Karakterisasi Faktor Transkripsi HD-ZIP untuk Ketahanan Kekeringan dan Introduksi Gen-Gen Penyandi Lintasan Biosintesis Asam Salisilat untuk Ketahanan Penyakit Blas pada Tanaman Padi

i

KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK

KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI

LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN

PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI

SIGIT PURWANTOMO

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Departemen Biologi

PROGRAM STUDI BIOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

ii

Judul : KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP

UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI

Nama : SIGIT PURWANTOMO

NRP : P17600013

Program Studi : BIOLOGI

Disetujui, Komisi Pembimbing

Prof. Dr.Ir. Antonius Suwanto, M.Sc Ketua

Prof. Dr.Ir. Alex Hartana Anggota

Prof. Dr.Ir. Maggy T Suhartono Anggota

Dr.Ir. Inez H Slamet-Loedin Anggota

Diketahui Ketua Program Studi Biologi

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.Sc

iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa sehingga pada akhirnya penelitian dengan judul KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI dapat diselesaikan. Penelitian ini sebagian besar dibiayai oleh KNAW (Dutch Royal Academy of Sciences).

Sebagian disertasi ini telah diajukan pada jurnal Anales Bogoriense dengan judul “The expression of drought-repressed rice homeobox gene Oshox4 controls

reduction of cell size and cell number”. Di sampng itu, sebagian disertasi ini telah diajukan pula pada jurnal Plant Molecular Biology dengan judul “Annotation of the homeodomain-leucinezipper (HD-Zip) family I, II and III from rice and functional analysis of the HD-Zip family I member Oshox4.”

Pertama-tama saya mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. Bimbingan, saran, dan dorongan semangat selama saya melakukan studi program doktor ini tidak akan pernah sekalipun saya lupakan. Ucapan terima kasih saya tujukan untuk Bapak Prof. Dr. Ir. Alex Hartana yang telah memberikan dasar genetika kepada saya selama saya sekolah di IPB. Di samping itu, saran, kritikan, dan masukan dari Bapak telah memberi dorongan positif pada desertasi saya akan selalu diingat. Terima kasih saya ucapkan untuk Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono untuk waktu yang dicurahkan dalam memberi masukan pada desertasi saya. Saran Ibu untuk memberikan desertasi saya dibaca oleh orang lain di luar ilmu yang saya tekuni ini sangat membantu memperbaiki alur berpikir saya. Hal ini akan selalu saya ingat. Terima kasih saya tujukan kepada Ibu Dr. Ir. Inez H Slamet Loedin. Pengalaman saya bekerja dan usaha Ibu Inez untuk mendorong semangat belajar saya tidak cukup untuk digambarkan dalam kalimat ini. Ibu Inez telah memberikan dasar bagi saya untuk bekerja di laboratorium biologi molekuler dan mengenalkan saya kepada teman-teman peneliti di luar negeri. Semuanya ini senantiasa tidak akan hilang dari ingatan. Terima kasih kepada Bapak Dr. Dedy Duryadi Solihin atas dorongan semangat kepada saya. Ucapan terima saya tujukan untuk Ibu Dr. Utut Widiastuti, Bapak Dr. Sony Suharsono, dan Bapak Dr. M Jusuf, serta Bapak Dr. Sugiono Moeljopawiro untuk masukan dan kritik yang telah diberikan.

Pada kesempatan ini, saya mengucapkan terima kasih kepada Dr. Annemarie H Meijer yang telah memberi bimbingan selama saya bekerja di laboratorium Clusius di tahun pertama. Disiplin bekerja dan membaca yang ditanamkan tidak akan pernah saya lupakan. Kepada Dr. Pieter. BF Ouwerkerk saya mengucapkan terima kasih untuk teknik molekuler yang telah diberikan serta waktu yang dicurahkan membimbing saya di lab Clusius sejak tahun pertama dan sampai sekarang. Hampir semua teknik molekuler yang saya gunakan adalah berasal dari Pieter. Ini akan saya ingat selalu. Terima kasih saya ucapkan kepada Saskia Rueb yang telah memberikan pelajaran transformasi genetika padi. Ucapan terima kasih juga diucapkan kepada Enrico Scarpella yang telah berbagi teknik membuat preparat potongan padi. Terima kasih diucapkan lepada Marianne Verbenne yang telah dengan senang hati memberikan konstruksi asam salisilat asal bakteri kepada

iv

saya. Terima kasih ditujukan untuk Huub Loffler sebagai koordinator BIORIN KNAW yang telah memberikan dorongan kepada saya. Terima kasih saya ungkapkan untuk Andi Utama, Diah Retno, dan Ibu Sukendah untuk waktu yang diberikan dalam membaca disertasi saya ini dan sekaligus membantu proses editing. Usaha yang membantu saya mengedit pada disertasi ini akan selalu saya ingat dan tidak akan terlupakan. Akhirnya kepada teman-teman di Biotek LIPI dan di IPB yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu, saya mengucapkan terima kasih yang mendalam untuk semua yang telah diberikan selama saya menempuh S3 ini.

Pada desempatan ini, ucapan terima kasih saya ungkapkan kepada keluarga, Ibu-Bapak, Mamak, Mimi-Apa, Mbak Cici-Mas Gun, Iwit-Dewi, Uni, Teh Ina-A Iwan, Teh Ely-A Didi, Hendra-Ika, dan Dindin-Nia yang memberi banyak dorongan untuk saya selama belajar di Belanda dan IPB ini. Terima kasih untuk Aay, ucapan terima kasih tidak cukup hanya diungkapkan dalam dua kata “terima” dan “kasih”. Terima kasih untuk mendukung pilihan saya belajar S-3 di Leiden dan IPB.

Jakarta, 2007 Sigit Purwantomo

v

RIWAYAT HIDUP

Sigit Purwantomo dilahirkan di Jakarta, 10 April 1970. Menamatkan sekolah dasar dan menengah di Jakarta. Tahun 1988 diterima di IKIP Jakarta Jurusan Pendidikan Biologi. Tahun 1993 menyelesaikan pendidikan S-1 di IKIP Jakarta di bawah bimbingan Prof. Dr. Emo Kastama. Memulai pendidikan S-2 di Jurusan Biologi Universitas Indonesia pada tahun 1995 dan menyelesaikannya pada tahun 1997 dengan predikat cum laude. Penelitian S-2 dilakukan di Puslitbang Bioteknologi LIPI di bawah supervisi Dr. Usep Soetisna. Tahun 1997 bergabung dengan kelompok penelitian padi Puslit Bioteknologi di bawah supervisi Dr. Inez H Slamet-Loedin. Tahun 2001 semester genap terdaftar di Institut Pertanian Bogor. Tahun 2001-2003 bekerja di Clusius Lab, Leiden University, The Netherlands di bawah supervisi Dr. Annemarie H Meijer dan Dr. Pieter BF Ouwerkerk. Sampai sekarang bekerja di Kelompok Penelitian Padi, Lab Biologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong.

vi

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL viii

DAFTAR GAMBAR ix

DAFTAR SINGKATAN xiv

PENDAHULUAN

1 Latar belakang ……… 1

2 Tujuan dan manfaat penelitian ... 2.1 Tujuan penelitian ... 4

2.2 Manfaat penelitian ... 5

TINJAUAN PUSTAKA 1 Kekeringan 1.1 Budidaya padi dan kekeringan ... 7

1.2 Cekaman kekeringan: respon tanaman dan upaya rekayasa genetika untuk meningkatkan toleransi tanaman ... 10

1.3 Identifikasi gen potensial untuk padi tahan kering ... 17

2 HD-Zip (Homeodomain Leucine Zipper) ... 18

3 Asam salisilat 21 3.1 Asam salisilat pada tanaman ………. 22

3.2 Asam salisilat pada mikroorganisme ... 24

3.3 Sinyal dengan perantara asam salisilat ... 24

3.4 Introduksi gen-gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri ... 27

BAHAN DAN METODE 1 Waktu dan tempat penelitian ... 29

2 Bahan penelitian ... 29

3 Metodologi penelitian ... 31

3.1 Karakterisasi Gen HD-Zip padi responsif kekeringan ... 31

3.1.1 Penapisan HD-Zip yang merespon kekeringan ... 31

3.1.2 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan ... 33

A Meningkatkan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV ... 33

A.1 Konstruksi 35S-Oshox4 ... 33

A.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi dan Arabidopsis ... 34

A.2.1 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi ... 34

A.2.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke Arabidopsis ... 36

A.3 Uji kekeringan tanaman transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4 ... 36

B Menurunkan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi ... 37

B.1 Konstruksi vektor RNAi-Oshox4 ... 37

B.2 Transformasi RNAi-Oshox4 ke tanaman padi ………. 38

B.3 Analisis penurunan ekspresi Oshox4 ... 39

C Melihat pola ekspresi gen Oshox4 ... 39

C.1 Konstruksi vektor pC1391Z mengandung fusi promoter Oshox4 dengan gen GUS……….. 39

vii

C.2 Penggandaan plasmid dan transformasi

Agrobacterium ke tanaman padi dan Arabidopsis …... 40

C.3 Analisis ekspresi gen GUS ………... 40

C.4 Analisis ekspresi gen Oshox4 in silico ... 41

3.2 Introduksi gen-gen entC dan pmsB ke dalam tanaman padi .... 41

3.2.1 Konstruksi plasmid pC1300 yang mengandung gen entC dan pmsB ... 41 3.2.2 Transformasi konstruksi gen PSA ke tanaman padi Nipponbare ... 42

3.2.3 Analisis molekular ekspresi gen entC dan pmsB pada tanaman padi transgenik Nipponbare ... 43

3.2.4 Pengukuran asam salisilat dan asam salisilat glukosida ... 43

HASIL DAN PEMBAHASAN 1 Hasil penelitian karakterisasi gen HD-Zip 1.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman 45 1.2 Respon gen HD-Zip padi terhadap cekaman abiotik ……….. 45

1.3 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan ………. 51

1.4 Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV ……… 52

1.4.1 Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat ………. 52

1.4.2 Uji kekeringan pada tanaman Arabidopsis yang mengandung 35S- Oshox4 ………. 58

1.5 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4 59 1.6 Analisis pola ekspresi gen Oshox4 ………... 60

2 Hasil penelitian introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat ke tanaman padi 2.1 Analisis Northern gen hph ……… 62

2.2 Analisis Northern gen entC ……….. 62

2.3 Analisis Southern gen pmsB ………. 63

2.4 Kandungan asam salisilat ………. 64

3 Pembahasan 3.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman 65 3.2 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan ……….. 66

3.3 Introduksi gen-gen penyandi biosintesis asam salisilat asal bakteri ke dalam genom padi ……… 70

4 Pembahasan umum ……… 70

SIMPULAN DAN SARAN 1 Simpulan 74 2 Saran 74 DAFTAR PUSTAKA ………... 76

viii

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Target urutan nukleotida dari HD-Zip berupa

pseudopalindromic ... 20

2 Jenis kultivar padi yang dipakai dalam percobaan cekaman

abiotik ... 30 3 Jenis bakteri yang dipakai pada percobaan kloning dan

transformasi ... 30 4 Daftar plasmid yang digunakan pada konstruksi gen ……… 30

5 Perunut yang digunakan ……… 30

6 Distribusi gen-gen HD-Zip Famili I, II, dan III Oryzasativa …... 46

7 Respons sejumlah gen Oshox terhadap cekaman abiotik pada

tanaman padi ………. 49

8 Pencarian esxpressed sequence tag (EST) menggunakan cDNA

gen Oshox4 ……… 53

9 Ekspresi GUS pada tanaman transgenik pOshox4-GUS saat

terpapar cekaman kekeringan .………... 62 10 Kandungan asam salisilat pada padi transgenik ……… 65

ix

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Diagram alur penelitian karakterisasi gen regulator HD-Zip untuk ketahanan kekeringan dan introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis SA berasal dari bakteri untuk ketahanan penyakit blas.

