan perpanjangan nukleotida dilakukan pada suhu 72 o C selama 1 menit60 detik . Proses PCR yang meliputi denaturasi, penempelan dan perpanjangan nukleotida dilakukan sebanyak 40 siklus. Perpanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 o C selama 420 detik7 menit. Produk PCR ini selanjutnya dibuat sebagai sense dan anti-sense pada vektor Hannibal. Konstruksi sense-intron-antisense dari vektor Hannibal Wesley et al. 2001 disisipkan pada vektor biner pC1300 Gambar 13 sesuai dengan Sambrook dan Russel 2001 untuk membuat RNAi-Oshox4. . Gambar 13 Konstruksi vektor untuk menurunkan ekspresi Oshox4. Produk PCR sebesar 400 bp disisipkan sebagai sense pada sisi XhoIEcoRI dan anti-sense pada sisi HindIIIBamHI pada vektor pHannibal. Cassette pHannibal SacIPstI selanjutnya disisipkan pada vektor biner pC1300 menjadi RNAi-Oshox4. OCS: oktopin sintase. B.2 Transformasi pC1300 yang mengandung sense-anti-sense ke tanaman padi Konstruksi vektor dalam plasmid biner digandakan dengan cara dimasukkan ke dalam E.coli strain DH5 α. Insersi plasmid, yang masih berada di dalam E. coli, Formatted: Portuguese Brazil Formatted: Portuguese Brazil Formatted: Portuguese Brazil 44 ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 dan LBA1115 dilakukan dengan metode tri-parental mating. Setelah itu AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 yang mengandung cC assette pHannibal SacIPstI ditransformasi ke dalam genom padi. Prosedur transformasi plasmid ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens dan transformasi AgrobacteriumA. tumefaciens ke tanaman padi sesuai dengan prosedur sebelumnya pada uji over ekspresi . B.3 Analisis penurunan ekspresi Oshox4 Verifikasi penurunan ekspresi gen Oshox4 dilakukan dengan analisis Northern seperti prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya hal 33 . Pengamatan fenotipe padi transgenik yang mengandung kontruksi sense-intron-antisense dilakukan pada tahap pertumbuhan vegetatif dan generatif. C Melihat pola ekspresi gen Oshox4 C.1 Konstruksi vektor pC1391Z mengandung fusi promoter Oshox4 dengan gen GUS Promoter Oshox4 diklon dengan ukuran kira-kira 2.5 kb ke arah hulu dari kodon awal termasuk ujung 5 yang tidak ditranslasikan menurut Sambrook dan Russel 2001 menggunakan PCR. Primer yang dipakai adalah primer forward GGTCTGTTTGGCAAAGCTTCAGTTC dan primer reverse GGCCATGGCGAGTTCTAGTAAAATTCAGT. DNA genomik padi kultivar Nipponbare dipakai sebagai cetakan. Kondisi PCR untuk proses denaturasi awal dibuat pada suhu 95 o C selama 5 300 detikmenit . Kondisi ini masih dipertahankan selama 0. 30 detik menit untuk denaturasi lebih lanjut. Penempelan primer pada cetakan dibuat pada suhu 55 o C selama 0. 45 detikmenit . Untuk perpanjangan nukleotida dilakukan pada suhu 72 o C selama 180 detik3 menit . Siklus PCR yang meliputi proses denaturasi, penempelan primer dan perpanjangan nukleotida diulang sebanyak 40 kali. Perpanjangan akhir dilakukan pada suhu 72 o C selama 420 detik7 menit . Produk PCR sebesar 2.5 kb diklon pada vektor TOPO Invitrogen. Sisipan produk PCR pada vektor TOPO dirunutkan di-sequencing memakai primer M13 Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Font: I talic Formatted: Swedish Sweden Formatted: Font: Not I talic, Swedish Sweden Formatted: Swedish Sweden Formatted: Swedish Sweden Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico 45 forward dan M13 reverse. Produk PCR 2.5 kb selanjutnya disisipkan pada vektor biner pC1391Z yang mengandung gen GUS pada situs HindIII dan NcoI Gambar 14 untuk selanjutnya disebut sebagai PO4. Insersi promoter dilakukan pada sisi Hind IIINcoI sesuai dengan Sambrook dan Russel 2001. Selanjutnya plasmid biner diperbanyak dengan memasukkan plasmid ke dalam bakteri E.coli strain