Over ekspresi Gen OsWRKY76 untuk ketahanan terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada padi

OVER-EKSPRESI GEN

OsWRKY76

UNTUK KETAHANAN

TERHADAP CENDAWAN BLAS (

Pyricularia grisea

Sacc.)

PADA PADI

ANIVERSARI APRIANA

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

PERNYATAAN MENGENAI TESIS

DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan terhadap Cendawan Blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada Padi adalah karya saya dengan arahan dari komosi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesisi ini.

Bogor, Agustus 2008

Aniversari Apriana NIM A351050091

ABSTRACT

ANIVERSARI APRIANA. Over-expression of OsWRKY76 Gene for Blast Resistance (Pyricularia grisea Sacc.) in Rice. Under direction of SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.

Rice plant is estimated to have 109 transcription factor genes of OsWRKY family. Though few of these genes has been known involved in the defense mechanism, the function of the most of them has not been uncovered yet. This study was intended to show that over-expression of OsWRKY76 gene in transgenic rice increase the resistance to blast infection. A construct of pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 has been successfully assembled and transformed into embryogenic calli of rice cv. Nipponbare using A. tumefaciens strain Agl-1 and EHA 105. A number of 126 independent lines has been produced, in which Agl-1 showed higher efficiency than EHA 105. PCR analysis of randomly selected 25 independent lines showed that all of them positively contained the over-expression construct of the OsWRKY76 gene. DNA blot analysis showed that a range of 1-4 copies of the over-expression construct of the OsWRKY76 gene was integrated in the genoms of randomly selected 26 independent lines. Out of 6 independent lines containing single copy of the construct, 3 independent lines showed better resistance than non-transgenic plants upon the inoculation using dominant Pyricularia grisea isolat 173.

RINGKASAN

ANIVERSARI APRIANA. Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan Terhadap Cendawan Blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada Padi. Dibimbing oleh SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.

Salah satu kendala dalam peningkatan produksi beras adalah adanya cekaman biotik dan abiotik. Salah satu penyakit utama yang menyerang tanaman padi adalah penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea Sacc. Serangan cendawan blas pada padi dapat menurunkan hasil 1-50 %, sementara bila menyerang leher malai dapat menurunkan hasil sampai 100 %. Cendawan blas cepat berubah virulensinya, tergantung pada genotipe inang dan lingkungan sekitarnya.

Hasil-hasil penelitian mengenai sistem pertahanan tanaman terhadap patogen menunjukkan adanya interaksi produk gen Avr dari patogen dan produk gen R dari tanaman. Gen Avr patogen menjadi protein elicitor yang berinteraksi secara fisik dengan protein reseptor kinase yang merupakan produk dari gen R dari tanaman. Protein reseptor kinase yang diaktifkan melalui interaksi ini selanjutnya bisa mengaktifkan protein-protein yang lain seperti faktor transkripsi. Faktor transkripsi akan mengaktifkan ekspresi gen-gen yang terlibat langsung dalam memberikan proteksi pada tanaman, seperti kitinase dan glucanase.

WRKY merupakan suatu protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Tanaman padi diperkirakan mempunyai 109 gen yang termasuk dalam famili OsWRKY, tetapi banyak dari gen-gen tersebut belum diketahui fungsinya. Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas.

Dengan teknologi DNA dimungkinkan untuk memasukkan suatu gen asing yang diinginkan ke dalam tanaman dengan tidak dibatasi dari mana sumber gen asing tersebut berasal Teknik yang digunakan untuk memasukkan suatu gen asing tersebut salah satunya dapat dengan bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens.

Rekayasa genetik tanaman padi untuk mendapatkan varietas tahan penyakit perlu dilakukan, salah satunya dapat dengan cara memanipulasi tingkat ekspresi dari faktor transkripsi yang terkait dengan sistem pertahanan tanaman dengan strategi over-ekspresi.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan dan menguji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada tanaman padi. Penelitian ini terdiri dari 2 subkegiatan yaitu 1. Konstruksi dan introduksi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 melalui Agrobacterium tumefaciens pada tanaman padi Nipponbare, dan 2. Analisis integrasi dan uji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 pada padi Nipponbare terhadap cendawan Pyricularia grisea Sacc.

Pada kegiatan pertama dilakukan perakitan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam vektor biner pCAMBIA-1301, dan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam kalus embriogenik padi Nipponbare dengan bantuan A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105. Transforman yang diperoleh kemudian dianalisis molekuler dengan teknik PCR. Hasil dari penelitian ini adalah telah berhasil dirakit konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam vektor biner pCAMBIA-1301. Transformasi kalus embriogenik padi Nipponbare dengan bantuan A.tumefaciens yang mengandung rakitan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 menghasilkan 126 galur independen, di mana transformasi menggunakan Agrobacterium strain Agl-1 lebih banyak menghasilkan galur independen dibandingkan dengan strain EHA 105. Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR menunjukkan bahwa dari 25 galur independen generasi T0 yang dianalisis, semua positif mengandung rakitan over-ekspresi gen OsWRKY76.

Pada kegiatan kedua dilakukan analisis integrasi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 di dalam tanaman padi transgenik Nipponbare generasi T0 dengan metode Southern Blot dan mengevaluasi ketahananan tanaman transgenik terhadap infeksi cendawan Pyricularia grisea. Hasil analisis blot DNA memperlihatkan dari 26 galur independen yang dianalisis terdapat 1-4 kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 yang terintegrasi di dalam genom tanaman. Dari 6 galur independen yang mengandung kopi tunggal konstruk

over-ekspresi gen OsWRKY76, terdapat 3 galur independen memperlihatkan ketahanan lebih baik dari tanaman non-transgenik pada saat diinokulasi dengan Pyricularia grisea isolat 173.

©Hak Cipta milik IPB, tahun 2008 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

OVER-EKSPRESI GEN

OsWRKY76

UNTUK KETAHANAN

TERHADAP CENDAWAN BLAS (

Pyricularia grisea

Sacc.)

PADA PADI

ANIVERSARI APRIANA

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Agronomi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2008

Judul Tesis : Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan terhadap Cendawan Blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada Padi Nama : Aniversari Apriana

NIM : A351050091

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Sudarsono, M.Sc. Ketua

Dr. Ir. Nurul Khumaida, M.S. Dr. Kurniawan Rudi Trijatmiko, S.P, M.Si. Anggota Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Agronomi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Munif Ghulamahdi, M.S. Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan pada Allah SWT atas segala limpahan karunia-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis yang merupakan salah satu syarat untuk meraih gelar Magister Sains di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan September 2006- Mei 2008, dengan judul Over-ekspresi Gen OsWRKY76 untuk Ketahanan terhadap Cendawan Blas (Pyricularia Grisea Sacc.) pada Padi. Tesis ini dibagi dalam dua subjudul penelitian yaitu Konstruksi dan Introduksi Konstruk Over-ekspresi Gen OsWRKY76 melalui Agrobacterium tumefacies pada Tanaman Padi Nipponbare dan Analisis Integrasi dan Uji Efek Over-ekspresi Gen OsWRKY76 pada Padi Nipponbare terhadap Cendawan Pyricularia grisea Sacc.

Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada Prof.Dr.Ir Sudarsono,MSc. Selaku ketua komisi pembimbing, Dr.Ir. Nurul Khumaida, MS dan Dr.Ir. Kurniawan Rudi Trijatmiko, MS selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak membimbing dan mengarahkan penulis selama menjalani pendidikan dan penelitian di Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Tak lupa penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Dr.Ir. Bonny Poernomo, MS selaku dosen penguji luar komisi tesis.

Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kepala Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian atas kesempatan yang telah diberikan kepada penulis untuk menjalani pendidikan di IPB. Tak lupa penulis juga mengucapkan terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada Bapak Dr. M Herman selaku ketua Kelti Biologi Molekuler, BB-BIOGEN yang telah memberi kesempatan kepada penulis untuk menjalani studi di IPB. Disamping itu juga kepada BB-BIOGEN dan Badan Litbang Pertanian yang telah memberikan beasiswa. Selanjutnya kepada Bapak Dr.Ir. Munif Ghulamahdi, MS sebagai ketua program studi Agronomi SPs IPB penulis sampaikan ucapan terima kasih atas bimbingan dan dorongan yang telah diberikan selama penulis menjalani masa studi.

Penulis juga mengungkapkan rasa terima kasih yang sedalam-dalamnya kepada Ayahanda, Ibunda, dan Ibu mertua serta seluruh keluarga atas dorongan,

do’a, kasih sayangnya sehingga penulis mempunyai motivasi untuk menyelesaikan studi dan penelitian. Kepada suami tercinta dan anak-anakku tersayang trimaksih atas dorongan semangat serta kesabaran dan pengertiannya selama penulis menjalani masa studi sampai dapat menyelesaikan studi.

Tidak lupa penulis juga berterima kasih yang sedalam-dalamnya kepada rekan-rekan kantor Mitri, Wening, Tri Joko, Mbak Dinar, Mbak Nita, Teh Nur, Kak Heri, Muslih, Syarif dan lainnya yang tidak dapat penulis sebut satu-persatu yang selalu memberikan dorongan semangat dan bantuannya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan penelitian ini.

Penulis menyadari bahwa di dalam penyusunan tulisan ini masih banyak kekurangan dan kelemahan. Maka dari itu, penulis sangat mengharap adanya kritik dan saran dari pembaca demi sempurnanya tulisan ini. Semoga tulisan karya ilmiah ini dapat bermanfaat di kemudian hari. Amien.

Bogor, Agustus 2008

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Yogyakarta, pada tanggal 23 April 1970 sebagai anak keempat dari pasangan Jumhan Pida dan Titi Wrestiati.

Pada tahun 1983 penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Dasar di SD Muhammadiyah Purwodiningratan I Yogyakarta, dan melanjutkan ke SMP Negri 8 Yogyakarta dan lulus pada tahun 1986. Selanjutnya penulis melanjutkan ke SMA Negri 2 Yogyakarta, dan lulus pada tahun 1989. Penulis memperoleh gelar Sarjana Sains dari Fakultas Biologi, Jurusan Botani, Universitas Gadjah Mada pada tahun 1996. Pada tahun 2005 penulis mendapat kesempatan melanjutkan studi di Program Studi Agronomi, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Beasiswa Pendidikan diperoleh dari BB-BIOGEN dan Badan Litbang Pertanian, Departemen Pertanian.

Penulis bekerja sebagai staf peneliti di Kelompok Peneliti Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor, sejak tahun 1996 sampai sekarang. Selama bekerja Penulis terlibat dalam berbagai program penelitian tanaman padi, khususnya mengenai perakitan tanaman transgenik.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xv

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang... 1

Tujuan... 4

Hipotesis Penelitian... 4

TINJAUAN PUSTAKA ... 5

Penyakit Blas ... 5

Sistem Pertahanan Pada Tanaman ... 6

Pengaturan Aktivitas Faktor Transkripsi di dalam Tanaman. 8

Dasar Transformasi Tanaman Melalui Agrobacterium ... 9

KONSTRUKSI DAN INTRODUKSI KONSTRUK OVER-EKSPRESI GEN OsWRKY76 MELALUI AGROBACTERIUM TUMEFACIES PADA TANAMAN PADI NIPPONBAR ... 12 Abstrak ... 12

Abstract ... 13

Pendahuluan ... 14

Bahan dan Metode ... 19

Hasil dan Pembahasan ... 27

Kesimpulan ... 43

ANALISIS INTEGRASI DAN UJI EFEK OVER-EKSPRESI GEN OsWRKY76 PADA PADI NIPPONBARE TERHADAP CENDAWAN PYRICULARIA GRISEA SACC... 44 Abstrak ... ... 44

Abstract ... 45

Pendahuluan ... 46

Bahan dan Metode ... 50

Hasil dan Pembahasan ... 55

Kesimpulan ... 61

PEMBAHASAN UMUM ... 62

KESIMPULAN DAN SARAN ... 67

DAFTAR PUSTAKA ... 68

LAMPIRAN ... 73

DAFTAR TABEL

Halaman 1 Hasil transformasi kalus padi varietas Nipponbare dengan

konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 melalui A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA-105 ...