Garis titik-titik merupakan tujuan jangka panjang. ... 6 2 Mekanisme toleransi kekeringan dan respon tanaman saat terpapar

kekeringan (Bartels & Sunkar 2004). Tanda panah menunjukkan arah pengaruh; kotak: bentuk respon sel; +: memberi pengaruh meningkatkan; -: memberi pengaruh menurunkan; ROS: spesies

oksigen reaktif. Kotak menggambarkan proses dalam sel. ... 9 3 Penerimaan dan respon sel saat terpapar cekaman kekeringan.

Kekeringan akan mengubah komposisi protein regulator atau fungsional sel untuk keperluan adaptasi sel (Yamaguchi-Shinozaki

et al. 1997). ... 11

4 Lintasan penghilangan ROS (spesies oksigen reaktif) pada tanaman (Mitler 2002). A. Siklus air-air. B. Siklus glutation-askorbat. C. Siklus glutation peroksidase (GPX). D. Katalase (CAT). PSI: fotosistem I; SOD: superoksida dismutase; MDA: monodihidroaskorbat; AsA: askorbat; tAPX: tilakoid APX; DHA dihidroaskorbat; MDAR: MDA reduktase; GSH: glutation; GSSG: glutation teroksidasi; DHAR: DHA reduktase; GR: glutation

reduktase. ... 13 5 Sistem dua komponen pada Escherichia coli dan Saccharomyces

serevisiae (Kultz & Burg 1998). Huruf miring menunjukkan gen

yang dipengaruhi. ... 15 6 Urutan asam amino dari protein homeodomain Drosophila

melanogasterantp (http://www.biosci.ki.se). Daerah dengan tanda

segitiga terbalik merupakan asam amino yang juga dimiliki oleh

gen yang mengandung homeobox lainnya. ... 19 7 Model struktur protein HD-Zip. A. Protein HD-Zip terdiri dari dua

motif. Motif HD berperan dalam pengikatan DNA pada ujung terminal N, sementara leucine zipper pada ujung terminal C

berfungsi untuk dimerisasi. B. Model struktur pengikatan HD-Zip

dengan DNA (http://w3.uniroma1.it/centricnr-can/edocs/ire1.htm). 19 8 Ringkasan biosintesis asam salisilat. Tanda panah memperlihatkan

alternatif sintesis asam salisilat pada tanaman. Tanda panah putus-putus merupakan sintesis asam salisilat pada mikroorganisme melalui konversi langsung asam korismat menjadi asam salisilat. Tanda panah dengan titik-titik adalah lintasan produk perantara yang dapat dipakai untuk mensintesis asam salisilat pada

mikroganisme. ……….………. 22

9 Ringkasan peran asam salisilat dalam mengaktifkan sejumlah gen dan protein.→: arah pengaruh; ┴ : arah yang dihambat; ↵: bentuk

x

10 Tahapan yang dilakukan dalam penelitian. Penelitian mempunyai dua bagian yang terdiri dari penggunaan HD-Zip (kotak) dan introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal

bakteri (segitiga) untuk pembuatan padi transgenik. ... 31 11 Peta restriksi dari konstruksi untuk meningkatkan ekspresi gen

Oshox4. 2 x 35S promoter: promoter ganda yang terdiri dari dua

buah promoter 35S, Oshox4: daerah cDNA Oshox4 pada koordinat

1-1197, 35S terminator: polyA dari 35S. ... 34 12 Denah perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik

Arabidopsis 35S-Oshox4. X: tanaman transgenik. 20 tanaman

transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4 ditanam dalam satu buah pot.

Dua buah kelompok tanaman dipakai dalam percobaan ini untuk

tiap-tiap galur yang dipakai. ... 37 13 Konstruksi vektor untuk menurunkan ekspresi Oshox4. Produk

PCR sebesar 400 bp disisipkan sebagai sense pada sisi XhoI/EcoRI

dan anti-sense pada sisi HindIII/BamHI pada vektor pHannibal. Cassette pHannibal SacI/PstI selanjutnya disisipkan pada vektor

biner pC1300. ………..………. 38

14 Konstruksi T-DNA pda vektor pC1391Z mengandung promoter

Oshox4. Promoter Oshox4 disisipkan pada sisi HindIII/NcoI. mcs: multiple cloning site, hph: hygromisin fosfotransferase, nos ter:

terminator dari nofalin sintase, GUS: gen glukuronidase, RB: batas

kanan, LB: batas kiri.………. 40

15 Peta restriksi dan konstruksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri. 35S: promoter 35S dari CaMV, ss: small subunit dari Rubisco, entC: gen penyandi isokorismat sintase dari E. Coli, pmsB: gen penyandi isokorismat piruvat liase dari

Pseudomonas fluorescens, PIT: terminator dari gen inhibitor

proteinasekentang, angka menunjukkan ukuran nukleotida apabila

dipotong dengan restriksi enzim tertentu. ... 42 16 Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan

menggunakan gen salT sebagai penanda. Tanda panah

menunjukkan terjadinya induksi gen salT pada tingkat transkripsi.

j: jam ………... 47

17 Transkripsi gen Oshsp16.9 Oryza sativa: perlakuan kejut-panas

diberikanselama 2 jam pada suhu 42oC menggunakan analisis Northern. NB: Nipponbare; TP: Taipei. NB: Nipponbare; TP:

Taipei; -: tanpa perlakuan kejut-panas; +: perlakuan kejut-panas... 47 18 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman

kejut panas. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perlakuan kejut-panas

42oC selama 2 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan. ………….. 48 19 Pola transkripsi HD-Zip Oshox19 pada cekaman kekeringan. Tanda

panah menunjukkan adanya induksi. ………. 48 20 Pola transkripsi HD-Zip Oshox6 pada saat terpapar kekeringan.

Tanda panah menunjukkan pola transkripsi terepresi. ……….. 48 21 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman

perendaman. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perendaman selama 4

i

KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK

KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI

LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN

PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI

SIGIT PURWANTOMO

Disertasi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada

Departemen Biologi

PROGRAM STUDI BIOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

ii

Judul : KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP

UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI

Nama : SIGIT PURWANTOMO

NRP : P17600013

Program Studi : BIOLOGI

Disetujui, Komisi Pembimbing

Prof. Dr.Ir. Antonius Suwanto, M.Sc Ketua

Prof. Dr.Ir. Alex Hartana Anggota

Prof. Dr.Ir. Maggy T Suhartono Anggota

Dr.Ir. Inez H Slamet-Loedin Anggota

Diketahui Ketua Program Studi Biologi

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, M.Sc

iii

KATA PENGANTAR

Puji syukur dipanjatkan kehadirat Allah SWT yang Maha Kuasa sehingga pada akhirnya penelitian dengan judul KARAKTERISASI FAKTOR TRANSKRIPSI HD-ZIP UNTUK KETAHANAN KEKERINGAN DAN INTRODUKSI GEN-GEN PENYANDI LINTASAN BIOSINTESIS ASAM SALISILAT UNTUK KETAHANAN PENYAKIT BLAS PADA TANAMAN PADI dapat diselesaikan. Penelitian ini sebagian besar dibiayai oleh KNAW (Dutch Royal Academy of Sciences).

Sebagian disertasi ini telah diajukan pada jurnal Anales Bogoriense dengan judul “The expression of drought-repressed rice homeobox gene Oshox4 controls

reduction of cell size and cell number”. Di sampng itu, sebagian disertasi ini telah diajukan pula pada jurnal Plant Molecular Biology dengan judul “Annotation of the homeodomain-leucinezipper (HD-Zip) family I, II and III from rice and functional analysis of the HD-Zip family I member Oshox4.”

Pertama-tama saya mengucapkan terima kasih yang mendalam kepada Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc. Bimbingan, saran, dan dorongan semangat selama saya melakukan studi program doktor ini tidak akan pernah sekalipun saya lupakan. Ucapan terima kasih saya tujukan untuk Bapak Prof. Dr. Ir. Alex Hartana yang telah memberikan dasar genetika kepada saya selama saya sekolah di IPB. Di samping itu, saran, kritikan, dan masukan dari Bapak telah memberi dorongan positif pada desertasi saya akan selalu diingat. Terima kasih saya ucapkan untuk Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T Suhartono untuk waktu yang dicurahkan dalam memberi masukan pada desertasi saya. Saran Ibu untuk memberikan desertasi saya dibaca oleh orang lain di luar ilmu yang saya tekuni ini sangat membantu memperbaiki alur berpikir saya. Hal ini akan selalu saya ingat. Terima kasih saya tujukan kepada Ibu Dr. Ir. Inez H Slamet Loedin. Pengalaman saya bekerja dan usaha Ibu Inez untuk mendorong semangat belajar saya tidak cukup untuk digambarkan dalam kalimat ini. Ibu Inez telah memberikan dasar bagi saya untuk bekerja di laboratorium biologi molekuler dan mengenalkan saya kepada teman-teman peneliti di luar negeri. Semuanya ini senantiasa tidak akan hilang dari ingatan. Terima kasih kepada Bapak Dr. Dedy Duryadi Solihin atas dorongan semangat kepada saya. Ucapan terima saya tujukan untuk Ibu Dr. Utut Widiastuti, Bapak Dr. Sony Suharsono, dan Bapak Dr. M Jusuf, serta Bapak Dr. Sugiono Moeljopawiro untuk masukan dan kritik yang telah diberikan.

Pada kesempatan ini, saya mengucapkan terima kasih kepada Dr. Annemarie H Meijer yang telah memberi bimbingan selama saya bekerja di laboratorium Clusius di tahun pertama. Disiplin bekerja dan membaca yang ditanamkan tidak akan pernah saya lupakan. Kepada Dr. Pieter. BF Ouwerkerk saya mengucapkan terima kasih untuk teknik molekuler yang telah diberikan serta waktu yang dicurahkan membimbing saya di lab Clusius sejak tahun pertama dan sampai sekarang. Hampir semua teknik molekuler yang saya gunakan adalah berasal dari Pieter. Ini akan saya ingat selalu. Terima kasih saya ucapkan kepada Saskia Rueb yang telah memberikan pelajaran transformasi genetika padi. Ucapan terima kasih juga diucapkan kepada Enrico Scarpella yang telah berbagi teknik membuat preparat potongan padi. Terima kasih diucapkan lepada Marianne Verbenne yang telah dengan senang hati memberikan konstruksi asam salisilat asal bakteri kepada

iv

saya. Terima kasih ditujukan untuk Huub Loffler sebagai koordinator BIORIN KNAW yang telah memberikan dorongan kepada saya. Terima kasih saya ungkapkan untuk Andi Utama, Diah Retno, dan Ibu Sukendah untuk waktu yang diberikan dalam membaca disertasi saya ini dan sekaligus membantu proses editing. Usaha yang membantu saya mengedit pada disertasi ini akan selalu saya ingat dan tidak akan terlupakan. Akhirnya kepada teman-teman di Biotek LIPI dan di IPB yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu, saya mengucapkan terima kasih yang mendalam untuk semua yang telah diberikan selama saya menempuh S3 ini.

Pada desempatan ini, ucapan terima kasih saya ungkapkan kepada keluarga, Ibu-Bapak, Mamak, Mimi-Apa, Mbak Cici-Mas Gun, Iwit-Dewi, Uni, Teh Ina-A Iwan, Teh Ely-A Didi, Hendra-Ika, dan Dindin-Nia yang memberi banyak dorongan untuk saya selama belajar di Belanda dan IPB ini. Terima kasih untuk Aay, ucapan terima kasih tidak cukup hanya diungkapkan dalam dua kata “terima” dan “kasih”. Terima kasih untuk mendukung pilihan saya belajar S-3 di Leiden dan IPB.