DH5 α. Gambar 14 Konstruksi T-DNA pda vektor pC1391Z mengandung promoter Oshox 4, PO4. Promoter Oshox4 disisipkan pada sisi HindIIINcoI. mcs: multiple cloning site, hph: hygromisin fosfotransferase, nos ter: terminator dari nofalin sintase, GUS: gen glukuronidase, RB: batas kanan, LB: batas kiri. Produk PCR sebesar 2.5 kb diklon pada vektor TOPO Invitrogen. Sisipan produk PCR pada vektor TOPO dirunutkan di-sequencing memakai primer M13 forward dan M13 reverse. Produk PCR 2.5 kb selanjutnya disisipkan pada vektor biner pC1391Z yang mengandung gen GUS pada situs HindIII dan NcoI Gambar 14 untuk selanjutnya disebut sebagai PO4. Insersi promoter dilakukan pada sisi Hind IIINcoI sesuai dengan Sambrook dan Russel 2001. Selanjutnya plasmid biner diperbanyak dengan memasukkan plasmid ke dalam bakteri E.coli strain DH5 α. C.2 Penggandaan plasmid dan transformasi AgrobacteriumA. tumefaciens ke tanaman padi dan ArabidopsisA. thaliana Insersi plasmid setelah diperbanyak dalam bakteri E. coli ke dalam AgrobacteriumA. tumefaciens strain LBA4404 dan LBA1115 dilakukan dengan Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico 46 metode tri-parental mating , sesuai dengan prosedur yang telah dijelaskan sebelumnya . Strain AgrobacteriumA. tumefaciens LBA4404 dipakai untuk menginsersi T-DNA ke dalam genom padi sedangkan untuk transformasi pada Arabidopsis A. thaliana menggunakan strain LBA1115. Transformasi Agrobacterium A. tumefaciens ke genom padi dan Arabidopsis A. thaliana dilakukan seperti pada transformasi Agrobacterium A. tumefaciens pada uji over ekspresi hal 34 . C.3 Analisis ekspresi gen GUS Uji ekspresi gen GUS beta-D-glukuronidase dilakukan sesuai Jefferson 198 97 . Larutan bufer X-gluc diinfiltrasikan pada jaringan tanaman transgenik dengan vakum selama 5 menit dilanjutkan dengan inkubasi 37 o C. Reaksi dihentikan menggunakan asam asetat glasial dan etanol 70. Komposisi bufer X- gluc terdiri dari: 2 mM X-gluc, 0.5 mM potasium ferisianida, 10 mM NaEDTA, 0.1 Triton X-100, dan 0.1 mM sodium fosfat pH 7.7. Protein GUS akan bereaksi dengan substrat X-gluc membentuk warna biru. Pengamatan ekspresi gen GUS lebih lanjut dilakukan pada tingkat sel dengan cara membuat preparat. Preparat disiapkan dengan mengawetkan jaringan tanaman transgenik yang telah diberi substrat X-gluc pada plastik Histo-Technik Technovit 7100. Jaringan difiksasi pada 0.1 M bufer fosfat mengandung 2 gluteraldehida selama 1 jam. Dehidrasi berturut-turut dilakukan menggunakan 70, 80, 90, 96, dan 10 alkohol selama 1 jam pada suhu ruang. Imbibisi Technovit dilakukan dalam dua tahap dimulai dengan technovit:alkohol = 1:1 dan dilanjutkan Technovit 100 selama masing-masing satu malam. Pemotongan dilakukan dengan pisau gelas sudut 45 o menggunakan mikrotom dari Leica. Pewarnaan kontras dilakukan dengan menggunakan 0.5 safranin. C.4 Analisis ekspresi gen Oshox4 in silico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Font: I talic Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Font: I talic Formatted: Spanish Mexico Formatted: Font: I talic, Spanish Mexico Formatted: Font: I talic Formatted: Spanish Mexico Formatted: Spanish Mexico Formatted: Dutch Netherlands Formatted: Spanish Mexico 47 Untuk melihat ekspresi gen Oshox4 in silico dilakukan melalui program BLAST untuk EST expressed sequence tag berdasarkan tingkat homologi kesamaan nukleotida yang tinggi dengan Oshox4. Program BLAST dijalankan pada website NCBI dengan alamat situs:http:www.ncbi.nlm.nih.gov. Hasil pencarian dengan program BLAST selanjutnya dipakai untuk identifikasi kondisi ekspresi gen Oshox4 misalnya pada saat cekaman penyakit blas atau pada saat fase pertumbuhan tertentu dari padi. 48

3.2 Introduksi gen entC dan pmsB ke dalam tanaman padi