38

2 Skala penyakit blas daun berdasarkan sistem evaluasi standar IRRI ...

54 3 Jumlah kopi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 pada 26

galur- galur independen hasil analisis Southern Blot ... 56 4 Tingkat ketahanan galur Nipponbare transgenik dibandingkan

dengan tanaman non-transgenik ... 58

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1 Diagram alur penelitian ... 20 2 Bagan alur prosedur prosedur kegiatan konstruksi over-ekspresi

genOsWRKY76 ... 21 3 Skema konstruk 35SCaMV::OsWRKY76::35SCaMV dengan situs

pemotongan enzim restriksi dan ukuran dari masing-masing fragmen ...

23

4 Hasil amplifikasi 5 sampel DNA Nipponbare dengan primer untuk gen OsWRKY76. Ukuran gen OsWRKY76 yang diharapkan adalah sebesar 1200 bp ditandai dengan anak panah ...

28

5 Hasil konfirmasi keberadaan fragmen gen OsWRKY76 pada plasmid pGEM-T easy yang dipotong dengan enzim BamHI dan SalI, menghasilkan fragmen dengan ukuran + 3.000 bp (fragmen pGEM-T Easy) dan 1.200 bp (fragmen OsWRKY76 sampel nomor 1, 2, 4, dan 5). Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan ukuran fragmen yang tidak sesuai ...

29

6 (A) Hasil pemotongan plasmid pSP13 dengan enzim HindIII dan BamHI menghasilkan fragmen promotor 35SCaMV dengan ukuran 550 bp dan fragmen plasmid pBS-SK+ (3.000 bp), (B) Hasil pemotongan plasmid pST8 dengan enzim SalI dan EcoRI menghasilkan fragmen erminator 35SCaMV dengan ukuran 210 bp dan fragmen plasmid pBS-SK+ (3.000 bp) ...

31

7 Hasil pemotongan plasmid biner pCAMBIA-1301 dengan enzim HindIII dan EcoRI menghasilkan fragmen berukuran 11.837 bp ....

32 8 Hasil pemotongan plasmid pCAMBIA 1301-OsWRKY76 dengan

enzim restriksi EcoRI.Ukuran yang dihasilkan dari pemotongan tersebut adalah: 210 bp yang merupakan ukuran terminator 35SCaMV, 710 bp merupakan ukuran sebagian potongan gen OsWRKY76, 1040 bp merupakan ukuran dari gabungan promotor 35SCaMV dan sebagian potongan gen OSWRKY76, dan 11.837 bp merupakan ukuran fragmen pCAMBIA 1301 ...

34

9 Hasil konfirmasi dari 2 sampel plasmid untuk mengetahui keberadaan gen kimera (promoter 35SCaMV, gen OsWRKY76, dan terminator 35SCaMV) pada plasmid biner pCAMBIA-1301, dengan menggunakan 2 cara pemotongan (A) pCAMBIA1301 rekombinan dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI menghasilkan produk hasil pemotongan dengan ukuran 210, 710, 1040, dan 11837 bp, dan (B) pCAMBIA-1301 rekombinan dipotong menggunakan 3 enzim restriksi HindIII, BamHI dan SalI, menghasilkan produk dengan ukuran 550, 1200, dan 13047 bp. Ket.: Kb = marker 1 Kb plus (Invitrogen), 1,3 = plasmid dari koloni bakteri nomor 1 dan 3 ...

10 A. Plasmid pCAMBIA -1301dengan daerah MCS (Multi Clonning Site) dan B. Plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 hasil kloning ...

36

11 Hasil konfirmasi pemotongan plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 yang diisolasi dari E.coli dengan enzim restriksi EcoRI, menghasilkan fragmen dengan ukuran 210 (terminator 35S),710 (potongan gen OsWRKY76), 1040 (potongan gen OsWRKY76 + promotor 35S), dan 11.837 bp (plasmid pCAMBIA-1301) ...

36

12 Hasil transformasi kalus padi Nipponbare melalui Agrobacterium

tumefaciens yang mengandung vector biner

pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76. Ket.: A. kalus pada media seleksi yang mengandung higromisin 50 mg/L, B. kalus yang tumbuh di media EIM (induksi embrio) yang mengandung antibiotik higromisin 50 mg/L, C. kalus yang berhasil beregenerasi di media regenerasi yang mengandung antibiotik higromisin 30 mg/L, D. plantlet di media perakaran yang mengandung antibiotik higromisin 40 mg/L, E. populasi tanaman padi Nipponbare transgenik hasil aklimatisasi di rumah kawat ...

40

13 Hasil amplifikasi DNA padi Nipponbare transgenik generasi T0 yang mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dengan menggunakan primer untuk gen hptII (gen untuk ketahanan terhadap antibiotik higromisin). Pita dengan ukuran + 500 bp merupakan fragmen gen hptII. Ket.: KB=Marker 1 Kb Plus (Invitrogen), 1-25= sampel tanaman transgenik generasi T0, Nip=tanaman Nipponbare non-transgenik, A=Air, P=Plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 ...

41

14 Analisis Southern blot pada 26 galur tanaman padi Nipponbare transgenik berdasar metode Panaud et. al. (1993) dengan probe hptII. DNA genom dari tanaman transgenik dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI, diseparasi dengan elektroforesis, didenaturasi, ditransfer ke membran nilon Hybon N+, dan dihibridisasi dengan menggunakan probe hptII. Ket.:1-26 =secara berurutan sampel galur-galur NAW 1.1,NAW 2.12, NAW 3.2, NAW 4.1, NAW 5.2, NAW 6.3, NAW 7.3, NAW 8.2, NAW 11.1, NAW 12.1, NAW 13.1, NAW 14.4, NAW 15.3, NAW 16.1, NAW 17.1, NAW 18.1, NAW 22.1, NAW 23.1, NAW 25.6, NAW 26.3, NAW 29.2, NAW 30.5, NAW 34.3, NAW 35.3, NAW 36.1, NAW 37.2, = 1KB Ladder ...

56

15 Daun padi Nipponbare transgenik tahan (3 galur) dan non-transgenik yang telah diinokulasi dengan cendawan blas (Pyricularia grisea) isolat uji 173.Keterangan: A: tanaman non-transgenik, B: galur NAW 1.1, C:galur NAW 36.1, D: NAW 37.2. Tanda anak panah menunjukkan adanya bercak serangan cendawan blas ...

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Komposisi MediaTransformasi Padi ... 73 2 Komposisi Media Pertumbuhan Bakteri ... 77

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Beras merupakan salah satu bahan makanan pokok yang dikonsumsi oleh masyarakat dunia pada umumnya dan Indonesia pada khususnya. Salah satu kendala dalam peningkatan produksi beras adalah adanya cekaman biotik dan abiotik. Cekaman biotik dapat disebabkan karena adanya serangan hama dan penyakit. Salah satu penyakit utama yang menyerang tanaman padi adalah penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea Sacc. (Rossman el al. 1990). Penyakit ini dapat menyerang semua bagian dari tanaman padi. Gejala serangan dapat dilihat sebagai bercak-bercak pada daun, batang, dan leher malai yang berbentuk belah ketupat, dengan pinggir coklat/coklat kemerahan dan bagian tengah berwarna abu-abu atau putih (Ou 1985; Scardaci et al. 1997).

Di Indonesia menurut laporan dari Departemen Pertanian (Anonim, 2006), pada musim tanam tahun 2005 terdapat serangan penyakit blas di seluruh wilayah Indonesia seluas 9.860 hektar dan 18 hektar diantaranya mengalami puso. Daerah-daerah di Indonesia pada musim tanam tahun 2005 yang banyak mengalami serangan blas diantaranya adalah daerah Jawa Timur (4.118 ha), Jawa Barat (1.311 ha) dan Lampung (1.493 ha). Scardaci et al. (1997) menyatakan bahwa serangan cendawan blas pada padi dapat menurunkan hasil 1-50 %, sementara bila menyerang leher malai dapat menurunkan hasil sampai 100 % (Ou 1985). Penyakit blas merupakan kendala utama pada padi gogo, tetapi dewasa ini penyakit tersebut mulai meluas pada pertanaman padi sawah (Rahamma & Hasanuddin 1993). Cendawan blas cepat berubah virulensinya, tergantung pada genotipe inang dan lingkungan sekitarnya (Utami 1999).

Program pemuliaan padi yang mengarah pada pembentukan varietas tahan untuk peningkatan hasil sampai saat ini terus dilakukan. Penggunaan varietas tahan terhadap penyakit merupakan cara yang paling efektif dan efisien dalam menanggulangi penyakit blas sehingga dapat meningkatkan hasil. Pemuliaan tanaman padi secara konvensional untuk mendapatkan tanaman padi tahan penyakit blas telah banyak dilakukan. Dengan metode persilangan dan silang balik antar padi budidaya ataupun antara padi budidaya dan padi liar, telah berhasil

dimasukkan gen ketahanan ke dalam salah satu tanaman padi budidaya sehingga berhasil didapatkan tanaman yang tahan terhadap penyakit blas (Bordeos 1992; Utami 2005; Ram et al. 2007).Kelemahan dari pemuliaan secara konvensional ini diantaranya adalah linkage drag dan membutuhkan waktu yang lama dalam seleksi untuk mendapatkan varietas baru (Hanarida 1999).

Teknologi DNA atau yang dikenal dengan teknologi rekayasa genetik saat ini telah berkembang pesat. Dengan teknologi DNA telah dimungkinkan untuk memasukkan suatu gen asing/spesifik yang diinginkan ke dalam tanaman dengan tidak dibatasi dari mana sumber gen asing tersebut berasal (virus, bakteri, ataupun dari organisme lain).Teknik yang digunakan untuk memasukkan suatu gen spesifik tersebut ke dalam genom tanaman dapat dilakukan secara fisik (penembakan partikel, elektroporasi, PEG) maupun biologis, yaitu melalui bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens. Oleh karena itu, pendekatan pemuliaan tanaman padi untuk mendapatkan varietas tahan penyakit dengan teknologi DNA (transformasi genetik) saat ini perlu dilakukan untuk mendukung pemuliaan secara konvensional. Transformasi genetik sangat tergantung dengan adanya gen kandidat yang telah diketahui fungsinya, sistem regenerasi, transformasi dan seleksi, serta uji stabilitas dan efek dari gen kandidat di dalam tanaman.

Hasil-hasil penelitian selama ini menunjukkan adanya interaksi produk gen Avr dari patogen dan produk gen R dari tanaman. Gen Avr patogen menjadi protein elicitor yang berinteraksi secara fisik dengan protein reseptor kinase (NBS-LRR) yang merupakan produk gen R dari tanaman (Ayliffe et al. 2004). Protein reseptor kinase yang diaktifkan melalui interaksi ini selanjutnya bisa mengaktifkan protein-protein yang lain seperti faktor transkripsi melalui mekanisme fosforilasi. Pada gilirannya faktor transkripsi ini mengaktifkan ekspresi gen-gen yang terlibat langsung dalam memberikan proteksi pada tanaman, seperti kitinase dan glucanase. Faktor transkripsi yang sudah diketahui terlibat dalam mekanisme pertahanan tanaman terhadap patogen diantaranya adalah WRKY, ERF, bZIP, dan MYB (Chakravarthy et. al. 2003).

Bukti-bukti yang telah ada menunjukkan bahwa perbedaan antara varietas tahan dan peka adalah pada gen R yang menyandi protein reseptor, sementara

tidak ditemukan perbedaan pada mekanisme molekuler di bawahnya (Vidhyasekaran 2002). Hal ini memungkinkan untuk melakukan rekayasa genetik untuk perbaikan ketahanan terhadap patogen melalui modifikasi tingkat ekspresi dari faktor transkripsi yang terlibat dalam mekanisme pertahanan. Pendekatan ini lebih menjanjikan dibanding over-ekspresi pada satu gen pertahanan tanaman, karena memungkinkan melakukan aktivasi sekaligus pada puluhan gen pertahanan tanaman yang menjadi target dari faktor transkripsi.