Jakarta, 2007 Sigit Purwantomo

v

RIWAYAT HIDUP

Sigit Purwantomo dilahirkan di Jakarta, 10 April 1970. Menamatkan sekolah dasar dan menengah di Jakarta. Tahun 1988 diterima di IKIP Jakarta Jurusan Pendidikan Biologi. Tahun 1993 menyelesaikan pendidikan S-1 di IKIP Jakarta di bawah bimbingan Prof. Dr. Emo Kastama. Memulai pendidikan S-2 di Jurusan Biologi Universitas Indonesia pada tahun 1995 dan menyelesaikannya pada tahun 1997 dengan predikat cum laude. Penelitian S-2 dilakukan di Puslitbang Bioteknologi LIPI di bawah supervisi Dr. Usep Soetisna. Tahun 1997 bergabung dengan kelompok penelitian padi Puslit Bioteknologi di bawah supervisi Dr. Inez H Slamet-Loedin. Tahun 2001 semester genap terdaftar di Institut Pertanian Bogor. Tahun 2001-2003 bekerja di Clusius Lab, Leiden University, The Netherlands di bawah supervisi Dr. Annemarie H Meijer dan Dr. Pieter BF Ouwerkerk. Sampai sekarang bekerja di Kelompok Penelitian Padi, Lab Biologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong.

vi

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL viii

DAFTAR GAMBAR ix

DAFTAR SINGKATAN xiv

PENDAHULUAN

1 Latar belakang ……… 1

2 Tujuan dan manfaat penelitian ... 2.1 Tujuan penelitian ... 4

2.2 Manfaat penelitian ... 5

TINJAUAN PUSTAKA 1 Kekeringan 1.1 Budidaya padi dan kekeringan ... 7

1.2 Cekaman kekeringan: respon tanaman dan upaya rekayasa genetika untuk meningkatkan toleransi tanaman ... 10

1.3 Identifikasi gen potensial untuk padi tahan kering ... 17

2 HD-Zip (Homeodomain Leucine Zipper) ... 18

3 Asam salisilat 21 3.1 Asam salisilat pada tanaman ………. 22

3.2 Asam salisilat pada mikroorganisme ... 24

3.3 Sinyal dengan perantara asam salisilat ... 24

3.4 Introduksi gen-gen penyandi lintasan asam salisilat asal bakteri ... 27

BAHAN DAN METODE 1 Waktu dan tempat penelitian ... 29

2 Bahan penelitian ... 29

3 Metodologi penelitian ... 31

3.1 Karakterisasi Gen HD-Zip padi responsif kekeringan ... 31

3.1.1 Penapisan HD-Zip yang merespon kekeringan ... 31

3.1.2 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan ... 33

A Meningkatkan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV ... 33

A.1 Konstruksi 35S-Oshox4 ... 33

A.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi dan Arabidopsis ... 34

A.2.1 Transformasi 35S-Oshox4 ke tanaman padi ... 34

A.2.2 Transformasi 35S-Oshox4 ke Arabidopsis ... 36

A.3 Uji kekeringan tanaman transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4 ... 36

B Menurunkan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi ... 37

B.1 Konstruksi vektor RNAi-Oshox4 ... 37

B.2 Transformasi RNAi-Oshox4 ke tanaman padi ………. 38

B.3 Analisis penurunan ekspresi Oshox4 ... 39

C Melihat pola ekspresi gen Oshox4 ... 39

C.1 Konstruksi vektor pC1391Z mengandung fusi promoter Oshox4 dengan gen GUS……….. 39

vii

C.2 Penggandaan plasmid dan transformasi

Agrobacterium ke tanaman padi dan Arabidopsis …... 40

C.3 Analisis ekspresi gen GUS ………... 40

C.4 Analisis ekspresi gen Oshox4 in silico ... 41

3.2 Introduksi gen-gen entC dan pmsB ke dalam tanaman padi .... 41

3.2.1 Konstruksi plasmid pC1300 yang mengandung gen entC dan pmsB ... 41 3.2.2 Transformasi konstruksi gen PSA ke tanaman padi Nipponbare ... 42

3.2.3 Analisis molekular ekspresi gen entC dan pmsB pada tanaman padi transgenik Nipponbare ... 43

3.2.4 Pengukuran asam salisilat dan asam salisilat glukosida ... 43

HASIL DAN PEMBAHASAN 1 Hasil penelitian karakterisasi gen HD-Zip 1.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman 45 1.2 Respon gen HD-Zip padi terhadap cekaman abiotik ……….. 45

1.3 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan ………. 51

1.4 Peningkatan ekspresi gen Oshox4 di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV ……… 52

1.4.1 Fenotipe tanaman padi dengan ekspresi gen Oshox4 yang meningkat ………. 52

1.4.2 Uji kekeringan pada tanaman Arabidopsis yang mengandung 35S- Oshox4 ………. 58

1.5 Penurunan ekspresi gen Oshox4 menggunakan RNAi-Oshox4 59 1.6 Analisis pola ekspresi gen Oshox4 ………... 60

2 Hasil penelitian introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat ke tanaman padi 2.1 Analisis Northern gen hph ……… 62

2.2 Analisis Northern gen entC ……….. 62

2.3 Analisis Southern gen pmsB ………. 63

2.4 Kandungan asam salisilat ………. 64

3 Pembahasan 3.1 Penapisan gen HD-Zip tanaman padi yang merespon cekaman 65 3.2 Karakterisasi gen HD-Zip yang responsif kekeringan ……….. 66

3.3 Introduksi gen-gen penyandi biosintesis asam salisilat asal bakteri ke dalam genom padi ……… 70

4 Pembahasan umum ……… 70

SIMPULAN DAN SARAN 1 Simpulan 74 2 Saran 74 DAFTAR PUSTAKA ………... 76

viii

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Target urutan nukleotida dari HD-Zip berupa

pseudopalindromic ... 20

2 Jenis kultivar padi yang dipakai dalam percobaan cekaman

abiotik ... 30 3 Jenis bakteri yang dipakai pada percobaan kloning dan

transformasi ... 30 4 Daftar plasmid yang digunakan pada konstruksi gen ……… 30

5 Perunut yang digunakan ……… 30

6 Distribusi gen-gen HD-Zip Famili I, II, dan III Oryzasativa …... 46

7 Respons sejumlah gen Oshox terhadap cekaman abiotik pada

tanaman padi ………. 49

8 Pencarian esxpressed sequence tag (EST) menggunakan cDNA

gen Oshox4 ……… 53

9 Ekspresi GUS pada tanaman transgenik pOshox4-GUS saat

terpapar cekaman kekeringan .………... 62 10 Kandungan asam salisilat pada padi transgenik ……… 65

ix

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Diagram alur penelitian karakterisasi gen regulator HD-Zip untuk ketahanan kekeringan dan introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis SA berasal dari bakteri untuk ketahanan penyakit blas.

Garis titik-titik merupakan tujuan jangka panjang. ... 6 2 Mekanisme toleransi kekeringan dan respon tanaman saat terpapar

kekeringan (Bartels & Sunkar 2004). Tanda panah menunjukkan arah pengaruh; kotak: bentuk respon sel; +: memberi pengaruh meningkatkan; -: memberi pengaruh menurunkan; ROS: spesies

oksigen reaktif. Kotak menggambarkan proses dalam sel. ... 9 3 Penerimaan dan respon sel saat terpapar cekaman kekeringan.

Kekeringan akan mengubah komposisi protein regulator atau fungsional sel untuk keperluan adaptasi sel (Yamaguchi-Shinozaki

et al. 1997). ... 11

4 Lintasan penghilangan ROS (spesies oksigen reaktif) pada tanaman (Mitler 2002). A. Siklus air-air. B. Siklus glutation-askorbat. C. Siklus glutation peroksidase (GPX). D. Katalase (CAT). PSI: fotosistem I; SOD: superoksida dismutase; MDA: monodihidroaskorbat; AsA: askorbat; tAPX: tilakoid APX; DHA dihidroaskorbat; MDAR: MDA reduktase; GSH: glutation; GSSG: glutation teroksidasi; DHAR: DHA reduktase; GR: glutation

reduktase. ... 13 5 Sistem dua komponen pada Escherichia coli dan Saccharomyces

serevisiae (Kultz & Burg 1998). Huruf miring menunjukkan gen

yang dipengaruhi. ... 15 6 Urutan asam amino dari protein homeodomain Drosophila

melanogasterantp (http://www.biosci.ki.se). Daerah dengan tanda

segitiga terbalik merupakan asam amino yang juga dimiliki oleh

gen yang mengandung homeobox lainnya. ... 19 7 Model struktur protein HD-Zip. A. Protein HD-Zip terdiri dari dua

motif. Motif HD berperan dalam pengikatan DNA pada ujung terminal N, sementara leucine zipper pada ujung terminal C

berfungsi untuk dimerisasi. B. Model struktur pengikatan HD-Zip

dengan DNA (http://w3.uniroma1.it/centricnr-can/edocs/ire1.htm). 19 8 Ringkasan biosintesis asam salisilat. Tanda panah memperlihatkan

alternatif sintesis asam salisilat pada tanaman. Tanda panah putus-putus merupakan sintesis asam salisilat pada mikroorganisme melalui konversi langsung asam korismat menjadi asam salisilat. Tanda panah dengan titik-titik adalah lintasan produk perantara yang dapat dipakai untuk mensintesis asam salisilat pada

mikroganisme. ……….………. 22

9 Ringkasan peran asam salisilat dalam mengaktifkan sejumlah gen dan protein.→: arah pengaruh; ┴ : arah yang dihambat; ↵: bentuk

x

10 Tahapan yang dilakukan dalam penelitian. Penelitian mempunyai dua bagian yang terdiri dari penggunaan HD-Zip (kotak) dan introduksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal

bakteri (segitiga) untuk pembuatan padi transgenik. ... 31 11 Peta restriksi dari konstruksi untuk meningkatkan ekspresi gen

Oshox4. 2 x 35S promoter: promoter ganda yang terdiri dari dua

buah promoter 35S, Oshox4: daerah cDNA Oshox4 pada koordinat

1-1197, 35S terminator: polyA dari 35S. ... 34 12 Denah perlakuan cekaman kekeringan pada tanaman transgenik

Arabidopsis 35S-Oshox4. X: tanaman transgenik. 20 tanaman

transgenik Arabidopsis 35S-Oshox4 ditanam dalam satu buah pot.

Dua buah kelompok tanaman dipakai dalam percobaan ini untuk

tiap-tiap galur yang dipakai. ... 37 13 Konstruksi vektor untuk menurunkan ekspresi Oshox4. Produk

PCR sebesar 400 bp disisipkan sebagai sense pada sisi XhoI/EcoRI

dan anti-sense pada sisi HindIII/BamHI pada vektor pHannibal. Cassette pHannibal SacI/PstI selanjutnya disisipkan pada vektor

biner pC1300. ………..………. 38

14 Konstruksi T-DNA pda vektor pC1391Z mengandung promoter

Oshox4. Promoter Oshox4 disisipkan pada sisi HindIII/NcoI. mcs: multiple cloning site, hph: hygromisin fosfotransferase, nos ter:

terminator dari nofalin sintase, GUS: gen glukuronidase, RB: batas

kanan, LB: batas kiri.………. 40

15 Peta restriksi dan konstruksi gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat asal bakteri. 35S: promoter 35S dari CaMV, ss: small subunit dari Rubisco, entC: gen penyandi isokorismat sintase dari E. Coli, pmsB: gen penyandi isokorismat piruvat liase dari

Pseudomonas fluorescens, PIT: terminator dari gen inhibitor

proteinasekentang, angka menunjukkan ukuran nukleotida apabila

dipotong dengan restriksi enzim tertentu. ... 42 16 Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan

menggunakan gen salT sebagai penanda. Tanda panah

menunjukkan terjadinya induksi gen salT pada tingkat transkripsi.

j: jam ………... 47

17 Transkripsi gen Oshsp16.9 Oryza sativa: perlakuan kejut-panas

diberikanselama 2 jam pada suhu 42oC menggunakan analisis Northern. NB: Nipponbare; TP: Taipei. NB: Nipponbare; TP:

Taipei; -: tanpa perlakuan kejut-panas; +: perlakuan kejut-panas... 47 18 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman

kejut panas. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perlakuan kejut-panas

42oC selama 2 jam, -: kontrol tanaman tanpa perlakuan. ………….. 48 19 Pola transkripsi HD-Zip Oshox19 pada cekaman kekeringan. Tanda

panah menunjukkan adanya induksi. ………. 48 20 Pola transkripsi HD-Zip Oshox6 pada saat terpapar kekeringan.

Tanda panah menunjukkan pola transkripsi terepresi. ……….. 48 21 Blot Northern gen Oshox3 tanaman padi saat terpapar cekaman

perendaman. NB: Nipponbare, TP: Taipei, +: perendaman selama 4

xi

22 Pola transkripsi HD-Zip Oshox23 pada cekaman kekeringan. …… 49

23 Pola transkripsi HD-Zip Oshox4 pada cekaman perendaman. Panah

memperlihatkan induksi pada perendaman. NB: Nipponbare;

Oshsp16.9: protein kejut panas Oryza sativa; perendaman selama 4

jam. ……… 50

24 Analisis Northern blot pada 5 kultivar padi pada saat kekeringan pada Oshox4. Tanda panah menunjukkan terjadinya represi gen

Oshox4 di tingkat transkripsi………. 50

25 Pola transkripsi HD-Zip Oshox4 pada cekaman kejut-panas. Panah

memperlihatkan represi pada kejut-panas. NB: Nipponbare;

Oshsp16.9: protein kejut panas Oryza sativa; kejut-panas pada

42oC selama 4 jam. ……….. 51

26 Skema pola ekson-intron Oshox4. Besarnya daerah ekson-intron

ditunjukkan oleh angka yang menunjukkan jumlah nukleotida. …. 51 27 Homeodomain dan motif leucine zipper pada Oshox4. (A) Urutan

asam amino daerah homeodomain Oshox4. Tiga heliks alfa

Antennapedia (Antp) dari Drosophila ditunjukkan dengan garis.

Residu protein yang umum dimiliki ditunjukkan dengan (Δ) warna hitam, sedangkan kesamaan Oshox4 dan Antp ditunjukkan dengan

tanda (-). (B) Urutan asam amino daerah leucine-zipper dari

Oshox4. Motif leucine yang berulang diperbandingkan dengan

basic leucine zipper (bZip) dari C/EBP mamalia yang ditunjukkan

dengan garis, sementara lokasi leusin diperlihatkan dengan tanda (L). (C) Homeodomain dan motif leucine zipperOshox4. Posisi

tiga heliks alfa dari homeodomain diletakkan pada kotak dan asam

amino leusin pada urutan asam amino protein. ………. 52 28 Fenotipe padi transgenik kultivar Nipponbare hasil transformasi

menggunakan konstruksi Oshox4 yang dikontrol oleh promoter

35S. A. Verifikasi Northern pada tanaman dengan ekspresi Oshox4

yang meningkat. B adalah kontrol tanaman mengandung konstruksi pDR5-GUS. C. Kelompok transgenik dengan tingkat Oshox4 yang

meningkat dengan fenotipe pertumbuhan vegetatif sedang, dan D.

fenotipe pertumbuhan vegetatif tereduksi berat. ……….. 54 29 Analisis panjang ruas batang. Daerah berwarna gelap pada A dan

B adalah 35S::Oshox4, sementara daerah berwarna putih pada A dan B adalah kontrol. C (sayatan transversal) dan D (sayatan longitudinal) pada ruas batang kontrol. E dan F adalah sayatan transversal dan longitudinal ruas batang padi transgenik yang mengandung konstruksi 35S-Oshox4. Anak panah menunjukkan

daerah sel yang diukur. Angka 1,2, dan 3 menunjukkan posisi ruas

batang yang diamati. ……… 55

30 Panjang daun bendera tanaman dengan Oshox4 yang berlebih. A.

Panjang daun bendera; B. Panjang sel longitudinal dari daun bendera. C. Sayatan longitudinal daun bendera kontrol. D Sayatan

xii

31 Fenotipe malai. A: Lemna/palea kontrol; B: Organ reproduksi kontrol; C: Polen kontrol (panah menunjukkan bentuk pollen normal). D: Lemna/palea 35S-Oshox4; E: Organ reproduksi

35S-Oshox4; F: Polen 35S-Oshox4 (panah menunjukkan bentuk polen

normal); G: Jumlah bunga yang dihasilkan tiap malai dan jumlah bunga yang tidak menjadi biji (hampa), 35S-Oshox4 ditandai

dengan warna abu-abu; H: Perbandingan panjang selubung daun dari daun bendera pada ruas batang pertama, ruas batang pertama ditandai dengan warna putih; I: perbandingan ukuran sumbu penikel, cabang primer dan sekunder, 35S-Oshox4 ditandai dengan

warna abu-abu……… 57

32 Fenotipe tanaman 35S-Oshox4 pada umur 2, 4, dan 10 bulan…….. 58

33 Pengujian ketahanan kekeringan Arabidopsis mengandung

35S-Oshox4 (AT1-10) dibanding kontrol (K-). ……… 59

34 Analisis Northern tanaman transgenik mengandung konstruksi RNAi menggunakan konstruksi Hannibal. A. Analisis Northern tanaman mengandung konstruksi PO4 dan T1 tanaman

35S-Oshox4. B. Analisis Northern tanaman transgenik Nipponbare

mengandung konstruksi RNAi-Oshox4. Angka atau kode

menunjukkan asal kalus. ……….. 60

35 Lokasi ekspresi gen GUS yang dikendalikan oleh promoter Oshox4

pada jaringan tanaman padi kultivar Nipponbare. A. Jaringan daun. B. Jaringan daun setelah diberikan perlakuan cekaman kekeringan 24 jam. C. Kecambah padi. D. Akar dengan potongan longitudinal. E. Akar dengan potongan transversal. F. Jaringan pembuluh pada daun. G. Lema dan palea. H. Potongan longitudinal benih padi. I. Embrio padi. V: jaringan pembuluh. SC: skutelum. PH: pembuluh

floem. ……….. 61

36 Northern blot dari tanaman padi mengandung konstruksi asam salisilat asal mikrob dengan menggunakan higromisin

fosfotransferase (hph) sebagai penanda. Angka menunjukkan

nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan

pemisahan kalus. ……….. 63

37 Northern blot menggunakan penanda entC pada tanaman padi

transgenik Nipponbare mengandung biosintesis asam salisilat asal bakteri. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus. Angka yang

tidak diikuti oleh kode huruf menunjukkan individu tanaman……. 63 38 Southern blot dari tanaman transgenik padi mengandung

konstruksi asam salisilat asal bakteri dengan menggunakan pmsB

sebagai pelacak. Angka menunjukkan nomor kalus dan huruf di

belakang nomer kalus yang menunjukkan pemisahan kalus. …... 64 39 Kandungan asam salisilat (SA) pada bibit padi berumur 2 minggu.

SA ditunjukkan dengan warna putih, sedangkan SAG ditunjukkan

xiii

40 Model hipotetik Oshox4. Ekspresi Oshox4 dikontrol oleh cekaman

lingkungan yang berakibat pada elongasi dan jumlah sel serta penundaan penuaan jaringan. -: merepresi; +: menginduksi; o: tidak mempengaruhi; →: arah pengaruh; --- : pengaruh tidak

langsung; titik-titik: pengaruh logis kekeringan. ……….. 69 41 Keterkaitan gen Oshox4 dan kandungan asam salisilat untuk

meningkatkan ketahanan padi terhadap kekeringan dan penyakit blas. ---: pengaruh Oshox4 dan asam salisilat dari tanaman; ….:

xiv

DAFTAR SINGKATAN

35S-hph: konstruksi gen resistensi antibiotik higromisin (higromisin

fosfotransferase) di bawah kendali promoter 35S dari CaMV

35S-Oshox4: konstruksi cDNA Oshox4 di bawah kontrol promoter 35S dari

CaMV

ABA: abscisic acid (asam absisat)

ABF: ABA binding factor

ABRE: ABA responsive element

Ac/Ds: elemen loncat association/dissociation dari jagung AP2: apetala2

AREB: ABA responsive element binding

as-1: activating sequence 1

AtHK1: Arabidopsis thaliana histidine kinase 1

BA: Asam benzoate

BA2H: Asam benzoat 2-hidroksilase

bZip: basic leucine zipper

CaM: kalmodulin

CBF: C-repeat/dehydration responsive element binding factor

CBL: calciuneurin B-like

CDPK: calcium dependent protein kinase

CE: coupling element

CIPK: CBL interacting protein kinase

cor15a: cold-regulated 15A

CRT: C-repeat

DNA: asam deoksiribonukleat

DR5-GUS konstruksi gen GUS yang dikontrol oleh promoter DR5 DRE: dehydration responsive element

DREB: dehydration responsive element binding EDTA: ethylene diamine tetracetic acid

Em1a: elemen respons ABA pada promoter gen Em (early methionine labelled polypeptide) dari gandum (Triticum aesticum) dengan

sekuens GACACGTGGC

Em1b: elemen respons ABA pada promoter gen Em (early methionine labelled polypeptide) dari gandum (Triticum aesticum)

CACACGTGCC

EmBP: DNA binding protein dari kelas b-Zip yang berikatan dengan gen Em

entC: gen penyandi isokorismat sintase dari Escherichia coli

EnvZ: osmosensor pada sistem dua komponen Escherichia coli

EREBP: ethylene responsive element binding protein FAO: Food and Agriculture Organization

GS: glukosil salisilat

GST: glutation S-transferase

GNT35: GST Nucotiana tabaccum

HD: homeodomain

xv

HD-GLABRA2: kelompok anggota homeodomain HD-knotted1: kelompok anggota homeodomain HD-Zip: homeodomain leucine zipper HOG1: high osmolarity glycerol 1

HOT(D): 13-hidroksi oktadekatri(di)enoik HPOT(D): 13-hidroksiperoksi-oktadekatri(di)enoik

HR: respon hipersensitif

HVA1: barley (Hordeum vulgare) aleuron LEA protein

ICS: isokorismat synthase

IPL: isokorismat piruvat liase

IRRI: International Rice Research Institute

JA: asam jasmonat

kn1: gen homeobox yang pertama kali diidentifikasi berasal dari tanaman (Zea mays)

KNOX: kelompok anggota homeodomain

LEA: late embryonic abundant

Lti78: low-temperature-induced LTRE: low temperature responsive element

MADS-box: faktor transkripsi pada perkembangan bunga MAPK: mitogen activated protein kinase

MAPKK: MAPK kinase

MAPKKK: MAPK kinase kinase

MSA: metil asam salisilat

nahG: gen penyandi salisilat hidroksilase pada Psudomonas putida

NHI1: NPR-homolog 1

NIM1: nama lain untuk NPR1 NPR1: non-expresser of PR genes 1

OmpR: regulator respons pada sistem dua komponen Escherichia coli

OSBZ8: Oryza sativa b-Zip padi yang terinduksi kuat oleh ABA

Oshox: Oryza sativa homeobox

OsZIP-1a: homolog EMBP1

otsA: penyandi biosintesis trehalose dari Escherichia coli

otsB: penyandi biosintesis trehalose dari Escherichia coli p5cs: pyrroline-5-carboxylate reductase