Dengan telah selesainya pengurutan DNA dari genom tanaman padi memungkinkan untuk mengetahui keberadaan, macam dan sifat dari gen-gen yang ada pada tanaman padi termasuk gen-gen penyandi ketahanan. Sampai saat ini masih sebagian kecil dari gen-gen yang ada pada tanaman padi tersebut diketahui fungsinya. Saat ini telah dikembangkan metode analisis fungsi dari gen berdasar urutan informasi pengurutan genom padi. Salah satu metode analisis fungsi gen tersebut adalah dengan cara yang dikenal dengan istilah Revers Genetic (Bouches and Hofte 1998). Metode ini berawal dari pengetahuan tentang sekuen gen kandidat, yang dilanjutkan dengan identifikasi mutan untuk gen tersebut dan analisis fungsi dari gen gen dengan menggunakan mutan tersebut. Metode ini dapat dilakukan dengan strategi over-ekspresi dari gen kandidat yang telah dipilih. Pertama-tama yang dilakukan pada metode ini adalah membuat konstruk over-ekspresi gen kandidat pada suatu vektor, kemudian mengintrodukasikan konstruk tersebut ke dalam tanaman dengan teknik transformasi, dan setelah didapatkan transforman kemudian dilakukan uji efek dari over-ekspresi gen kandidat tersebut sehingga akan diketahui fungsi dari gen spesifik tersebut.

WRKY merupakan suatu protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Tanaman padi diperkirakan mempunyai 109 gen yang termasuk dalam famili OsWRKY, tetapi banyak dari gen-gen tersebut belum diketahui fungsinya (Zhang and Wang 2005; Qiu, et al. 2007). Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Ryu et al. (2006), memperlihatkan bahwa gen OsWRKY76 mengalami peningkatan ekspresi setelah tanaman padi yang tahan diinokulasi dengan cendawan Magnaporthe grisea. Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas (Wisser et al. 2005).

Dengan mempertimbangkan hal-hal tersebut di atas, maka perlu dilakukan penelitian analisis fungsi gen OsWRKY76 dengan strategi over-ekspresi untuk ketahanan terhadap penyakit blas pada padi.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan dan menguji efek over-ekspresi gen OsWRKY76 terhadap cendawan blas (Pyricularia grisea Sacc.) pada tanaman padi.

Hipotesis Penelitian

Strategi over-ekspresi gen OsWRKY76 pada tanaman padi mampu meningkatkan ketahanan tanaman terhadap penyakit blas yang disebabkan oleh cendawan Pyricularia grisea.

TINJAUAN PUSTAKA

Penyakit Blas

Penyakit blas pada padi disebabkan oleh cendawan blas yang termasuk dalam golongan Ascomycetes dikenal dengan nama ilmiah Pyricularia grisea Sacc. (teleomorph/fase sexual: Magnaporthe grisea) (Rossman et al. 1990). Penyakit ini dianggap penting karena penyebarannya yang sangat luas (tersebar di 85 negara) dan dapat menyebabkan kerusakan yang parah apabila kondisi lingkungan sangat mendukung (Ou 1985; Scardaci et al. 1997). Sistematika cendawan blas secara lengkap adalah sebagai berikut :

Divisi : Eumycota

Subdivisi : Deuteromycotina Kelas : Hyphomycetes

Ordo : Hyphales (Moniliales) Genus : Pyricularia (Agrios 1996)

Cendawan blas menginfeksi dan membentuk bercak pada daun, leher daun, batang, malai dan biji. Bercak pada daun berbentuk belah ketupat dengan warna abu-abu atau putih pada bagian tengahnya dan dikelilingi warna coklat. Bentuk, warna dan ukuran dari bercak dapat bervariasi tergantung dari umur dan ketahanan varietas tanaman serta umur dari bercak (Ou 1985).

Siklus hidup penyakit diawali ketika spora cendawan blas menginfeksi dan menyebabkan bercak pada tanaman padi dan diakhiri ketika cendawan menghasilkan spora dan menyebarkan spora dengan bantuan angin. Apabila kondisi lingkungan sangat mendukung untuk pertumbuhannya, satu siklus hidup dapat terjadi dalam waktu satu minggu. Di bawah kondisi kelembaban dan suhu yang mendukung, cendawan blas dapat membentuk beberapa siklus hidup dan dapat menghasilkan spora yang sangat banyak pada akhir musim, sehingga dengan tingkat inokulum yang tinggi ini dapat merusak tanaman padi yang rentan. Kehilangan hasil karena penyakit ini dapat mencapai 50% (Scardaci et al. 1997).

Penyakit blas dapat muncul pada kondisi kelembaban tinggi, dengan sedikit atau tanpa angin pada malam hari dengan temperatur antara 63-73oF (22-29oC). Perkecambahan spora, pembentukan bercak, dan sporulasi terjadi pada suhu optimum antara 61-77oF (Ou 1985; Scardaci et al., 1997; www.aragriculture.org/diseases/Rice/shealthblight.htm).

Faktor lain yang mendukung perkembangan penyakit blas, antara lain adalah pemakaian pupuk nitrogen yang berlebih, tanah dalam kondisi aerobik dan cekaman kekeringan. Kandungan nitrogen yang tinggi mengakibatkan peningkatan nitrat dalam tanah, sehingga meningkatkan kerentanan tanaman terhadap penyakit ini. Nitrogen amonium akan dirubah menjadi nitrat apabila tanah mempunyai drainase dan aerasi yang baik. Kondisi tersebut banyak dijumpai pada daerah tadah hujan sehingga menyebabkan padi pada daerah tadah hujan lebih rentan terhadap penyakit blas (Scardaci et al. 1997).

Sistem Pertahanan Pada Tanaman

Di dalam tanaman dikembangkan berbagai mekanisme pertahanan untuk menanggulangi penyakit/patogen. Selama infeksi oleh patogen, tanaman mengembangkan ekspresi dari sejumlah besar gen yang terlibat di dalam pertahanan. Gen-gen tersebut mengkode protein-protein yang berhubungan dengan proteksi terhadap patogen seperti glucanase dan kitinase (Ryu et al. 2006). Untuk melawan serangan patogen, tanaman harus meregulasikan faktor transkripsi secara tepat (dalam waktu yang tepat) setelah mengenali patogen, agar dapat mengaktifkan gen-gen yang berhubungan dengan pertahanan. Mekanisme pertahanan untuk melawan penyakit dan serangan patogen tersebut dapat secara terus menerus maupun terinduksi (Ryu et al. 2006). .

Hubungan antara ketahanan pada tanaman dan sifat virulensi pada patogen dapat dijelaskan dengan konsep gen-untuk-gen (gene-for-gene concept) yang dikemukakan pertama kalinya oleh Flor (1942, 1959) yaitu setiap gen yang memberi ketahanan pada inang terdapat gen yang berhubungan dengan patogen yang memberi virulensinya, dan sebaliknya (Agrios 1996). Ketahanan tanaman

terhadap patogen dapat dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu ketahanan vertikal dan horisontal. Ketahanan vertikal bersifat monogenik dan hanya efektif terhadap ras-ras spesifik saja, dipengaruhi oleh gen mayor dominan, tingkat ketahanannya terhadap suatu ras spesifik lebih tinggi, namun sifat ketahanannya labil sehingga mudah patah. Sedangkan ketahanan horisontal bersifat poligenik dan tahan terhadap banyak ras patogen, dan sifat ketahanannya bertahan lama. Konsep gen-untuk-gene hanya ditemukan pada tumbuhan dengan bentuk ketahanan vertikal (monogenik dan oligogenik) (Agrios 1996).

Sistem ketahanan tanaman dapat dimulai dari penangkapan sinyal oleh gen reseptor ketahanan pada tanaman dan akan dihasilkan suatu reaksi spesifik antara inang dan patogen. Reaksi spesifik dapat berupa: kemampuan patogen untuk melakukan penetrasi pada jaringan luar tanaman (faktor patogen) dan penghalang fisik dari dinding sel tanaman (faktor tanaman inang) (Utami 1999). Ketahanan penyakit pada tanaman dipicu oleh adanya interaksi antara protein-protein yang dihasilkan oleh gen ketahanan di dalam tanaman (gen R) dan gen avirulen (gen Avr) dari organisme penyebab penyakit. Penelitian selama ini menunjukkan bahwa aktivasi dari protein R yang dihasilkan oleh gen R menyebabkan adanya respon ketahanan selama terjadinya infeksi oleh patogen (Ayliffe et al. 2004).

Proses persinyalan di dalam sel tanaman terjadi dalam 3 tahap, yaitu tahap penerimaan sinyal yang merupakan pendeteksian sinyal yang datang dari luar sel target, tahap inisiasi transduksi sinyal dan sinyal yang ditransduksi pada akhirnya memicu respon seluler spesifik. Sel yang menjadi sasaran sinyal kimia tertentu mempunyai molekul protein reseptor yang akan mengenali molekul sinyal tersebut. Pengikatan molekul sinyal menyebabkan protein reseptor akan mengaktifkan molekul seluler lainnya (Campbell et al. 2002). Respon-respon pertahanan tanaman diatur melalui suatu jaringan persinyalan yang melibatkan molekul-molekul persinyalan tanaman yang endogenus seperti asam salisilat, asam jasmonat, ethilen dan asam absisat (Ryu et al. 2006).

Lebih lanjut, beberapa penelitian tentang ketahanan pada tanaman secara molekuler menunjukkan adanya interaksi antara produk gen Avr dari patogen dan produk gen R dari tanaman. Gen Avr patogen menjadi protein elicitor yang berinteraksi secara fisik dengan protein reseptor kinase (NBS-LRR) yang

merupakan produk gen R dari tanaman (Ayliffe et al. 2004). Protein reseptor kinase yang diaktifkan melalui interaksi ini selanjutnya bisa mengaktifkan protein-protein yang lain seperti faktor transkripsi melalui mekanisme fosforilasi. Pada gilirannya faktor transkripsi ini mengaktifkan ekspresi gen-gen yang terlibat langsung dalam memberikan proteksi pada tanaman, seperti kitinase dan glucanase. Faktor transkripsi yang sudah diketahui terlibat dalam mekanisme pertahanan tanaman terhadap patogen diantaranya adalah WRKY, ERF, bZIP, dan MYB (Chakravarthy et. al. 2003). Bukti-bukti yang telah ada menunjukkan bahwa perbedaan antara varietas tahan dan peka adalah pada gen R yang menyandi protein reseptor, sementara tidak ditemukan perbedaan pada mekanisme molekuler di bawahnya (Vidhyasekaran 2002).

Saat ini sebanyak 37 gen ketahanan mayor (gen R) terhadap blas telah berhasil teridentifikasi. Enam gen resisten/ketahanan yaitu Pib, Pita, Pi2, Pi9, Piz-t, dan Pi-d2 yang diduga berfungsi dalam pengenalan patogen, telah berhasil dikloning (Dai et al. 2007). Gen-gen ketahanan tersebut (Pi) berinteraksi secara spesifik dengan ras-ras tertentu dari cendawan Pyricularia grisea (Ou 1985).