PCR: polymerase chain reaction

PHD-finger: plant homeodomain finger

pmsB: gen penyandi isokorismat piruvat liase dari Pseudomonas fluorescens

PO4 konstruksi promoter Oshox4 yang difusikan dengan gen GUS

PR: pathogenesis related protein

PR: pathogenesis related protein

rab18: responsive ABA 18

rd28A: responsive to dehydration

rd29A: responive dehydration29A

RNA: asam ribonukleat

RNAi: RNA interference

RNAi-Oshox4: konstruksi RNAi untuk menekan transkripsi gen Oshox4

xvi

SA GTase: UDP-glukosa SA glukosiltransferase

SA: salicylic acid

SABP: SA binding protein

sacB: gen penyandi fruktan dari Bacillus subtilis

SAG: SA 2-O-β-D-glukosida

SAR: systemic acquired resistance

SCOF-1: faktor transkripsi dari kedelai SDS: sodium dodecyl sulfate

sid1: SA-induced defence

SLN1: homolog OmpR pada sistem dua komponen Saccharomyces cereviseae

SNI1: suppressor of npr1 inducible

SSDB: sequence specific DNA-binding

SSK1: homolog OmpR pada sistem dua komponen Saccharomyces cereviseae

TAIL: thermal asymmetric interlaced TALE: 3-aa acid loop extension

T-DNA: utas nukleotida yang merupakan bagian dari sistem penginduksi tumor yang dimiliki oleh Agrobacterium

tumefaciens yang terintegrasi dalam genom tanaman

TF: faktor transkripsi

TGA: faktor transkripsi anggota dari bZIP

TMV: tobacco mosaic virus

Vahox1: HD-Zip tomat yang berperan dalam program cell death

WRKY: kelas faktor transkripsi yang ditandai dengan urutan asam amino WRKYGQK pada ujung N domain DNA-binding. YPD1: protein penyambung antara SLN1 dan SSK1

PENDAHULUAN

1 Latar belakang

Padi (Oryza sativa L.) merupakan salah satu tanaman pangan pokok

penting dunia yang dikonsumsi oleh sekitar tiga miliar penduduk dunia. Di Indonesia padi merupakan tanaman yang bernilai strategis karena lebih dari 50% dari total kalori penduduk Indonesia berasal dari padi (beras). Oleh karena itu Faktor tersebut yang menyebabkan padi dibudidayakan secara intensif baik melalui usaha intensifikasi maupun ekstensifikasi. Dua dari 23 spesies genus

Oryza yaitu Oryza O. sativa dan Oryza glaberrima merupakan spesies yang

dibudidayakan sejak lama (Ge et al. 1999). Di Indonesia, produksi padi

ditingkatkan dari tahun ke tahun, dari 1.76 ton/ha pada tahun 1961 menjadi 4.57 ton/ha pada tahun 2005. Sejumlah kultivar dari spesies ini telah dikembangkan pada lahan budidaya sawah antara lain melalui penggunaan IR36 pada tahun 1976, PB 42 dan Cisadane di tahun 1980, IR64 padasaat tahun 1985, dan Mamberamo pada tahun 1995.

Usaha intensifikasi dengan penggunaan kultivar-kultivar tersebut merupakan salah satu faktor yang mengantarkan Indonesia pada swasembada beras pada tahun 1984. Seiring dengan berjalannya waktu, usaha intensifikasi dengan kultivar terbatas, dandan luasan lahan sawah yang tetap tidak dapat memenuhi kebutuhan konsumsi beras di Indonesia yang terus meningkat. Konsumsi beras di Indonesia pada tahun 2000 mencapai 30.8 juta ton dan diprediksi pada tahun 2020 akan menjadi 42.3 juta ton. Dengan kondisi tersebut, Indonesia harus mengimpor beras untuk mencukupi kebutuhan beras nasional. Impor beras pada akhir 2005 telah mencapai 70 ribu ton (BPS 2005).. Jika produksi beras nasional konstan tiap tahun dan lahan pertanian sekitar 0.1 juta ha, maka untuk mencukupi kebutuhan beras tersebut diperlukan lahan baru sekitar 600 juta (BPS, 2005).

Pada saat ini lahan sawah sudah jenuh oleh sistem pertanaman yang sudah ada, sehingga upaya untuk meningkatkan produksi padi nasional sebaiknya diarahkan pada areal tanam di lahan-lahan marginal dengan sistem pertanian padi

padi lahan kering, gogo, dan gogorancah (perpaduan sistem gogo dan sawah). Masalahnya, lahan-lahan marginal yang ada biasanya mempunyai kendala dalam

Formatted: Different first page header

Formatted: Spanish (Mexico) Formatted: Spanish (Mexico)

2

ketersediaan air yang berpotensi untuk terpaparnya tanaman padi oleh kondisi kekeringan.

Kira-kira 90% budidaya padi dipengaruhi oleh kekeringan yn.ang dapat Terpaparnya padi oleh kondisi kekeringan bisa berakibat pada menurunnya

produktivitas. Untuk menjaga produktivitas padi di lahan-lahan tersebut perlu

dikembangkan kultivar yang beradaptasi dengan lahan kering dan

bermenghasilkan produksi tinggi. Pemuliaan konvensional dengan bantuan marka molekular atau melalui rekayasa genetika telah dikembangkan untuk mendapatkan varietas padi tahan kekeringan (O’toole 2004). Caranya adalah dengan mengintroduksi sifat tahan kering melalui protein fungsional dengan tujuan mengatur dan melindungi metabolisme sel padi serta mendetoksifikasi senyawa beracun selama tanaman padi tercekam terpapar kekeringan.

Pendekatan lain yang potensial untuk dikembangkan guna mendapatkan padi tahan kekeringan adalah dengan mengontrol gen protein regulator yaitu gen protein yang berperan dalam mengatur ekspresi protein gen fungsional. Dengan mengontrol gen protein regulator diharapkan dapat mengatur ekspresi sejumlah

gen protein fungsional atau regulator lain yang berada di bawah kendali gen protein regulator tersebut. Salah satu keluarga gen protein regulator yang hanya terdapat pada tanaman adalah gen yang mengkode protein homeodomain leucine zipper (HD-Zip). Protein HD-Zip dicirikan oleh adanya homeodomain yang berdampingan langsung dengan motif leusin zipper. yang berulang. Protein HD-Zip merupakan faktor transkripsi yang memiliki peran penting pada tanaman dalam merespon sinyal lingkungan (Schena et al. 1993), termasuk salah satunya

sinyal terhadap kekeringan.

Berkaitan dengan tanaman padi, sejumlah gen HD-Zip padi telah diidentifikasi (Meijer et al. 2000). Salah satu gen dari famili HD-Zip II padi, yaitu

gen Oshox1 diperkirakan berfungsi dalam perkembangan tanaman antara lain

sebagai penentu spesifikasi sel pada perkembangan jaringan pembuluh (Scarpella

et al. 2000; Scarpella et al. 2002). Walaupun demikian, respon gen-gen HD-Zip

padi pada saat mengalami cekaman abiotik, misal: kekeringan, belum pernah dievaluasi. Oleh sebab itu perlu dilakukan karakterisasi gGen HD-Zip padi yang

Formatted: Spanish (Mexico) Formatted: Spanish (Mexico) Formatted: Spanish (Mexico)

Formatted: I ndent: First line: 0,95 cm

3

memiliki potensi untuk dimanfaatkan pada program perbaikan genetik tanaman padi tahan kekeringan. Sampai saat ini belum pernah dilakukan kKarakterisasi dan analisis fungsional untuk memahami fungsi dari gen-gen famili HD-Zip.sampai saat ini belum pernah dilakukan. Untuk mengetahui fungsi gen dalam suatu tanaman dapat dipelajari melalui 3 metode yaitu dengan meningkatan tingkat ekspresinya (over expression), menghilangkan ekspresi (knockout), dan

mengidentifikasi pola ekspresi gen tersebut.

Meskipun metode kontrol protein regulator gen HD-Zip diharapkan dapat mengatasi akibat buruk yang ditimbulkan oleh kondisi kekeringan, namun dibutuhkan pendekatan lain untuk mengembangan sistem pertahanan tanaman padi pada saat terpapar kekeringan. Cekaman kekeringan mengakibatkan tanaman padi rentan terhadap cekaman lain termasuk cekaman biotik, misalnya penyakit blas. Kondisi tanah yang aerob, kekeringan, dan kandungan nitrogen yang tinggi

pada tanah merupakan kondisi ideal bagi berkembangnya Magnaporthe grisea.

Magnaporthe grisea merupakan cendawan yang menyebabkan bertanggung jawab pada munculnya penyakit blas. Penyakit blas menyerang sampai 12% dari luas

areal padi di Indonesia (Utami et al. 2005). Oleh sebab itu penyakit blas

merupakan penyakit penting pada areal pertanian padi sistem sawah dan gogo. Ketahanan tanaman padi terhadap penyakit blas, terutama pada saat kondisi kekeringan, dapat ditingkatkan melalui kontrol sinyal yang berperan dalam mekanisme pertahanan biotik seperti asam salisilat (SA). Hasil penelitian yang ada menunjukkan bahwa kandungan asam salisilat pada padi berkorelasi positif dengan ketahanan terhadap serangan blas (Silverman et al. 1995). Pada

tanaman dan mikroorganisme, asam salisilat atau produk perantaranya disintesis melalui beberapa lintasan metabolime. Asam salisilat dapat dibentuk melalui lintasan fenilalanin atau asam korismat. Lintasan biosintesis asam salisilat melalui isokorismat adalah lintasan penting untuk ketahanan tanaman terhadap cekaman biotik (Wildermuth et al. 2001). Jika produksi asam salisilat melalui isokorismat

dapat ditingkatkan maka diharapkan ketahanan tanaman padi dapat meningkat. Asam salisilat dapat diproduksi dengan mengubah asam korismat menjadi isokorismat oleh enzim isokorismat sintase yang selanjutnya dikonversi menjadi asam salisilat oleh enzim isokorismat piruvat liase.

Formatted: Swedish (Sweden)

Formatted: Swedish (Sweden)

4

Sejumlah mikroorganisme memiliki gen yang mengkode kedua enzim tersebut. Escherichia E. coli memiliki gen entC yang menyandi enzim

iso-korismat sintase sedangkan Pseudomonas fluorescens memiliki gen pmsB yang

menyandi iso-korismat piruvat liase. Masing-masing gen tersebut memerlukan promoter tanaman agar dapat terekspresi pada sel tanaman. Introduksi kedua gen tersebut ke dalam tembakau di bawah kendali promoter virus tanaman memperlihatkan peningkatan ketahanan terhadap penyakit pada tembakau transgenik (Verberne et al. 2000). Konstruksi gen yang menyandi kedua enzim ini

telah tersedia untuk penelitian, sehingga . Dengan demikian, gen-gen iso-korismat sintase dan iso-korismat piruvat liase dapat ditransformasikan ke dalam tanaman padi dan ekspresinya diharapkan dapat meningkatkan konsentrasitingkat asam salisilat pada tanaman padi. Tingkat asam salisilat yang tinggi diharapkan dapat menjadi pembatas terhadapcegah serangan penyakit blas pada padi.

2 Tujuan dan manfaat penelitian 2.1 Tujuan penelitian

Secara umum, tujuan penelitian ini adalah meningkatkan ketahanan tanaman padi terhadap kekeringan dan penyakit blas dengan menganalisis fungsi gen famili HD-Zip padi yang respon terhadap kondisi kekeringan dan

mengintroduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat untuk ketahanan terhadap penyakit blas. Perakitan tanaman padi yang tahan kekeringan dan penyakit blas diharapkan dapat membantu pengembangan penanaman padi dengan sistem lahan kering pada lahan marginal. Dampak dari perluasan penanaman padi di lahan-lahan marginal ini akan meningkatkan produksi beras nasional dan mengurangi jumlah impor beras.

Sedangkan tujuan khusus penelitian ini adalah untuk: (i)

mengkarakterisasi salah satu gen tanaman padi keluarga HD-Zip yang diketahui memperlihatkan respon saat padi tercekamterpapar kekeringan setelah dilakukan penapisan gen-gen HD-Zip padi yang merespon cekaman kekeringan; (ii)

mengintroduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yang berasal dari bakteri ke dalam genom tanaman padi.

Formatted: Font: Not Bold

5

Untuk merealisasikan tujuan tersebut dilakukan serangkaian percobaan

dilakukan yang meliputi: (1) penapisan gen HD-Zip yang merespon kekeringan, (2) peningkatkan ekspresi (overexpression) gen Oshox4 yang merupakan salah

satu gen HD-Zip di bawah kendali promoter konstitutif 35S dari CaMV, (3) penghilangan (knockout) atau penurunan (knockdown) ekspresi gen Oshox4

menggunakan RNAi, (4) studi pola ekspresi gen Oshox4, (5) transformasi

gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yaitu gen-gen entC dan gen pmsB ke

tanaman padi, (6) analisis integrasi dan ekspresi gen entC dan gen pmsB pada

level transkripsi dengan analisis Southern dan Northern, dan (7) analisis kandungan asam salisilat pada tanaman trangenik. Secara keseluruhan diagram alur penelitian disajikan pada Gambar 1.

2.2 Manfaat penelitian

Manfaat yang diperoleh dari hasil penelitian karakterisasi gen-gen famili HD-Zip terhadap cekaman kekeringan adalah tersedianya informasi tentang gen HD-Zip yang responsif terhadap cekaman kekeringan. Manfaat lebih jauh adalah diperoleh sumber gen yang dapat digunakan sebagai gen donor untuk merakit padi transgenik yang tahan kekeringan.

Hasil yang diperoleh dari penelitian introduksi gen-gen penyandi lintasan biosintesis asam salisilat yang berasal dari bakteri ke dalam genom tanaman padi adalah selain diperoleh tanaman transgenik padi dengan kandungan asam salisilat tinggi, juga menghasilkan tanaman padi transgenik yang tahan terhadap penyakit blas. Tanaman ini dapat dipakai untuk mengembangkan usaha ekstensifikasi tanaman padi pada lahan-lahan marginal yang biasanya mengalami kondisi kekeringan yang berakibat tanaman padi menjadi rentan terhadap penyakit blas.

7

TINJAUAN PUSTAKA

1 Kekeringan

1.1 Budidaya padi dan kekeringan

Tanaman padi telah dibudidayakan di berbagai kondisi lingkungan seperti sawah tadah hujan, air-dalam, pasang surut, ladang atau/ gogo, dan sawah irigasi (FAO 2004). Tanaman padi yang dibudidayakan saat ini adalah hasil evolusi tanaman padi semiakuatik (O’toole 2004). Proses seleksi buatan dan seleksi alam telah memungkinkan padi dibudidayakan pada lahan kering dan basah. Budidaya padi lahan kering meliputi budidaya padi ladang dan gogo, sedangkan budidaya lahan basah meliputi budidaya padi di sawah, rawa, lebak, dan air-dalam. Istilah ladang dipakai untuk sistem pada pertanian lahan berpindah yang menghendaki adanya pembukaan lahan pada awal siklusnya, sedangkan sistem gogo tidak mengenal pembukaan lahan. Sistem gogo dan sawah dapat dipadukan menjadi sistem gogorancah.

Pada sistem padi sawah, air merupakan kebutuhan mutlak. Sumber air pada sawah dapat berasal dari irigasi, tadah hujan, pasang surut, rawa pasang surut, dan lebak. Luas areal pertanaman padi di Indonesia diperkirakan 11 juta hektar meliputi 69% sawah beririgasi, 16% lahan tadah hujan, dan 15% sawah pasang surut (Suprapto 2002). Kira-kira 16-20% dari total luas areal pertanaman padi di Indonesia tersebut rentan terhadap cekaman kekeringan (Pandey & Bhandari 2006). Kekeringan merupakan masalah utama pada budidaya padi sistem sawah tadah hujan dan gogo. Kekeringan juga dapat mengancam sawah irigasi yang terjadi akibat meningkatnya tingkat kerusakan di daerah aliran sungai yang berpengaruh pada ketersediaan air irigasi sepanjang tahun. Sistem budidaya padi air-dalam juga rentan kekeringan jika pada saat bibit tidak segera mendapat air.

Kekeringan dapat ditinjau dari sudut pandang meteorologi, hidrologi, dan pertanian. Kekeringan dari segi meteorologi didefinisikan sebagai kurangnya curah hujan dari rata-rata curah hujan normal pada suatu periode waktu tertentu. Kekeringan secara hidrologi merupakan keadaan ketika jumlah air yang tersedia lebih sedikit daripada jumlah air yang dibutuhkan. Di bidang pertanian, jumlah air yang tidak mencukupi untuk pertumbuhan optimal tanaman pertanian merupakan

8

definisi kekeringan (Jodo 1995) sehingga kekeringan tidak selalu berhubungan dengan kurangnya curah hujan.

Kekeringan memberi pengaruh pada tekanan osmosis sel tanaman

(Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 1997). Cekaman kekeringan memiliki pengaruh yang nyata pada penurunan produktivitas tanaman. Kekeringan dapat mengancam budidaya padi pada fase vegetatif dan generatif. Tinggi tanaman, jumlah anakan, dan luas daun adalah hal yang terpengaruh jika cekaman kekeringan terjadi pada fase vegetatif. Penurunan jumlah malai dapat terjadi apabila padi terpapar kekeringan pada fase generatif. Cekaman kekeringan terjadi apabila jumlah air yang terbatas telah berpotensi untuk mengakibatkan kerusakan pada proses fisiologi. Kondisi ini mempengaruhi sifat fisik tanah, komposisi hara tanah, dan interaksi biologi tanaman padi dengan hama, penyakit, dan tanaman lainnya. Kondisi tanah yang aerobik, cekaman kekeringan, dan kandungan nitrat tinggi merupakan kondisi ideal bagi berkembangnya penyakit blas yang disebabkan oleh Magnaporthe grisea.

Tanaman akan memberikan respon yang berbeda-beda bila dihadapkan pada kondisi yang kurang menguntungkan bagi lingkungan tumbuhnya. Ada sekelompok tanaman yang mampu bertahan sementara kelompok lainya tidak bisa bertahan pada kondisi cekaman yang sama. Ketahanan terhadap kekeringan dapat berarti kestabilan hasil atau kemampuan bertahan pada kondisi kekeringan (Price

et al. 2002). Strategi tahan yang dikembangkan dapat dikelompokkan menjadi

tiga, yaitu melarikan diri (escape), menghindar (avoidance), dan toleran

membiarkan diri terpaparterhadap cekaman (tolerance). Tanaman tidak terpapar

cekaman kekeringan pada strategi escape dan avoidance karena tanaman mampu

menghindari cekaman kekeringan dengan mempertahankan kandungan air yang ada. Apabila ketersediaan air tanaman terganggu, tanaman akan memberikan respon untuk tujuan mentoleransi cekaman (Gambar 2). Kekeringan mengakibatkan akumulasiu racun meningkat sehingga tanaman perlu menetralisasi racun tersebut. Di samping itu, perlu mengontrol pertumbuhan dan memperbaiki kerusakan yang ada. Sebagai akibatnya, pembelahan dan elongasi sel menjadi tertahan atau menjadi berkurang (Bartels & Sunkar 2005).

9

Gambar 2 Mekanisme toleransi kekeringan dan respon tanaman saat terpapar kekeringan (Bartels & Sunkar 2005). Tanda panah menunjukkan arah pengaruh; kotak: bentuk respon sel; +: memberi pengaruh meningkatkan; -: memberi pengaruh menurunkan; ROS: spesies oksigen reaktif. Kotak menggambarkan proses dalam sel.

Padi tahan kering yang ideal adalah padi yang memberikan hasil panen lebih tinggi dibandingkan padi lain apabila terpapar pada cekaman kekeringan dan tetap berpenampilan baik bila tidak ada cekaman kekeringan (Fukai & Cooper 1995). Sifat yang terdapat pada padi tahan kering dapat dibedakan menjadi sifat yang secara konstitutif terekspresi atau sifat yang responsif hanya bila ada kekeringan (Blum 2002; Blum 2005). Sifat konstitutif tidak dipengaruhi oleh ada tidaknya cekaman. Sifat responsif muncul pada saat tanaman terkena cekaman kekeringan dan merupakan proses adaptasi tanaman. Yang tTermasuk sifat yang konstitutif adalah pemrbungaan, akar, sifat permukaan daun, kemampuan tetap hijau, dan kandungan karbohidrat dan nitrogen batang. Beberapa sifat yang termasuk responsif adalah munculnya senyawa dan protein pelindung dari keracunan akibat kekeringan serta perubahan komposisi ekspresi protein.

10

1.2 Cekaman kekeringan: respon tanaman dan upaya rekayasa genetika untuk meningkatkan toleransi tanaman

Sejumlah faktor menentukan bentuk respon padi terhadap kekeringan. Faktor-faktor tersebut adalah genotipe, tahap perkembangan, dan tipe sel. Bentuk respon faktor tersebut ditentukan oleh jumlah air yang hilang dan laju kehilangan air (Bray 1993; Bray 1997). Laju kehilangan air yang lambat diperlukan untuk mengurangi proses kerusakan sel sehingga memungkinkan tanaman dapat kembali pada kondisi semula. Tiga aspek penting dalam kemampuan tanaman untuk kembali ke kondisi semula adalah (1) homeostatis ion; kontrol kerusakan, perbaikan, (2) detoksifikasi akibat cekaman; dan (3) kontrol pertumbuhan (Zhu 2002). Laju kehilangan air yang cepat berakibat pada hilangnya kemampuan sel untuk kembali pada kondisi fisiologi normal.

Kekeringan memberikan cekaman osmotik yang mempengaruhi tekanan turgor sel dan cekaman oksidatif. Keseimbangan ion intraseluler menjadi terganggu pada saat terjadi cekaman kekeringan. Sel akan mensintesis senyawa tertentu yang berfungsi menyeimbangkan tekanan. Sel juga akan menghasilkan protein yang mampu melindungi sel dari keracunan dan memperbaiki kerusakan sel pada saat yang sama. Disamping itu, sel akan mengaktifkan atau menon-aktifkan sejumlah gen untuk merespon cekaman kekeringan yang diterimanya. Gen dengan pola ekpresi yang responsif merupakan gen yang terlibat dalam mekanisme adaptif padi terhadap kekeringan. Hasil respon ekspresi gen mempunyai fungsi dalam mekanisme mentolerir cekaman dan juga mengatur ekspresi dan penyampaian sinyal ketahanan terhadap cekaman kekeringan (Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki 2005). Sejumlah gen yang teraktivasi umumnya terkait dengan fungsi perbaikan dan kontrol kerusakan serta detoksifikasi (Zhu 2002). Toleransi cekaman kekeringan juga melibatkan represi dari sejumlah gen. Transkripsi dari gen-gen yang terlibat dalam fotosintesis pada tanaman Craterostigma plantagineum dilaporkan mengalami penurunan ekspresi

pada saat tanaman terpapar kekeringan (Ingram & Bartels 1996). Proses ini diperlukan untuk proses toleransi tanaman terhadap cekaman kekeringan.

Gen-gen yang merespon cekaman kekeringan dapat dikelompokkan menjadi dua kelompok besar (Gambar 3). Kelompok pertama adalah gen yang menyandi

11

protein yang berfungsi langsung dalam melindungsi sel (protein fungsional). Kelompok kedua adalah gen yang menyandi protein yang mengatur ekspresi gen lain pada saat cekaman kekeringan (protein regulator) (Yamaguchi-Shinozaki et al. 2002). Apabila intensitas cekaman kekeringan yang diteriman sel meleibihi

batas kemampuan yang dapat diterimanya maka sel akan menghancurkan dirinya sendiri melalui apoptosis.

Gambar 3 Penerimaan dan respon sel saat terpapar cekaman kekeringan.Kekeringan akan mengubah komposisi protein regulator atau fungsional sel untuk keperluan adaptasi sel (Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 1997).