Pengaturan Aktivitas Faktor Transkripsi di dalam Tanaman

Menurut Schwechheimer dan Bevan (1998) mekanisme yang dominan untuk mengontrol ekspresi gen dalam eukariot adalah regulasi atau pengaturan pada tingkat transkripsi. Lebih lanjut mereka berpendapat bahwa regulasi yang bersifat transkripsional dari ekspresi gen diperantarai oleh faktor-faktor transkripsi yang mengaktifkan atau menekan suatu ekspresi. Gen-gen yang berperan sebagai aktivator dan gen-gen yang berperan sebagai represor bekerja melalui suatu mekanisme tertentu (termasuk interaksi antara DNA-protein, interaksi antara protein-protein, dan modifikasi dari struktur kromatin). Regulasi (pengaturan) secara transkripsional dari ekspresi gen diperantarai oleh adanya pengenalan yang spesifik dari cis-acting element yang ada pada bagian promotor dari gen target terhadap trans acting specific sequent DNA-binding factor dari gen regulator. Faktor transkripsi dapat meregulasikan banyak gen untuk mengekspresikan

sifat-sifat tertentu. Faktor transkripsi mempunyai kemampuan untuk menempel pada bagian promotor dari gen-gen target dan meningkatkan atau menekan transkripsinya.

Dasar Transformasi Tanaman Melalui Agrobacterium

Teknologi untuk mentransfer suatu gen ke dalam tanaman pada dasarnya dibedakan menjadi dua, yaitu secara langsung dan tidak langsung. Transfer gen secara langsung dapat dilakukan dengan penembakan partikel, elektroporasi, atau dengan PEG (Herman 2002). Sedangkan transfer gen secara tidak langsung dapat dilakukan dengan bantuan bakteri Agrobacterium tumefaciens.

Metode transformasi tanaman melalui bakteri Agrobacterium tumefaciens saat ini telah berkembang pesat. A. tumefaciens merupakan bakteri tanah gram negatif yang bersifat patogen, secara alami menginfeksi bagian luka dari tanaman yang termasuk dalam golongan dikotiledon, dan menyebabkan penyakit tumor ‘crown gall’ pada tanaman tersebut (Riva et al. 1998). A tumefaciens menginfeksi tanaman dan mengintroduksikan sebagian dari plasmid-Ti (tumor inducing) yang disebut dengan T-DNA (transfer DNA) ke dalam genom tanaman. Fragmen T-DNA yang berpindah dari sel bakteri ke dalam sel tanaman akan terintegrasi secara stabil dalam genom inti. Penelitian selama ini menunjukkan bahwa T-DNA yang terintegrasi di dalam genom inti tanaman adalah sama dengan T-DNA yang terdapat pada plasmid Ti. Hal ini menunjukkan bahwa bagian dari plasmid Ti yang masuk ke dalam tanaman tidak mengalami perubahan sekuen di dalam sel tanaman. Terintegrasinya T-DNA ke dalam genom tanaman dapat 1 kopi atau lebih dari 1 kopi, dan lokasi di dalam genom tanaman adalah secara acak (Bevan 1984; Murdiyatmo 1993; Riva et al.1998).

Fragmen T-DNA di dalam plasmid Ti diapit oleh sederetan nukleotida (25 pb) dengan urutan basanukleotida hampir sama yang letaknya pada kedua ujung T-DNA tersebut. Sekuen tersebut dinamakan border sequens (sekuen batas), sebelah kanan disebut right border (RB) dan sebelah kiri disebut left border (LB) (Murdiyatmo 1993). T-DNA mengandung gen-gen untuk sintesis zat pengatur

tumbuh tanaman, sehingga menyebabkan pembelahan sel yang tidak terkendali dan menghasilkan penyakit crown gall (Ditt et al. 2005). Gen-gen yang ada pada daerah T-DNA adalah tms1, tms2, dan tmr, dimana produk-produk gen tersebut dapat meniadakan fungsi regulasi yang normal dari metabolisme tanaman dalam mensintesa fitohormon, sehingga dapat menyebabkan fenotipe tumor ‘crown gall’ (Murdiyatmo 1993).

Proses integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman diatur dan dikontrol oleh beberapa gen yang dikenal dengan gen Vir pada plasmid Ti. Gen-gen Vir tersebut diaktifkan oleh Agrobacterium melalui deteksi senyawa fenolik (misalnya asetosiringon) yang dihasilkan dari jaringan tanaman yang luka. Gen-gen Vir ini tidak ditemukan pada sel yang ditransformasi oleh Agrobacterium (Bevan 1984). Gen-gen Vir berperan sebagai trans acting factor yang mengenali bagian terminal repeat sequences dari T-DNA pada bagian cis element (bagian border), sehingga selanjutnya akan terjadi proses-proses untuk transfer T-DNA ke dalam sel tanaman (Bevan 1984; Riva et al.1998).

Dengan pengetahuan mengenai sistem transfer gen dari Agrobacterium secara alami tersebut, saat ini Agrobacterium digunakan untuk membantu dalam pembentukan tanaman transgenik. Namun demikian sebelumnya perlu dilakukan modifikasi pada bagian T-DNA dari plasmid Ti sehingga terbentuk vektor non-oncogenik. Vektor non-oncogenik adalah plasmid Ti yang telah dihilangkan bagian gen-gen penyebab tumor pada T-DNA (yang terletak diantara RB dan LB). Bagian T-DNA yang hilang tersebut kemudian diganti dengan gen kandidat yang diinginkan. Pada dasarnya vektor non-oncogenik digolongkan 2 tipe, yaitu tipe cis dan trans. Pada tipe cis antara T-DNA dan gen-gen Vir terletak pada plasmid yang sama (vektor ko-integratif). Sedangkan pada tipe trans T-DNA dan gen-gen Vir terletak pada plasmid yang terpisah (vektor biner) (Murdiyatmo, 1993).

Saat ini telah banyak penelitian yang menghasilkan tanaman padi transgeik untuk berbagai tujuan melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens diantaranya adalah perakitan tanaman padi tahan terhadap hama wereng coklat dan penggerek batang padi dan ‘leaffolder’ (Saha et al. 2006; Cheng et al. 1998; Qiu et al. 2001). Menurut Opabode (2006) efisiensi transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens dalam pembentukan tanaman transgenik sangat

tergantung dari beberapa hal diantaranya adalah genotipe tanaman, strain Agrobacterium, vektor plasmid, senyawa penginduksi gen Vir, komposisi medium transformasi, dan suhu lingkungan.

KONSTRUKSI DAN INTRODUKSI KONSTRUK

OVER-EKSPRESI GEN

OsWRKY76

MELALUI

AGROBACTERIUM

TUMEFACIENS

PADA TANAMAN PADI NIPPONBARE

ABSTRAK

ANIVERSARI APRIANA. Konstruksi dan Introduksi Konstruk Over-ekspresi Gen OsWRKY76 melalui Agrobacterium tumefaciens pada Tanaman Padi Nipponbare. Dibimbing oleh SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, dan KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.

Perbaikan sifat tanaman dapat dilakukan dengan pemuliaan tanaman klasik atau dengan rekayasa genetik. WRKY merupakan protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas.

Penelitian ini bertujuan untuk merakit dan mengintroduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman padi Nipponbare melalui bantuan A. tumefaciens. Konstruk pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 telah berhasil dirakit dan telah ditransformasikan ke dalam kalus embriogenik tanaman padi cv. Nipponbare melalui bantuan A. tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105. Dari transformasi tersebut dihasilkan 126 galur independen dan strain Agl-1 lebih efisien dalam menghasilkan galur independen dibandingkan dengan strain EHA 105. Analisis PCR dari 25 galur independen yang diuji secara acak menunjukkan semua positif mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76.

ABSTRACT

ANIVERSARI APRIANA. Development and Introduction of Over-expression Construct of OsWRKY76 Gene through Agrobacterium tumefaciens in Rice. Guided by SUDARSONO, NURUL KHUMAIDA, and KURNIAWAN RUDI TRIJATMIKO.

Plant genetic improvement can be done through classical breeding or genetic engineering. WRKY is a transcription factor involved in regulating plant defense responses. OsWRKY76 gene is located in a narrow segment of chromosome 9 which is identified previously to be related to wide spectrum resistance in rice.

The aim of this research was to assemble an over-expression construct of OsWRKY76 gene and introduce it into rice through Agrobacterium-mediated transformation. A construct of pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 has been successfully assembled and transformed into embryogenic calli of rice cv. Nipponbare using A. tumefaciens strain Agl-1 and EHA 105. A number of 126 independent lines has been produced, in which Agl-1 showed higher efficiency than EHA 105. PCR analysis of randomly selected 25 independent lines showed that all of them positively contained the over-expression construct of the OsWRKY76 gene.

PENDAHULUAN

Perbaikan suatu sifat tanaman dapat dilakukan melalui modifikasi genetik baik dengan pemuliaan secara konvensional maupun dengan bioteknologi khususnya teknologi rekayasa genetik (Herman 2002). Pemuliaan secara konvensional memperbaiki sifat tanaman dengan cara menyilangkan antara kultivar. Dengan cara ini gen yang berpindah bukan hanya yang mengontrol sifat yang diinginkan saja, namun juga gen-gen lain (yang tidak diiginkan), sehingga hasil yang diperoleh sering tidak sesuai dengan yang diharapkan. Selain itu, untuk mendapatkan sifat yang diinginkan dari proses persilangan tersebut memakan waktu yang cukup lama, karena membutuhkan seleksi terus menerus yang memakan waktu, biaya, dan tempat yang tidak sedikit. Teknologi rekayasa genetik tanaman bekerja pada tingkat DNA, sehingga melalui teknik ini memungkinkan untuk mentransfer gen spesifik yang diinginkan ke dalam genom tanaman. Dengan teknik ini kendala yang dihadapi dari sistem konvensional dapat dipecahkan, misalnya adanya hambatan seksual, karena dengan teknik ini dapat diintroduksikan gen dari spesies tanaman maupun gen dari organisme lain ke dalam genom tanaman.

Teknologi untuk mentransfer suatu gen dibedakan menjadi dua, yaitu secara langsung dan tidak langsung. Transfer gen secara langsung dapat dilakukan dengan penembakan partikel, elektroporasi, atau dengan PEG (Herman 2002). Sedangkan transfer gen secara tidak langsung paling banyak dilakukan dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium mampu mentransfer gen ke dalam genom tanaman. Gen yang ditransfer tersebut terletak pada bagian T-DNA (transfer DNA) dari plasmid Ti (tumor inducing).

Keberhasilan teknologi rekayasa genetik tanaman tergantung dari 3 hal, yaitu gen yang akan diintroduksikan, metode transformasi dan regenerasi tanaman, ekspresi transgen di dalam sel tanaman target. Gen yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman harus dapat diinsersikan ke genom tanaman, diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya (Herman 1999). Sel atau jaringan yang ditransformasi harus dapat

diregenerasikan menjadi tanaman utuh. Regenerasi tanaman dapat dilakukan baik secara orgnogenesis ataupun embriogenesis (Sticklen 1991; Zhong et al. 1991).

Dengan telah selesainya pengurutan DNA dari genom tanaman padi memungkinkan untuk mengetahui keberadaan, macam dan sifat dari gen-gen yang ada pada tanaman padi termasuk gen-gen penyandi ketahanan. Sampai saat ini masih sebagian kecil dari gen-gen yang ada pada tanaman padi tersebut diketahui fungsinya. Saat ini telah dikembangkan metode analisis fungsi dari gen berdasar urutan informasi pengurutan genom padi. Salah satu metode analisis fungsi gen tersebut adalah dengan cara yang dikenal dengan istilah Revers Genetic (Bouches and Hofte 1998). Metode ini berawal dari pengetahuan tentang sekuen gen kandidat, yang dilanjutkan dengan identifikasi mutan untuk gen tersebut dan analisis fungsi dari gen-gen dengan menggunakan mutan tersebut.

Faktor transkripsi yang juga biasa dikenal dengan istilah sequence-specific DNA binding factor adalah merupakan suatu protein yang melekat secara spesifik pada DNA dengan menggunakan daerah yang disebut dengan DNA binding domain yang merupakan bagian dari sistem yang mengontrol transfer transkripsi. Faktor transkripsi dalam menjalankan fungsinya secara tunggal atau bersama-sama dengan protein-protein yang lain yang bergabung secara kompleks, berbersama-sama RNA polimerase dapat meningkatkan (bertindak sebagai activator) atau menekan (bertindak sebagai repressor) transkripsi. Faktor transkripsi mempunyai fungsi di dalam pengaturan pada basal transkripsi, perkembangan sel dan jaringan, memberi respon terhadap sinyal-sinyal interseluler, lingkungan dan siklus sel.

Regulasi (pengaturan) dari ekspresi gen diperantarai oleh adanya pengenalan yang spesifik atas cis-acting element yang ada pada bagian promotor dari gen target terhadap trans acting specific sequent DNA-binding factor dari gen regulator (Schwechheimer and Bevan 1998). Beberapa kelas dari faktor transkripsi terkait dengan respon pertahanan (Chen 2004). Faktor transkripsi dapat meregulasikan banyak gen untuk mengekspresikan sifat-sifat tertentu. Faktor transkripsi mempunyai kemampuan untuk menempel pada bagian promotor dari gen-gen target dan meningkatkan atau menekan transkripsinya.

Saat ini dimungkinkan untuk melakukan rekayasa genetik untuk perbaikan ketahanan tanaman terhadap patogen melalui modifikasi tingkat ekspresi dari

faktor transkripsi yang terlibat dalam mekanisme pertahanan. Untuk memodifikasi tingkat ekspresi dapat dilakukan dengan strategi over-ekspresi dari gen regulator yang terkait dengan sistem pertahanan tanaman.

Beberapa penelitian telah menunjukkan keberhasilan dalam mendapatkan tanaman padi tahan penyakit dengan menggunakan teknik transformasi dengan strategi overekspresi. Penelitian overekspresi dari gen penyandi protein regulator Mitogen-activated protein kinase-1 (MK1) dari Capsicum annuum dan OsMAPK5 meningkatkan ketahanan terhadap cendawan blas pada padi. Overekspresi dari gen MK1 dan OsMAPK5 ini menyebabkan peningkatan ekspresi dari gen-gen yang terkait dengan patogenisitas yaitu PR1a, PR1b, dan PR10 yang mungkin bertanggung jawab terhadap peningkatan ketahanan terhadap blas (Xiong dan Yang 2003; Lee et al. 2004). Sedangkan penelitian overekspresi gen OsWRKY13 yang dilakukan oleh Qiu et al. (2007) menunjukkan hasil peningkatan ketahanan tanaman padi terhadap patogen blas dan blb. Penelitian selanjutnya (Qiu et al. 2007) menunjukkan bahwa OsWRKY13 bertindak sebagai activator dari jalur persinyalan asam salisilat dan bertindak sebagai repressor (penekan) dari jalur persinyalan asam jasmonat. OsWRKY13 dapat secara langsung maupun tidak langsung mengatur ekspresi dari gen-gen-gen upstream maupun downstream dari asam salisilat dan asam jasmonat. Asam salisilat dan asam jasmonat merupakan molekul yang telah diketahui terlibat dalam persinyalan untuk mengaktifkan gen-gen yang terlibat dalam pertahanan terhadap berbagai serangan patogen-gen pada tanaman (Ryu et al. 2006; Qiu et al. 2007).

WRKY merupakan suatu protein faktor transkripsi yang terlibat dalam regulasi jalur respon pertahanan tanaman. Famili atau keluarga faktor transkripsi WRKY banyak berperan di dalam merespon stres biotik dan abiotik, proses penuaan, perkecambahan biji, dan perkembangan trikoma (Zhang et al. 2004; Chen 2004; Franzisca et. al. 2004). Banyak protein WRKY yang terlibat dalam pertahanan terhadap serangan patogen tanaman (Ryu et al. 2006). Protein WRKY adalah protein yang terdiri dari ± 60 asam amino yang mengandung N-terminal heptapeptida WRKYGQK (secara berurutan adalah asam amino: Triptopan, Arginin, Lisin, Tirosin, Glisin, Glutamin, dan Lisin) dan satu C-terminal yang berupa struktur yang menyerupai “zinc-finger”. Untuk dapat mengatur ekspresi

gen, protein WRKY mengikat secara spesifik pada urutan DNA (T)(T)TGACC(C/T) yang dikenal dengan “W-box” yang terdapat pada daerah promotor dari gen-gen target. Sejumlah gen yang berhubungan dengan pertahanan, termasuk gen PR (pathogenesis releted), mengandung “W-box” pada daerah promotornya. Dengan kemampuan menempel pada bagian promoter dari gen target tersebut, protein WRKY akan mampu menekan atau meningkatkan transkripsi dari gen target (Zang and Wang 2005; Ryu et al. 2006).

Pada tanaman padi diperkirakan terdapat 109 gen yang termasuk dalam famili OsWRKY, tetapi banyak dari gen-gen tersebut belum diketahui fungsinya (Zhang and Wang 2005; Qiu et al. 2007). Gen OsWRKY76 terletak pada segmen di kromosom 9 tanaman padi yang sebelumnya diidentifikasi terkait dengan ketahanan berspektrum luas (Wisser et al. 2005).

Untuk mendukung kegiatan rekayasa genetik tanaman, teknologi kloning gen yang bertujuan untuk mendapatkan konstruk dari kandidat gen adalah salah satu kegiatan yang penting dilakukan. Suatu gen dapat berfungsi dengan baik (dapat melakukan fungsi gennya) apabila mempunyai bagian-bagian yang disebut promotor, unit transkripsional, dan terminator. Promotor adalah suatu bagian dari gen yang berfungsi untuk mengatur proses transkripsi. Unit transkripsional adalah bagian dari gen yang ditranskripsikan sehingga menghasilkan produk protein. Terminator adalah bagian dari gen yang mengakhiri proses transkripsi.

Ada beberapa tahapan yang harus dilakukan dalam kegiatan kloning gen, yaitu : isolasi DNA (gen), penyisipan DNA ke dalam sistem vektor untuk membentuk vektor rekombinan dan introduksi vektor rekombinan yang membawa sisipan ke dalam sel inang. Sedangkan perangkat yang diperlukan dalam kloning ini adalah vektor (biotransport) yaitu molekul pembawa DNA, enzim restriksi dan enzim ligase (Campbell et al. 2002).

Kegiatan perakitan tanaman transgenik yang melibatkan transfer DNA asing dari luar ke dalam tanaman target keberhasilannya selain tergantung pada gen yang dimasukkan ke dalam tanaman target, sistem transformasi dan regenerasi tanaman transgenik, juga sangat tergantung pada tingkat ekspresi dari gen yang dimasukkan di dalam tanaman target. Teknik transfer gen melalui Agrobacterium telah banyak dilakukan untuk pengembangan tanaman tahan

terhadap hama dan penyakit. A tumefaciens menginfeksi tanaman dan mengintroduksikan sebagian dari plasmid-Ti (tumor inducing) yang disebut dengan T-DNA (transfer DNA) ke dalam genom tanaman. Fragmen T-DNA yang berpindah dari sel bakteri ke dalam sel tanaman akan terintegrasi secara stabil dalam genom inti. Proses integrasi T-DNA ke dalam genom tanaman diatur dan dikontrol oleh beberapa gen yang dikenal dengan gen Vir pada plasmid Ti.

Menurut Opabode (2006) efisiensi transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens dalam pembentukan tanaman transgenik sangat tergantung dari beberapa hal diantaranya adalah genotipe tanaman, strain Agrobacterium, vektor plasmid biner, senyawa penginduksi gen Vir, komposisi medium transformasi, dan suhu lingkungan.

Pada penelitian ini dilakukan konstruksi dan introduksi konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman padi Nipponbare melalui A. tumefaciens. Adapun tujuan dari kegiatan ini adalah merakit (mengkonstruksi) dan mengintroduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam tanaman padi Nipponbare melalui A. tumefaciens.

BAHAN DAN METODE

1. Waktu dan Tempat penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rumah Kaca Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB- BIOGEN) di Jl. Tentara Pelajar 3A, Cimanggu, Bogor 16111. Penelitian ini dilakukan pada bulan September 2006- Oktober 2007.

2. Bahan Penelitian

2.1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76

Bahan penelitian yang digunakan pada pembuatan konstruk vektor over-ekspresi gen OsWRKY76 meliputi : tanaman padi varietas Nipponbare, bahan isolasi DNA padi, primer spesifik untuk gen OsWRKY76, bahan untuk melakukan PCR, plasmid pGEM-T Easy, enzim restriksi, bahan untuk isolasi plasmid, enzim T4-DNA ligase, bahan untuk transformasi plasmid ke vektor, elektroforesis, vektor biner pCAMBIA-1301, plasmid pSP13, plasmid pST8, bakteri E. coli strain DH5α, bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105.

2.2. Transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah benih padi varietas Nipponbare sebagai sumber eksplan, bahan untuk kegiatan kultur jaringan dan transformasi, zat pengatur tumbuh, antibiotik dan bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 rekombinan yang mengandung vektor over-ekspresi gen OsWRKY76.

2.3. Analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan PCR.

Untuk melakukan kegiatan ini bahan yang digunakan adalah DNA padi Nipponbare tipe liar, DNA padi Nipponbare putatif transgenik, bahan untuk melakukan PCR seperti PCR kit, elektroforesis, primer higromisin.

3. Metode Penelitian

Pada penelitian ini dilakukan 3 rangkaian kegiatan yang berkesinambungan, yaitu perakitan konstruk vektor over-ekspresi gen

OsWRKY76, transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens, dan analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan teknik PCR (Gambar 1).

Gambar 1. Diagram alur penelitian

3.1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76

Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk merakit konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam vektor ekspresi.

Prosedur urutan kerja dari kegiatan konstruksi gen OsWRKY76 dimulai dari mendisain primer untuk gen OsWRKY76 dan diakhiri dengan mengintoduksikan konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam A. tumefaciens. Prosedur selengkapnya adalah sebagai berikut (Gambar 2):

Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76

Transformasi padi Nipponbare dengan A. tumefaciens

Analisis molekuler tanaman padi transgenik dengan PCR

LIGASI

Disain primer Isolasi plasmid pSP8, pST13 dan pCAMBIA- 1301 dari E.coli

Amplifikasi gen OsWRKY76 dari

Nipponbare dengan PCR Pemotongan pSP8, pST13 dan pCAMBIA -1301 dengan enzim restriksi yang sesuai

Purifikasi fragmen gen OsWRKY76 dari gel agarose fragmen

gen OsWRKY76 Purifikasi fragmen promotor, terminator danpCAMBIA-13 dari gel agarose

Kloning fragmen ke pGEM-T Easy

Pemotongan ujung-ujung fragmen Fragmen promotor, terminator gen OsWRKY76 dengan enzim restriksi dan pCAMBIA-1301

yang sesuai

Purifikasi fragmen gen OsWRKY76 dari gel agarose

Fragmen gen OsWRKY76

Plasmid pCAMBIA-1301 rekombinan

Hasil ligasi ditransformasi ke E.coli

Isolasi plasmid verifikasi plasmid rekombinan

Transformasi ke Agrobacterium tumefaciens strain Agl-l dan EHA-105

Untuk kegiatan transformasi padi

Gambar 2. Bagan alur prosedur kegiatan konstruksi over-ekspresi gen OsWRKY76

Fragmen gen OsWRKY76 di dapatkan dari hasil amplifikasi DNA genom padi varietas Nipponbare menggunakan primer spesifik yang telah dirancang menggunakan software PRIMER. Perancangan primer berdasar sekuen DNA genom yang diperoleh dari bank gen melalui perunutan situs di internet (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov) . Pasangan primer yang digunakan adalah :

Forward primer = 5’-AATAGGATCCTGGTCGTCGTCGTCGTCGATG-3’ dan

Reverse primer = 5’-AGTCAGTCGACGCTAGAATTCGGGCAGCTTC-3’.

Pasangan primer tersebut memasukkan situs pemotongan enzim restriksi BamHI dan SalI ke produk amplifikasi pada bagian 5’ dan 3’yang digunakan untuk keperluan ligasi.