Proses adaptasi terhadap cekaman diawali dengan pengindraan dan penyampaian sinyal secara berurutan yang dikategorikan sebagai proses jangka pendek. Lokasi subseluler dari reseptor dan jumlah reseptor yang terlibat dalam pengindraan cekaman kekeringan masih belum jelas (Ingram & Bartels 1996; Bray 1997). Respon jangka pendek memiliki peran dalam respon jangka panjang (Chaves et al. 2003). Respon jangka panjang dapat berbentuk antara lain

penggulungan daun, pengurangan laju respirasi, dan elongasi akar.

Cekaman oksidatif sebagai akibat cekaman kekeringan mengakibatkan peningkatan unsur senyawaspecies reaktif oksigen (ROS) (Vranova et al. 2002).

12

karbohidrat, dan asam nukleat (Blokhina et al. 2003). Dalam kondisi ini

dibutuhkan protein yang berperan dalam mekanisme detoksifikasi dan proteksi sel. Tanaman memiliki sejumlah enzim dan antioksidan yang berfungsi menetralkan ROS (Rodriguez & Redman 2005). Peningkatan ROS akan diubah oleh sejumlah enzim seperti katalase dan askorbat peroksidase sehingga jumlahnya menurun pada saat cekaman abiotik (Mittler 2002) (Gambar 4). Superoksida dismutase (SOD) pertama sekali mengkonversi O2- menjadi H2O2. Askorbat peroksidase (APX), GPX, dan CAT selanjutnya akan mendetoksifikasi H2O2. Askorbat (AsA) dibutuhkan oleh APX sementara glutation (GSH) dibutuhkan oleh GPX untuk regenerasi siklus pda gambar 4A-4C. Siklus ini menggunakan elektrron yang dihasilkan dari fotosintesis (4A) atau NAD(P)H Ekspresi superoksida dismutase pada alfalfa (Medicago sativa L.) transgenik

mampu meningkatkan toleransi terhadap cekaman kekeringan (Samis et al. 2002).

Ekspresi katalase katE dari Escherichia E. coli pada kloroplas tembakau mampu

menahan laju hilangnya klorofil pada saat kekeringan (Miyagawa et al. 2000).

Lintasan penyampaian sinyal cekaman kekeringan dimulai dari penerimaan sinyal. Sinyal akan diteruskan oleh caraka ke dua. Caraka ke dua pada proses ini adalah inositol fosfat dan unsur ROS. Caraka ke dua memiliki peran antara lain mengatur kadar Ca+2 _{intraseluler, mengawali proses fosforilasi protein target yang} terlibat dalam fungsi proteksi, dan juga mengontrol faktor transkripsi (Xiong et al. 2002; Boudsocq & Lauriere 2005). Kekeringan akan menaikkan konsentrasi kalsium bebas di sitosol ([Ca+2_]

Cyt) melalui ROS. Kondisi ini merangsang pembukaan saluran kalsium pada membran vakuola (Finkelstein et al. 2002). Perubahan kalsium ditingkat seluler diterima oleh protein pengikat kalsium dan sensor molekul. Perubahan ini mampu menginduksi sejumlah gen antara lain gen p5cs, rab18 (Lang & Palva 1992; Lang et al. 1994), dan Iti78 (Knight et al. 1997).

Sensor Ca+2 tumbuhan antara lain adalah kalmodulin (CaM) (Zielinski 1998; Snedden & Fromm 1997; Luan et al. 2002), protein kinase yang mengandung domain CaM (CDPK) (Sanders et al. 2002), dan calcineurin B-like (CBL). Sensor kalsium mempunyai pola pengaturan yang berbeda pada respon cekaman kekeringan, salinitas, dan suhu rendah (Cheong et al. 2003). CDPK berfungsi sebagai sensor dan kinase. CaM dan CBL merupakan protein yang mengikatCa+2.

13

Keduanya berfungsi melalui interaksi dengan protein target. Protein kinase yang berinteraksi dengan CBL (CIPK) adalah protein target dari CBL (Luan et al. 2002). Calcineurin B merupakan homolog sensor kalsium SOS3 dari yeast berperan pada ketahanan salinitas (Liu & Zhu 1998). CBL1 merupakan regulator positif untuk kekeringan dan salinitas. CBL1 juga menjadi regulator negatif untuk suhu rendah. CIPK3 diidentifikasi berperan dalam hubungan-lintas interaksi antara asam absisat (ABA) dan lintasan transduksi sinyal abiotik (Kim et al. 2003).

14

Gambar 4 Lintasan penghilangan ROS (spesies oksigen reaktif) pada tanaman(Mitler 2002). A. Siklus air-air. B. Siklus glutation-askorbat C. Siklus glutation peroksidase (GPX). D. Katalase (CAT). PSI fotosistem I; SOD: superoksida dismutase; MDA monodihidroaskorbat; AsA: askorbat; tAPX: tilakoid APX; DHA dihidroaskorbat; MDAR: MDA reduktase; GSH: glutation; GSSG glutation teroksidasi; DHAR: DHA reduktase; GR: glutation reduktase.

Lintasan penyampaian sinyal cekaman kekeringan dimulai dari penerimaan sinyal. Sinyal akan diteruskan oleh caraka kedua. Caraka kedua pada proses ini adalah inositol fosfat dan unsur ROS. Caraka kedua memiliki peran antara lain mengatur kadar Ca+2 _{intraseluler, mengawali proses fosforilasi protein target yang} terlibat dalam fungsi proteksi, dan juga mengontrol faktor transkripsi (Xiong et al. 2002; Boudsocq & Lauriere 2005). Kekeringan akan menaikkan konsentrasi kalsium bebas di sitosol ([Ca+2_]

Cyt) melalui ROS. Kondisi ini merangsang pembukaan saluran kalsium pada membran vakuola (Finkelstein et al. 2002).

15

Perubahan kalsium ditingkat seluler diterima oleh protein pengikat kalsium dan sensor molekul. Perubahan ini mampu menginduksi sejumlah gen antara lain gen p5cs, rab18 (Lang & Palva 1992; Lang et al. 1994), dan Iti78 (Knight et al. 1997).

Sensor Ca+2 tumbuhan antara lain adalah kalmodulin (CaM) (Zielinski 1998; Snedden & Fromm 1997; Luan et al. 2002), protein kinase yang mengandung domain CaM (CDPK) (Sanders et al. 2002), dan calcineurin B-like (CBL). Sensor kalsium mempunyai pola pengaturan yang berbeda pada respon cekaman kekeringan, salinitas, dan suhu rendah (Cheong et al. 2003). CDPK berfungsi sebagai sensor dan kinase. CaM dan CBL merupakan protein yang mengikatCa+2. Keduanya berfungsi melalui interaksi dengan protein target. Protein kinase yang berinteraksi dengan CBL (CIPK) adalah protein target dari CBL (Luan et al. 2002). Calcineurin B merupakan homolog sensor kalsium SOS3 dari yeast berperan pada ketahanan salinitas (Liu & Zhu 1998). CBL1 merupakan regulator positif untuk kekeringan dan salinitas. CBL1 juga menjadi regulator negatif untuk suhu rendah. CIPK3 diidentifikasi berperan dalam hubungan-lintas interaksi antara asam absisat (ABA) dan lintasan transduksi sinyal abiotik (Kim et al. 2003).

Sel dapat menerima cekaman kekeringan dengan menggunakan sistem dua komponen (Gambar 5). Sistem dua komponen pada Escherichia E. coli terdiri dari

osmosensor EnvZ dan regulator respon OmpR. Keduanya mentransmisikan

informasi cekaman osmotik dari permukaan sel. Sistem dua komponen pada eukariotik memiliki sinyal tambahan berupa modul mitogen-activated protein kinase (MAPK). Modul ini dibutuhkan untuk membawa informasi tentang

cekaman osmotik ke tingkat ekspresi gen. Homologi sistem dua komponen pada kapang terdiri dari osmosensor SLN1, protein penyambung YPD1, dan respon regulator SSK1. Pada kondisi osmotik normal, SLN1 aktif secara konstitutif dan memfosforilasi regulator respon SSK1. SSK1 yang aktif akibat fosforilasi akan menekan aktivitas dua MAPKKK yaitu SSK2 dan SSKK2. Represi ini menon-aktifkan modul MAPK sehingga high osmolarity glycerol 1 (HOG1) menjadi

tidak aktif. HOG1 memiliki fungsi menginduksi ekspresi faktor transkripsi yang induktif untuk selanjutnya mengaktifkan gen yang menjadi target. Homologi SLN1 pada tumbuhan adalah protein transmembran histidin kinase dari

16

Arabidopsis thaliana (AtHK1). Sel tumbuhan yang mengkerut akibat cekaman osmotik menjadi rangsangan mekanik. Protein AtHK1 diduga merupakan osmosensor yang mengontrol sinyal cekaman pada modul MAPK (Urao & Yamaguchi-Shinozaki 2002).

Gen responsif cekaman kekeringan dapat memiliki elemen cis dan atau trans (Ingram & Bartels 1996; Shinozaki et al. 2003; Rabbani et al. 2003). Beberapa gen-gen terinduksi ABA mempunyai elemen cis- yang responsif terhadap ABA (ABRE; ACGTGG/TC) pada daerah promoter (Bonetta & McCourt 1998). Beberapa faktor basic regionleucine zipper (bZIP) EmBP1, OSBZ8, dan osZIP-1a yang berikatan dengan ABRE telah diisolasi (Ko & Kamada 2002). Promoter gandum HVA1 mempunyai elemen CE3 (ACGCGTGTCCTG)) dan ABRE. Elemen CE menginduksi ekspresi gen melalui ABA (Shen & Ho 1995). Walaupun demikian, urutan basa A/GCGT tidak mutlak diperlukan sebagai bagian dari CE (Rogers & Rogers 1992; Shen & Ho 1995; Kao et al. 1996; Hobo et al. 1999). Jumlah salinan ABRE dapat meningkatkan respon gen oleh ABA (Skriver et al. 1991). Promoter gandum Em memiliki dua motif ABRE yaitu Em1a dan Em1b yang memiliki peran besar dalam aktivasi gen (Guiltinan et al. 1990). Gen dengan ABRE pada daerah promoter akan diaktifkan oleh faktor trans. AREB1, AREB2, dan AREB3 merupakan faktor transkripsi dari tipe bZIP yang berperan sebagai protein yang berikatan dengan ABRE pada rd29B (Uno et al. 2000). Protein lain yang identik dengan AREB1 dan AREB2 adalah ABF (Choi et al. 2000).

17

Gambar 5 Sistem dua komponen pada Escherichia E. coli dan Saccharomyces serevisiae (Kultz & Burg 1998). Huruf miring menunjukkan gen yang

dipengaruhi.

Gen responsif cekaman kekeringan dapat memiliki elemen cis dan atau trans (Ingram & Bartels 1996; Shinozaki et al. 2003; Rabbani et al. 2003). Beberapa gen-gen terinduksi ABA mempunyai elemen cis- yang responifresponsif terhadap ABA (ABRE; ACGTGG/TC) pada daerah promoter (Bonetta & McCourt 1998). Beberapa faktor basic region leucine zipper (bZIP) EmBP1, OSBZ8, dan osZIP-1a yang berikatan dengan ABRE telah diisolasi (Ko & Kamada 2002). Promoter gandum HVA1 mempunyai elemen CE3 (ACGCGTGTCCTG)) dan ABRE. Elemen CE menginduksi ekspresi gen melalui ABA (Shen & Ho 1995). Walaupun demikian, urutan basa A/GCGT tidak mutlak diperlukan sebagai bagian dari CE (Rogers & Rogers 1992; Shen & Ho 1995; Kao et al. 1996; Hobo et al. 1999). Jumlah salinan ABRE dapat meningkatkan respon gen oleh ABA (Skriver et al. 1991). Promoter gandum Em memiliki dua motif

18

ABRE yaitu Em1a dan Em1b yang memiliki peran besar dalam aktivasi gen (Guiltinan et al. 1990). Gen dengan ABRE pada daerah promoter akan diaktifkan oleh faktor trans. AREB1, AREB2, dan AREB3 merupakan faktor transkripsi dari tipe bZIP yang berperan sebagai protein yang berikatan dengan ABRE pada rd29B (Uno et al. 2000). Protein lain yang identik dengan AREB1 dan AREB2 adalah ABF (Choi et al. 2000).