Reaksi PCR dilakukan dalam 20 ul larutan yang mengandung bahan-bahan sebagai berikut : 2 ul 10x buffer PCR yang mengandung MgCl2 (Roche), 4 ul 5x

GC-rich Solution (Roche), 0,4 ul dNTPs mix (10 mM) (Promega), primer Forward dan Reverse spesifik untuk gen OsWRKY76 masing-masing0,5 ul (100 ng/ul) , 0,2 ul Enzim Taq-polimerase (5 U/ul) (Fast-start/Roche). DNA padi Nipponbare tipe liar yang diamplifikasi sebanyak 10 l (konsentrasi 10 ng/ l). Reaksi PCR menggunakan mesin PCR PTC-100 (MJ Research, Inc.). Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi pada 94oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada 94oC selama 1 menit, penempelan primer pada 55oC selama 1 menit, dan pemanjangan pada 72oC selama 2 menit. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72oC selama 5 menit.

Sebanyak 15 l produk PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis pada gel agarose 1% (w/v). Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 dengan ukuran sekitar 1.200 bp pada gel agarose dipotong dan dipurifikasi dengan menggunakan Gel Extraction Kit (Qiagen) mengikuti prosedur yang direkomendasikan oleh perusahaan. Fragmen gen OsWRKY76 tersebut kemudian diligasi ke dalam plasmid pGEM-T Easy (Promega) dan ditransformasikan ke dalam E. coli. Koloni hasil transformasi yang tumbuh di media seleksi kemudian ditumbuhkan di media LB cair dan dilakukan isolasi plasmid dengan metode lisis alkali. Plasmid yang diperoleh kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi BamHI dan SalI. Hasil pemotongan diseparasi dengan elektroforesis dan fragmen

berukuran sekitar 1.200 bp dipurifikasi menggunakan Gel Extraction Kit (Qiagen).

Fragmen promoter 35S-CaMV yang berawal dari -526 sampai situs awal transkripsi (TTS/transcription start site) diperoleh sebagai fragmen 0,55 kb HindIII-BamHI dari turunan pBS-SK+ dari pDH51 (Pietrzak et al. 1986). Fragmen terminator 35S-CaMV diperoleh sebagai fragmen 0,21 kb SalI-EcoRI dari turunan pBS-SK+ dari pDH51 (Pietrzak et al. 1986). Plasmid pCAMBIA -1301 digunakan sebagai vektor biner, yang untuk keperluan ligasi dipotong dengan enzim restriksi HindIII-EcoRI. Fragmen-fragmen promotor 35S-CaMV, terminator 35S-CaMV, pCAMBIA-1301 dipurifikasi dari gel menggunakan Gel Extraction Kit (Qiagen).

Konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 dirakit dengan meligasikan fragmen-fragmen individual (promotor, gen OsWRKY76, dan terminator) dengan ujung-ujung kohesif yang kompatibel bersama-sama ke dalam vektor biner dalam satu reaksi. Plasmid rekombinan tersebut kemudian ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli kompeten yang disiapkan menggunakan CaCl2 (0,1 M) dengan

metode heat shock (Sambrook et al., 1989). Koloni-koloni tunggal yang diperoleh dari hasil transformasi tersebut kemudian ditumbuhkan dalam media LB cair yang mengandung antibiotik kanamisin 100 mg/L dan diisolasi plasmidnya dengan menggunakan metode lisis-alkali (Sambrook et al. 1989). Keberhasilan konstruksi diverifikasi dengan memotong plasmid rekombinan dengan menggunakan enzim restriksi yang sesuai. Plasmid rekombinan ini kemudian dimasukkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 dengan metode ‘freeze-thaw’.

Gambar 3. Skema konstruk 35SCaMV::OsWRKY76::35SCaMV dengan situs pemotongan enzim restriksi dan ukuran dari masing-masing fragmen

RB

OsWRKY76

35SP 35ST

LB

550 bp 490 bp 710 bp 210

3.2. Transformasi padi Nipponbare dengan Agrobacterium

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengintroduksikan rakitan konstruk vektor over-ekspresi gen OsWRKY76 ke dalam genom tanaman padi varietas Nipponbare menggunakan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Metode transformasi yang digunakan mengikuti prosedur yang diuraikan dalam Greco et al. (2001) dengan sedikit modifikasi.

Benih padi varietas Nipponbare (Japonica) dikupas sekamnya dan disterilisasi dengan larutan alkohol 70% selama 1 menit. Kemudian biji direndam menggunakan larutan NaOCl komersial dengan konsentrasi 5,25% selama 30 menit, dicuci dengan akuades steril sebanyak 6 kali masing-masing selama 15 menit, dan direndam semalam dalam aquades steril pada suhu ruang. Biji padi kemudian ditanam pada media induksi kalus yaitu media dasar NB (Lampiran 1) yang mengandung 30 g/L sukrosa , 2,5 mg/L hormon 2,4-D, dan dipadatkan dengan 2,5 g/L Phytagel . Setelah 25-30 hari kalus yang tumbuh disubkultur pada media induksi kalus baru. Dua minggu kemudian kalus yang tumbuh diseleksi dengan menggunakan mikroskop binokuler untuk mendapatkan kalus yang embriogenik. Kalus embriogenik ini digunakan sebagai bahan untuk transformasi dengan menggunakan Agrobacterium yang telah mengandung plasmid rekombinan yang membawa konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76.

Transformasi dilakukan dengan merendam kalus-kalus embriogenik ke dalam suspensi bakteri Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 yang mengandung konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76. Biakan bakteri yang digunakan untuk transformasi berasal dari biakan koloni tunggal yang ditumbuhkan pada 5 mL media YEP (Lampiran 2) cair yang mengandung 100 mg/L antibiotik kanamisin dan 75 mg/L karbenisilin. Suspensi bakteri yang tumbuh kemudian ditumbuhkan pada 3-4 petri media AB (Lampiran 2) padat yang mengandung 100 mg/L antibiotik kanamisin dan 75 mg/L karbenisilin selama 3 hari pada suhu 28oC. Biakan bakteri tersebut disuspensikan pada 50 mL media ko-kultivasi cair yaitu media dasar R2 (Lampiran 1) yang mengandung 10 g/L glukosa, 100 uM asetosiringon dan 2,5 mg/L hormon 2,4-D dengan pH 5,2. Kepadatan sel bakteri yang digunakan untuk transformasi diperkirakan mencapai OD600=1 (3-5x109 sel/mL). Suspensi bakteri inilah yang digunakan untuk

merendam kalus. Perendaman kalus-kalus dilakukan selama 10-15 menit. Kalus-kalus kemudian dikeringkan dengan mengguling-gulingkannya di atas kertas saring dan ditanam pada media ko-kultivasi padat selama 3 hari dengan kondisi pemeliharaan dalam keadaan gelap pada suhu 16-18oC. Kemudian kalus-kalus dipindahkan pada media seleksi yaitu media R2 yang mengandung 2,5 mg/L 2,4-D, 400 mg/L antibiotik cefotaksim, 100 mg/L vancomisin, 50 mg/L higromisin, dan 30 g/L sukrosa. Dua minggu kemudian kalus-kalus dipindahkan ke media seleksi yang baru. Kalus-kalus yang tahan di media seleksi kemudian disubkultur ke media EIM (media induksi embrio) (Lampiran 1) yang mengandung 100 mL/L air kelapa, 2,5 mg/L 2,4-D, dan 100 mg/L antibiotik cefotaksim, 100 mg/L vancomisin, dan 50 mg/L higromisin dan dipelihara dalam keadaan gelap. Setelah 10-14 hari kalus- kalus embriogenik diseleksi dengan menggunakan mikroskop binokuler dan dipindahkan ke media regenerasi yaitu media dasar LS yang mengandung sukrosa 40 g/L, 0,5 mg/L IAA + 0,3 mg/L BAP, 30 mg/L higromisin, 100 mg/L cefotaksim, 100 mg/L vancomisin. Dua minggu kemudian kalus disubkultur ke media regenerasi yang baru. Kalus-kalus dipelihara sampai tumbuh tunas. Setelah ukuran tunas kurang lebih 2 cm dipindahkan ke media perakaran yang mengandung 40 mg/L antibiotik higromisin. Apabila akar planlet sudah berkembang, planlet dikeluarkan dari botol dan diaklimatisasi di dalam tabung reaksi yang berisi air. Seminggu kemudian planlet dipindahkan ke bak persemaian yang berisi tanah lumpur. Dua minggu kemudian planlet dipindah ke dalam ember yang berisi tanah lumpur yang telah ditambah pupuk kandang di rumah kaca.Tanaman putatif transgenik dipelihara sampai menghasilkan biji. Parameter yang diamati adalah jumlah kalus awal yang ditransformasi, jumlah kalus yang terseleksi pada media seleksi, jumlah kalus yang berhasil beregenerasi membentuk planlet, jumlah tanaman, jumlah galur independen yang berhasil diperoleh.

3.3. Analisis molekuler tanaman transgenik dengan teknik PCR

Tujuan dari kegiatan ini adalah untuk mengetahui apakah konstruk over-ekspresi gen OsWRKY76 berhasil diintroduksikan di dalam jaringan tanaman padi varietas Nipponbare. Analisi PCR adalah metode deteksi secara cepat untuk mengetahui keberadaan transgen di dalam jaringan tanaman putatif transgenik.

DNA genom diisolasi dari daun padi dengan metode miniprep SDS-Urea (Pereira and Aarts 1998). DNA dari tanaman padi transgenik generasi T0 dan T1 digunakan untuk analisis molekuler menggunakan teknik PCR dengan primer

spesifik higromisin yaitu primer Forward :

5’-GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-3’ dan primer Reverse : 5’- GCATCTCCCGCCGTGCAC- 3’.

Reaksi PCR menggunakan mesin PCR PTC-100 (MJ Research, Inc.). Reaksi PCR dilakukan dalam 20 ul larutan yang mengandung bahan-bahan sebagai berikut : 2 ul 10x buffer PCR yang mengandung MgCl2 (Roche), 0,4 ul

dNTPs mix (10 mM) (Promega), primer spesifik untuk gen higromisin masing-masing (Forward dan Reverse) 1 ul (5 uM), 0,16 ul Enzim Taq-polimerase (5 U/ul) (Fast-start/Roche). DNA padi Nipponbare transgenik yang diamplifikasi sebanyak 5 ul (konsentrasi 10 ng/ l). Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi pada 94oC selama 4 menit, dilanjutkan dengan 35 siklus denaturasi pada 94oC selama 30 detik, penempelan primer pada 60oC selama 30 detik, dan pemanjangan pada 72oC selama 45 detik. Pada tahap akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada 72oC selama 5 menit. Sebanyak 15 l produk PCR diseparasi dengan teknik elektroforesis pada gel agarose 1% (w/v), dicat dengan EtBr dan divisualisasi dengan sinar UV menggunakan instrumen CHEMIDOC.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Kegiatan rekayasa genetik tanaman keberhasilannya tergantung pada beberapa hal, diantaranya adalah gen yang akan diintroduksikan, metode transformasi, sistem regenerasi tanaman dan seleksi, serta ekspresi dari gen yang dimasukkan ke dalam genom tanaman target.Gen asing yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman harus dapat diinsersikan ke genom tanaman, diekspresikan, dan tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel berikutnya (Herman 1999).

1. Konstruksi vektor over-ekspresi gen OsWRKY76

Pada penelitian ini, konstruk yang dirakit adalah gen OsWRKY76. Gen ini dipilih berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Ryu et al. (2006), yang menunjukkan bahwa gen OsWRKY76 adalah salah satu gen-gen yang termasuk keluarga OsWRKY yang memperlihatkan peningkatan ekspresi pada tanaman padi yang tahan setelah diinokulasi dengan cendawan Pyricularia grisea. Gen OsWRKY76 ini terletak pada segmen di kromosom 9 yang oleh Wisser et al. (2005) diidentifikasi terkait dengan ketahanan penyakit spektrum luas.

Pada kegiatan pertama ini dilakukan konstruksi gen kandidat OsWRKY76 di bawah kendali promotor 35SCaMVke dalam vektor ekspresi pCAMBIA-1301 yang meliputi serangkaian kegiatan yaitu:

1.1. Amplifikasi dan purifikasi fragmen gen OsWRKY76

Penelitian perakitan vektor over-ekspresi diawali dengan mengamplifikasi DNA genom tanaman padi dengan primer untuk gen OsWRKY76 yang telah didisain sebelumnya, menggunakan mesin PCR. Primer yang didisain menambahkan situs pemotongan enzim restriksi BamHI dan SalI ke produk amplifikasi pada bagian 5’ dan 3’yang digunakan untuk keperluan ligasi. Penggunaan 2 situs pemotongan enzim restriksi yang berbeda dimaksudkan untuk memastikan kebenaran arah orientasi dari gen OsWRKY76 pada saat melekat pada promotor dan terminator. Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 yang diharapkan pada

tanaman padi varietas Nipponbare adalah ukuran pita sebesar + 1.200 bp (Gambar 4).

Gambar 4. Hasil amplifikasi 5 sampel DNA Nipponbare dengan primer untuk gen OsWRKY76. Ukuran Gen OsWRKY76 yang diharapkan adalah sebesar + 1200 bp ditandai dengan anakpanah.

Hasil amplifikasi gen OsWRKY76 dengan ukuran + 1.200 bp tersebut kemudian diisolasi dari gel agarose dengan menggunakan gel extraction kit (Qiagen) untuk mendapatkan fragmen gen.

1.2. Kloning gen OsWRKY76 ke dalam vektor kloning

Fragmen gen OsWRKY76 kemudian diligasikan ke dalam plasmid pGEM-T Easy dan ditransformasikan ke E. coli DH5α dengan metode heat-shock (Sambrook et al. 1989). Kegiatan ini dimaksudkan untuk menyimpan, memperbanyak dan selanjutnya untuk memastikan situs pemotongan yang tepat untuk keperluan kloning pada gen OsWRKY76.

Hasil transformasi plasmid rekombinan ke dalam bakteri E.coli DH5 α tersebut kemudian ditumbuhkan pada media seleksi LB padat + ampisilin + IPTG dan X-Gal . Antibiotik ampisilin digunakan untuk menyeleksi sel-sel bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy, karena plasmid tersebut mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik ampisilin, sehingga koloni yang tumbuh pada media seleksi ampisilin dipastikan merupakan koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy. Sedangkan larutan IPTG (isoprophylthio-beta-D-galactoside) dan X-Gal (5 bromo-4 chloro-3-indolyl- β-D-galactoside) digunakan untuk mendeteksi terjadinya peristiwa komplementasi-α. Dengan adanyaIPTG di dalam

1200 bp

media, akan menginduksi aktivitas enzim β-galactosidase yang dikode oleh gen Lac Z sehingga mampu menghidrolisis/memotong substrat X-Gal sehingga akan memberikan warna biru. Koloni bakteri yang tumbuh apabila berwarna biru mengindikasikan koloni tersebut hanya mengandung plasmid pGEM-T Easy saja. Warna biru disebabkan adanya ekspresi gen Lac Z yang mengindikasikan bahwa pada plasmid pGEM-T Easy terjadi religasi. Sedangkan apabila koloni bakteri yang tumbuh berwarna putih, dipastikan plasmid pGEM-T Easy mengandung insert pada daerah Multi Cloning Sitenya, dimana daerah tersebut memotong gen Lac Z. Oleh karena itu dalam kegiatan ini IPTG dan X-Gal digunakan untuk menyeleksi koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy rekombinan dan koloni bakteri yang mengandung plasmid pGEM-T Easy saja.

Gambar 5. Hasil konfirmasi keberadaan fragmen gen OsWRKY76 pada plasmid pGEM-T easy yang dipotong dengan enzim BamHI dan SalI, menghasilkan fragmen dengan ukuran + 3.000 bp (fragmen pGEM-T Easy) dan 1.200 bp (fragmen OsWRKY76 sampel nomor 1, 2, 4, dan 5). Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan ukuran fragmen yang tidak sesuai.

Dari kegiatan transformasi plasmid rekombinan ke dalam bakteri E.coli DH5α ini didapatkan beberapa koloni bakteri berwarna putih. Dari koloni-koloni tersebut diambil 6 koloni bakteri untuk ditumbuhkan pada medium LB cair yang mengandung antibiotik ampisilin dan digoyang pada suhu 37oC selama semalam, selanjutnya koloni yang tumbuh diisolasi plasmidnya. Untuk konfirmasi keberhasilan ligasi, plasmid yang telah diisolasi kemudian dipotong menggunakan enzim BamHI dan SalI (Gambar 5). Kegiatan ini dilakukan selain untuk memastikan bahwa plasmid pGEM-T Easy yang diisolasi dari koloni bakteri yang berwarna putih adalah benar merupakan plasmid pGEM-T Easy rekombinan yang

Kb 1 2 3 4 5 6

3.000 bp 1.200 bp

mengandung gen OsWRKY76, juga untuk mendapatkan fragmen gen OsWRKY76 dengan ujung-ujung kohesif hasil pemotongan dengan enzim BamHI dan SalI.

Dari hasil konfirmasi tersebut diperoleh 4 sampel plasmid rekombinan yang menghasilkan ukuran seperti yang diharapkan, yaitu sampel nomor 1, 2 , 4, dan 5 (Gambar 5). Sampel-sampel tersebut menghasilkan produk pemotongan dengan ukuran 3.000 bp yang merupakan ukuran plasmid pGEM-T Easy dan 1.200 bp yang merupakan ukuran dari fragmen gen OsWRKY76. Sampel nomor 3 dan 6 menghasilkan produk pemotongan dengan ukuran yang tidak semestinya, sehingga plasmid tersebut tidak digunakan untuk penelitian selanjutnya.

1.3. Kloning gen OsWRKY76 ke dalam vektor ekspresi

Kegiatan kloning selanjutnya adalah meligasikan fragmen gen OsWRKY76 dengan fragmen promotor, terminator dan plasmid biner pCAMBIA-1301 sebagai vektor ekspresi/biner.

Pada kegiatan ini pertama-tama gen OsWRKY76 dipotong dari plasmid pGEM-T Easy dengan enzim restriksi BamHI dan SalI kemudian diseparasi di gel agarose. Pita dengan ukuran 1.200 bp yang merupakan ukuran gen OsWRKY76 diisolasi dari gel agarose dan kemudian diekstraksi dengan menggunakan gel extraction kit dari Qiagen. Kegiatan ini bertujuan untuk mendapatkan fragmen gen OsWRKY76 yang ujung-ujung kohesifnya sesuai untuk keperluan kloning.

Promoter 35SCaMV merupakan jenis promoter yang diekspresikan secara kuat, terus menerus, dan diekspresikan di semua bagian tanaman bila telah terintegrasi di dalam genom tanaman. Fragmen promoter 35SCaMV diperoleh dengan memotong plasmid pSP13 dengan enzim HindIII dan BamHI. Seperti diharapkan dari pemotongan dua enzim ini dihasilkan fragmen promoter 35SCaMV yang berukuran 550 bp dan ukuran 3.000 bp yang merupakan ukuran plasmid pBS-SK+ (Gambar 6A). Fragmen terminator 35SCaMV diperoleh dengan memotong plasmid pST8 dengan enzim SalI dan EcoRI. Seperti yang diharapkan dari hasil pemotongan dengan menggunakan 2 macam enzim restriksi ini didapatkan fragmen terminator 35SCaMV berukuran 210 bp (Gambar 6B). Fragmen promotor dan terminator dengan ukuran yang tepat diisolasi dari gel agarose dan kemudian diekstraksi menggunakan gel extraction kit (Qiagen).

Kegiatan ini bertujuan untuk mendapatkan fragmen promotor dan terminator 35SCaMV yang mempunyai ujung kohesif yang sesuai untuk keperluan kloning.

Gambar 6. (A) Hasil pemotongan plasmid pSP13 dengan enzim HindIII dan BamHI menghasilkan fragmen promotor 35SCaMV dengan ukuran 550 bp dan fragmen plasmid pBS-SK+ (3.000 bp), (B) Hasil pemotongan plasmid pST8 dengan enzim SalI dan EcoRI menghasilkan fragmen terminator 35SCaMV dengan ukuran 210 bp dan fragmen plasmid pBS-SK+ (3.000 bp).

Pada kegiatan ini digunakan plasmid biner pCAMBIA-1301 sebagai vektor biner/ekspresi. Plasmid tersebut dipilih karena selain terdapat enzim restriksi yang sesuai pada daerah MCS (Multi Cloning Site) yang cocok untuk kegiatan kloning (Gambar 10), juga pada daerah T-DNAnya mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik higromisin yang sesuai untuk seleksi pada kalus padi. Untuk tanaman padi saat ini sudah diketahui dosis semi letalnya terhadap antibiotik tersebut yaitu 50 mg/L (Hiei et al. 1994).

Plasmid biner pCAMBIA-1301 yang digunakan sebagai vektor dalam konstruk ini dipotong dengan menggunakan enzim restriksi HindIII dan EcoRI. Pemotongan tersebut bertujuan untuk mendapatkan fragmen pCAMBIA-1301 yang ujungnya sesuai untuk keperluan kloning. Enzim-enzim tersebut memotong pada daerah MCS dari plasmid pCAMBIA-1301. Hasil pemotongan tersebut kemudian diseparasi pada gel agarose dan fragmen berukuran 11.837 (Gambar 7) diisolasi dari gel menggunakan gen extraction kit (Qiagen).

Kb pSP13 pST8

550 bp

210 bp 3.000 bp (A) (B)

Gambar 7. Hasil pemotongan plasmid biner pCAMBIA-1301 dengan enzim HindIII dan EcoRI menghasilkan fragmen berukuran 11.837 bp.

Selanjutnya ke-4 fragmen (pCAMBIA-1301, promotor dan terminator 35SCaMV, dan gen OsWRKY76) dicampur untuk diligasikan bersama-sama dalam satu reaksi. Setelah diligasikan selama 3 hari pada suhu 4oC, plasmid rekombinan tersebut di transformasikan ke E. coli DH5α, dengan menggunakan metode heat shock (Sambrook et al. 1989). Suspensi bakteri yang telah ditransformasi kemudian ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung antibiotik kanamisin. Antibiotik tersebut digunakan karena pada plasmid pCAMBIA-1301 mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik kanamisin yang bisa bekerja di dalam sel bakteri. Sehingga apabila koloni bakteri yang tumbuh di media seleksi yang mengandung

antibiotik kanamisin dipastikan mengandung plasmid pCAMBIA-1301 yang mengandung gen kimera OsWRKY76. Dari hasil transformasi tersebut diperoleh 6 koloni bakteri yang tumbuh di media seleksi.

Koloni-koloni tersebut ditumbuhkan pada media LB cair yang mengandung antibiotik kanamisin 100 mg/L, digoyang semalam pada suhu 37oC. Dari 6 koloni yang ditumbuhkan, koloni nomor 4 tidak tumbuh, sehingga hanya 5 koloni yang diisolasi plasmidnya. Plasmid yang diperoleh kemudian dipotong dengan enzim restriksi EcoRI untuk memastikan koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Dari 5 koloni bakteri yang diuji hanya 3 koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan yang benar, yaitu koloni nomor 1, 3, dan 5 (Gambar 8). Sedangkan koloni nomor 2 menghasilkan fragmen dengan ukuran

11.837 bp Kb pCAMBIA1301

tidak seperti yang diharapkan dan koloni nomor 6 tidak mengandung plasmid, karena tidak dihasilkan fragmen dari hasil pemotongan. Kesimpulan tersebut diperoleh dengan melihat ukuran fragmen yang didapatkan setelah dilakukan pemotongan plasmid dengan enzim EcoRI, yaitu 210 bp yang merupakan ukuran terminator 35SCaMV, 710 bp merupakan ukuran sebagian dari potongan gen OsWRKY76, 1040 bp merupakan ukuran dari gabungan antara promotor 35SCaMV (550 bp) dan sebagian potongan gen OsWRKY76 (490 bp), dan 11.837 bp merupakan ukuran fragmen dari pCAMBIA-1301. Untuk konfirmasi lebih lanjut keberhasilan konstruksi plasmid dari koloni nomor 1 dan 3 dipotong dengan menggunakan 3 enzim restriksi yaitu HindIII, BamHI dan SalI.