Sejumlah gen seperti cor15a dan rd29A terinduksi melalui lintasan

yang tidak melibatkan ABA. Promoter gen-gen tersebut memiliki urutan basa khusus yang merespon kekeringan DRE (TACCGACAT). Elemen cis dengan

motif yang serupa dengan G/ACCGAC ditemukan pada CRT dan LTRE (Baker et al. 1994; Jiang et al. 1996; Thomashow 1999). CRT dan LTRE merupakan

elemen yang berperan pada respon suhu rendah. Gen yang mengandung elemen

cis DRE akan diaktifkan oleh faktor transkripsi yang berikatan dengan daerah

tersebut yaitu DREB/CBF (Stockinger et al. 1997; Liu et al. 1998). Peningkatan

tingkat ekspresi protein AP2/EREBP CBF-1 dapat meningkatkan toleransi terhadap dingin dan DREB1a dapat meningkatkan toleransi terhadap kekeringan atau salinitas atau dingin pada ArabidopsisA.thaliana (Jaglo-Ottosen et al. 1998;

Kasuga et al. 1999; Yamaguchi-Shinozaki & Shinozaki 2001).

Tanaman akan memproduksi osmoprotektan pada sel saat terjadi cekaman. Osmoprotektan berfungsi menjaga sel dari ROS. Osmoprotektan seperti trehalosa dan fruktan dihasilkan oleh beberapa mikroorganisme. Introduksi gen penyandi osmoprotektan asal mikrob dapat meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Akumulasi trehalose pada padi transgenik menunjukkan peningkatan tingkat

toleransi terhadap cekaman kekeringan. Gen-gen yang diintroduksi adalah penyandi lintasan biosintesis trehalosa otsA dan otsB dari Escherichia E. coli (Wu

& Garg 2003). Ekspresi gen penyandi fruktan SacB dari Bacillus subtilis

meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan pada tembakau transgenik (Pilon-Smits et al. 1995). Introduksi osmoprotektan yang lain seperti glisin betain dan

prolin juga mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap cekaman kekeringan. Tanaman transgenik ArabidopsisA. thaliana mengandung gen penyandi biosintesis glisin betain mampu meningkatkan toleransi tanaman saat cekaman abiotik (Chen & Murata 2002). Peningkatan kandungan prolin pada padi

19

transgenik mampu memperbaiki ketahanan terhadap kekeringan (Cheng et al.

2001).

Hormon tumbuhan asam absisat (ABA) akan meningkat pada waktu terjadi cekaman kekeringan. Kenaikan tingkat konsentrasi ABA selama kekeringan terjadi karena ekspresi sejumlah gen yang mengatur biosintesis ABA (Xiong et al. 2002). ABA dapat mengaktifkan sejumlah gen (Leung & Giraudat

1998). Beberapa gen memperlihatkan respon kekeringan tanpa melalui sinyal ABA. Terdapat dua sinyal transduksi yang melibatkan ABA dan dua sinyal lainnya tidak melibatkan ABA pada respon tanaman terhadap cekaman kekeringan (Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 1997). Lintasan yang tidak melibatkan ABA diperkirakan terekspresi lebih dahulu dibandingkan lintasan yang melibatkan ABA (Narusaka et al. 2003; Dubouzet et al. 2003).

1.3 Identifikasi gen potensial untuk padi tahan kering

Beberapa ciri fisiologi dan morfologi tanaman padi untuk bertahan pada saat cekaman kekeringan telah diidentifikasi (Fukai & Kamoshita 2005). Penundaan waktu berbunga, warna hijau dari daun yang lebih dominan, dan pembentukan malai setelah periode kering merupakan ciri penting untuk tanaman padi yang mampu bertahan dari cekaman kekeringan apabila cekaman datang pada fase vegetatif. Sedangkan ciri penting tanaman padi tahan cekaman kekeringan jika kekeringan menyerang pada fase generatif antara lain adalah waktu berbunga yang lebih awal, tidak ada penundaan waktu berbunga, kandungan air yang tinggi pada daun, dan sedikit jumlah daun yang mati. Identifikasi sifat tahan kering dapat dipakai sebagai dasar untuk mencari gen-gen yang terlibat dalam mekanisme tahan kering.

Pencarian sifat yang berperan penting dalam ketahanan kekeringan dari tanaman padi dapat dilakukan dengan mempelajari fungsi gen yang terlibat. Fungsi gen dipelajari dengan meningkatan tingkat ekspresinya (overexpression),

menghilangkan ekspresi (knockout), dan mengidentifikasi pola ekspresi gen

tersebut. Gen yang terlibat dapat diidentifikasi dengan pendekatan genetika

106

Spoel SH, Koornneef A, Claessens SMC, Korzelius JP, Van Pelt JA, Mueller MJ, Buchala AJ, Métraux JP, Brown R, Kazan K, Van Loon LC, Dong X, Pieterse CMJ. 2003. NPR1 modulates cross-talk between salicylate- and jasmonate-dependent defense pathways through a novel function in the cytosol. Plant Cell. 15: 760–770.

Sticher L, Mauch-Mani B, Matraux JP. 1997. Systemic acquired resistance. Annu Rev Phytopathol 35: 235-247.

Stockinger EJ, Glimour SJ, Thomashow MF. 1997. Arabidopsis thaliana CBFl

encodes an AP2 domain-containing transcription activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit. Proc Natl Acad Sci USA 94: 1035-1040.

Suprapto A. 2002. Land and water resources development in Indonesia. Di dalam:

Investment in land and water. Proceedings of the regional consultations.

Bangkok-Thailand, 3-5 Oktober 2001. Bangkok: FAO. hlm. 233-242. Thomashow MF. 1999. Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and

regulatory mechanisms. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50: 571–

599.

Triglia T, Peterson MG, Kemp DJ. 1988. A procedure for in vitro amplification of DNA segments that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res 16:8186.

Tron AE, Bertoncini CW, Palena CM, Chan RL, Gonzales DH. 2001. Combinatorial interactions of two amino acids with a single base pair define target site specificity in plant dimeric homeodomain proteins. Nucleic Acids Research 29: 4866-4872.

Uno Y, Furihata T, Abe H, Yoshida R, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. 2000. Arabidopsis basic leucine zipper transcription factors involved in an

abscisic acid-dependent signal transduction pathway under drought and high-salinity conditions. Proc Natl Acad Sci USA 97: 11632–11637.

Urao T, Yamaguchi-Shinozaki K. 2002. An osmosensor as amolecular tool for the genetic improvement of drought-tolerant crops. JIRCAS Research Highlights. hlm. 8-9.

Utami DW, Moeljopawiro S, Aswidinnoor H, Setiawan A, Guhardja E. 2005. QTL analysis of blast resistance trait in interspecific population between IR64 and Oryza rufipogon. J Biotek Pertanian 1: 7-14.

Formatted: Spanish (Mexico)

107

Verberne MC, Verpoote R, Bol JF, Mercado-Blanco J, Linthors HJM .2000. Overproduction of salicylic acid in plants by bacterial transgenes enhances pathogen resistance. Nature Biotech 18: 779-783.

Vernooij B, Friedrich L, Morse A, Reist R, Kolditz-Jawhar R, Ward E, Uknes S, Kessmann H, Ryals J. 1994. Salicylic acid is not the translocated signal responsible for inducing systemic acquired resistance but is required in signal transduction. Plant Cell 6: 959-969.

Vollbrecht E, Veit B, Sinha N, Hake S. 1991. The development gene Knotted-1 is a member maize homeobox gene family. Nature 350: 241-243.

Vranova E, Inze D, Breusegem FV. 2002. Signal transduction during oxidative stress. Journal of Exp Bot 54: 1227-1236.

Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM. 2001. Construct design for efficient, effective and highthroughput gene silencing in plants. Plant J 27: 581-590.

Wildermuth MC, Dewdney J, Wu G, Ausebel FM. 2001. Isochorismate synthase is required to synthesize salicylic acid for plant defence. Nature 414:

562-571.

Wu R, Garg A. 2003. Engineering rice plants with trehalose-producing genes improves tolerance to drought, salt, and low temperature. ISB News Report.

hlm. 1-3.

Xiang C, Miao ZH, Lam E. 1997. DNA-binding properties, genomic organization and expression pattern of TGA6, a new member of the TGA family of bZIP transcription factors in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol 34: 403–415.

Xiong L, Lee H, Ishitani M, Tanaka Y, Stevenson B, Koiwa H, Bressan RA, Hasegawa PM, Zhu JK. 2002. Repression of stress-responssive gene by FIERY2, a novel transcriptional regulator in Arabidopsis . Proc Natl Acad Sci USA 99: 10899-10904.

Yalpani N, LeÓn J, Lawton MA, Raskin I. 1993. Pathway of salicylic scid biosynthesis in healthy and virus-inoculated tobacco. Plant Physiol 103:

315-321.

Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 2001. Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Di dalam: Novartis Foundation Symposium. 236: 176-186.

Yamaguchi-Shinozaki, Kasuga M, Liu Q, Nakashima K, Sakuma Y, Abe K, Shinwari ZK, Seki M, Shinozaki K. 2002. Biological mechanism of drought stress response. JIRCAS Working Report: 1-8.

Formatted: Dutch (Netherlands)

108

Yamaguchi-Shinozaki K, Ito Y, Maruyama K. 2003. Monitoring expression profiles of rice genes under cold, drought and high-salinity stresses, and ABA application using both cDNA microarray and RNA gel blot analyses.

JIRCAS Research Highlights. hlm.6-7.

Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. 2005 Organization of cis-acting regulatory elements in osmotic- and cold-stress-responsive promoters. Trends Plant Sci

10: 88-94.

Yanasigawa S. 1998 Transcription factor in plants: physiological function and regulation of expression. J Plant Res 111: 363-371.

Yang JY, Chung MC, Tu CY, Leu WM. 2002. OSTF1: A HD-GL2 family

homeobox gene is developmentally regulated during early embryogenesis in rice. Plant Cell Physiol 43: 628-638.

Yang P, Chen C, Wang Z, Fan B, Chen Z. 1999. A pathogen- and salicylic acid-induced WRKY DNA-binding activity recognizes the elicitor response element of the tobacco class I chitinase gene promoter. Plant J 18: 141-149.

Yang Y, Qi M, Mei C. 2004. Endogenous salicylic acid protects rice plants from oxidative damage caused by aging as well as biotic and abiotic cekamans.

Plant J 40: 909-919.

Yen KM, Gunsalus IC. 1982. Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation. Proc Natl Acad Sci USA 79: 874-878.

You IS, Ghosal D, Gunsalus. 1991. Nucleotide sequence analysis of the

Pseudomonas putida PpG7 salicylate hydroxylase gene (nahG) and its

3'-flanking region. Biochem 30: 1635-1641.

Yu D, Liu Y, Fan B, Klessig DF, Chen Z. 1998. Is the high basal tingkat of salicylic acid important for disease resistance in potato? Plant Physiol 115:

343-349.

Zhu JK. 2002. Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol 53: 247–73.

Zielinski RE. 1998. Calmodulin and calmodulin-binding proteins in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49: 697-725.

Zubieta C, Ross JR, Koscheski P, Yang Y, Pichersky E, Noel JP. 2003. Structural basis for substrate recognition in the salicylic acid carboxyl methyltransferase family. Plant Cell 15, 1704–1716.

Formatted: English (U.S.)

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM

8/ 30/ 2007 5:12:00 PM