Hasil pemotongan dengan menggunakan 3 enzim restriksi diperoleh 3 fragmen dengan ukuran + 550, 1.200, dan 13047 bp (Gambar 9B). Ukuran-ukuran tersebut secara berurutan merupakan fragmen 35SCaMV promotor, OsWRKY76, dan gabungan antara pCAMBIA-1301 (11837 bp) dan terminator 35SCaMV (220 bp). Hasil ini sudah sesuai dengan ukuran yang diharapkan (Gambar 3), dan dapat dikatakan bahwa konstruk gen over-ekspresi OsWRKY76 telah berhasil dirakit (Gambar 3 dan 10).

Gambar 8 . Hasil pemotongan plasmid pCAMBIA 1301-OsWRKY76 dengan enzim restriksi EcoRI.Ukuran yang dihasilkan dari pemotongan tersebut adalah: 210 bp yang merupakan ukuran terminator 35SCaMV, 710 bp merupakan ukuran sebagian potongan gen OsWRKY76, 1040 bp merupakan ukuran dari gabungan promotor 35SCaMV dan sebagian potongan gen OsWRKY76, dan 11.837 bp merupakan ukuran fragmen pCAMBIA 1301.

11.837 bp 1.040 bp 710 bp 210 bp KB 1 2 3 5 6

Gambar 9. Hasil konfirmasi dari 2 sampel plasmid untuk mengetahui keberadaan gen kimera (promoter 35SCaMV, gen OsWRKY76, dan terminator 35SCaMV) pada plasmid biner pCAMBIA-1301, dengan menggunakan 2 cara pemotongan (A) pCAMBIA1301 rekombinan dipotong dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI menghasilkan produk hasil pemotongan dengan ukuran 210, 710, 1040, dan 11837 bp, dan (B) pCAMBIA-1301 rekombinan dipotong menggunakan 3 enzim restriksi HindIII, BamHI dan SalI, menghasilkan produk dengan ukuran 550, 1200, dan 13047 bp. Ket.: Kb = marker 1 Kb plus (Invitrogen), 1,3 = plasmid dari koloni bakteri nomor 1 dan 3.

1.4. Transformasi vektor biner rekombinan ke dalam A. tumefaciens

Vektor ekspresi rekombinan pCAMBIA-1301::OsWRKY76 yang telah berhasil dirakit kemudian ditransformasikan ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105 dengan metode ‘freeze-thaw’. Penggunaan kedua strain bakteri tersebut dikarenakan keduanya merupakan strain bakteri yang supervirulen. Hasil transformasi kemudian ditumbuhkan pada media seleksi LB padat yang mengandung carbenicilin dan kanamisin untuk Agl-1 dan media seleksi LB padat yang mengandung kanamisin untuk EHA 105. Jenis antibiotik carbenicilin untuk menyeleksi keberadaan bakteri Agrobacterium strain Agl-1 dan kanamisin untuk menyeleksi plasmid rekombinan pCAMBIA-1301::OsWRKY76.

Dari hasil transformasi ini, diperoleh 3 koloni Agrobacterium dari strain Agl-1 dan 7 koloni dari strain EHA 105 yang tumbuh pada media seleksi. Dari koloni yang tumbuh kemudian dilakukan isolasi plasmid, dan dilakukan konfirmasi plasmid pCAMBIA-1301 rekombinan untuk mengetahui keberhasilan transformasi plasmid rekombinan pCAMBIA 1301::OsWRKY76 ke dalam Agrobacterium tumefaciens strain Agl-1 dan EHA 105. Konfirmasi dilakukan

3 1 Kb 1 3 ( A ) ( B )

210 710 bp 11.837 bp

1.040 bp

13.047 bp

1.200 bp 550 bp

dengan mentransformasikan kembali plasmid rekombinan tersebut (hasil isolasi dari Agrobacterium) ke E. coli (DH5α) dengan metode heat shock. Dari hasil transformasi tersebut diperoleh 6 koloni dari strain EHA 105 dan 4 koloni dari strain Agl-1. Dari koloni yang tumbuh tersebut kemudian dilakukan isolasi plasmid dan konfirmasi plasmid dengan melakukan pemotongan plasmid pCAMBIA-1301::OsWRKY76 dengan menggunakan enzim restriksi EcoRI (Gambar 11).

Gambar 10. A. Plasmid pCAMBIA -1301dengan daerah MCS (Multi Clonning Site) dan B. Plasmid pCAMBIA-1301::35S::OsWRKY76 hasil kloning.

A B

pCAMBIA::35S::OsWRKY76 13797

LAMPIRAN

1. Komposisi Media Transformasi Padi

MEDIA INDUKSI KALUS

Medium dasar NB*

+ Sucrose 30 g/L

diset pada pH = 5,8

+ Phytagel 2,5 g/L Autoklaf

+ 2,4-D (steril) 2,5 mg/L *Medium Dasar NB

N6 Makro I 100 ml/L N6 Makro II 100 ml/L FeNaEDTA 10 ml/L B5 Vitamin 10 ml/L B5 Mikro 1 ml/L L-Prolin 500 mg/L L-Glutamin 500 mg/L CEH 300 mg/L (4oC) (Casein Enzymatic Hydrolysate)

MEDIA KOKULTIVASI

Medium Dasar R2** + Glucose

pH = 5,2 Autoklaf

+ 2,4-D (steril) 2,5 mg/L + Acetosyringone (steril) 100 uM (Phytagel 3 g/L)

MEDIA SELEKSI

Medium Dasar R2**

+ Sucrose 30 g/L

pH = 6,0

+ Phytagel 3 g/L Autoklaf

+ 2,4-D (steril) 2,5 mg/L + Cefotaxime (steril) 400 mg/L +Vancomycine (steril) 100 mg/L + Hygromycine (steril) 50 mg/L

** Medium Dasar R2

R2 Makro I 100 ml/L R2 Makro II 100 ml/L FeNa EDTA 10 ml/L R2 Mikro 1 ml/L LS/R2 Vitamin 25 ml/L

MEDIA INDUKSI EMBRIO

Medium Dasar LS*** + Sucrose 30 g/L pH = 5,8

+ Phytagel 3 g/L

Air Kelapa 100 mL/L Autoklaf

+ 2,4-D (steril) 2,5 mg/L + Cefotaxime (steril) 100 mg/L + Vancomycine (steril) 100 mg/L + Hygromycine (steril) 50 mg/L

MEDIA REGENERASI

Medium Dasar LS***

+ Sucrose 40 g/L

pH = 5,8

+ Phytagel 3 g/L

Autoklaf

+ IAA (steril) 0,5 mg/L + BAP (steril) 0,3 mg/L + Cefotaxime (steril) 100 mg/L + Vancomycine (steril) 100 mg/L + Hygromycine (steril) 50 mg/L

MEDIA PERAKARAN

Medium Dasar LS***

+ Sucrose 30 g/L

pH = 5,8

+ Phytagel 2,5 g/L Autoklaf

+ Hygromycine (steril) 40 mg/L ***Medium Dasar LS

LS Makro I 100 ml/L LS Makro II 100 ml/L FeNaEDTA 10 ml/L LS Mikro 1 ml/L LS/R2 Vitamin 10 ml/L

LARUTAN STOK

N6 Makro I (stok konsentrasi 10x, penggunaan 100 ml/L medium NB)

KNO3 28,3 g/L

(NH4)2SO4 4,63 g/L KH2PO4 4,00 g/L MgSO4.7H2O 1,85 g/L

N6 Makro II (stok konsentrasi 10x, penggunaan 100 ml/L medium NB) CaCl2.2H2O 1,66 g/L

B5-Vitamin (stok konsentrasi 100x, penggunaan 10 ml/L medium NB) Myo-inositol 10 g/L

Thiamine-HCl 1 g/L Nicotinicacid 0,1 g/L Pyridoxine-HCl 0,1 g/L

B5-Mikro (stok konsentrasi 1000x, penggunaan 1 ml/L medium NB) MnSO4.H2O 1000 mg/100 mL

KI 75 mg/100 mL H3BO3 300 mg/100 mL ZnSO4.7H2O 200 mg/100 mL CuSO4 2,5 mg/100 mL Na2MoO4.2H2O 25 mg/100 mL CoCl2.6H2O 2,5 mg/100 mL

FeNaEDTA (stok konsentrasi 10x, penggunaan 10 ml/L medium NB, R2, atau LS)

FeSO4.7H2O 1,25 g/L Na2EDTA.2H2O 0,177 g/L

R2-Makro I (stok konsentrasi 10x, penggunaan 100 ml/L medium R2)

KNO3 4,0 g/L

(NH4)2SO4 3,3 g/L NaH2PO4.H2O 3,12 g/L

MgSO4.7H2O 2,46 g/L

CaCl2.2H2O 1,46 g/L

R2-Mikro (stok konsentrasi 1000x, penggunaan 1 ml/L medium R2) MnSO4.H2O 160 mg/100 mL

H3BO3 283 mg/100 mL

ZnSO4.7H2O 220 mg/100mL CuSO4.5H2O 19,5 mg/100 mL Na2MoO4.2H2O 12,5 mg/100 mL

R2-Vitamin (stok konsentrasi 40x, penggunaan 25 ml/L medium R2)

LS-Vitamin (stok konsentrasi 100x, penggunaan 10 mL/L medium LS) Thiamine-HCl 0,04 g/L

LS-Makro I (stok konsentrasi 10x, penggunaan 100 ml/L medium LS) KNO3 19,0 g/L

NH4NO3 16,5 g/L

KH2PO4 1,70 g/L

MgSO4.7H2O 3,70 g/L

LS-Makro II (stok konsentrasi 10x, penggunaan 100 ml/L medium LS) CaCl2.2H2O 4,4 g/L

LS-Mikro (stok konsentrasi 1000x, penggunaan 1 ml/L medium LS) MnSO4.H2O 1690 mg/100 mL

H3BO3 620 mg/100 mL ZnSO4.7H2O 860 mg/100 mL KI 83 mg/100 mL CuSO4.5H2O 2,5 mg/100 mL Na2MoO4.2H2O 25 mg/100 mL CoCl2.6H2O 2,5 mg/100 mL

2. Komposisi Media Pertumbuhan Bakteri

MEDIA LB

Bacto-Yeast extract 10 g/L Bacto-Tryptone 10 g/L

NaCl 5 g/L

MEDIA YEP

Bacto-Yeast extract 10 g/L Bacto-Peptone 10 g/L

NaCl 5 g/L

(Bacto Agar 15 g/L)

MEDIA AB

20X stok buffer AB : K2HPO4 60 g/L NaH2PO4 20 g/L Autoklaf

20x stok garam AB : NH4Cl 20 g/L MgSO4.7H2O 6 g/L KCl 3 g/L CaCl2 0,2 g/L FeSO4.7H2O 50 g/L Autoklaf

Untuk pembuatan 1 liter media AB, campur 5 g Glucose, 15 g Bacto Agar dan 900 mL ddH2O, dan autoclave. Tambahkan sebanyak 50 mL dari masing-masing stok Buffer AB dan stok garam AB. Tambahkan antibiotik yang sesuai ke dalam media AB jika diperlukan.