Identifikasi Marka Gen Ketahanan Hawar Daun Bakteri pada Galur Padi Introduksi dan Galur Dihaploid

IDENTIFIKASI MARKA GEN KETAHANAN HAWAR DAUN
BAKTERI PADA GALUR PADI INTRODUKSI DAN GALUR
DIHAPLOID

OVI PRASETYA WINANDARI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Identifikasi Marka
Gen Ketahanan Hawar Daun Bakteri pada Galur Padi Introduksi dan Galur
Dihaploid adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2014
Ovi Prasetya Winandari
NIM G353114031

RINGKASAN
OVI PRASETYA WINANDARI. Identifikasi marka gen ketahanan hawar daun
bakteri pada galur padi introduksi dan galur dihaploid. Dibimbing oleh ARIS
TJAHJOLEKSONO dan DWINITA WIKAN UTAMI.
Penyakit Hawar Daun Bakteri (HDB) merupakan penyakit yang
disebabkan oleh bakteri patogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Penyakit
ini merupakan salah satu penyakit padi yang paling merusak. Salah satu hal yang
paling penting dilakukan adalah menciptakan galur padi baru. Pembentukan galur
padi ini dapat dilakukan dengan cara melakukan persilangan varietas padi yang
dianggap memiliki sifat ketahanan penyakit HDB. Galur-galur padi yang
digunakan terdiri dari 37 galur haploid ganda turunan dari persilangan ganda
antara padi Parekaligolara/IR54 dengan padi Bio110/Markuti dan beberapa padi
introduksi dari IRRI. Varietas padi diferensial (IRBB) juga di sertakan sebagai
varietas pembanding berjumlah 22 varietas dan 1 tanaman peka (TN1) sebagai
kontrol. Tiga isolat HDB yang digunakan yaitu ras III, ras IV dan ras VIII yang

sering dijumpai di lapang. Primer hasil seleksi yang menghasilkan marka yang
bersifat polimorfisme digunakan untuk uji genotipe sifat ketahanan padi terhadap
penyakit HDB berjumlah 19 primer. Hasil penelitian menunjukkan ada 4 tanaman
yang bersifat tahan terhadap ketiga ras yang diujikan. Hasil analisis asosiasi
fenotipe dan genotipe menunjukkan bahwa sifat ketahanan padi terhadap bakteri
Xoo ras III berasosiasi dengan 3 marka (Xa7-OP40, Xa1-OP14 dan Xa4-OP50);
sifat ketahanan padi terhadap bakteri Xoo ras IV berasosiasi dengan 3 marka
(Xa1-OP5, Xa4-OP50 dan Xa26-OP1); sedangkan sifat ketahanan padi terhadap
bakteri Xoo ras VIII berasosiasi dengan 3 marka (Xa21-OP6, Xa7-RM20590 dan
Xa7-OP40).

Kata kunci : Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), marka molekular, galur
padi tahan

SUMMARY
OVI PRASETYA WINANDARI. Identification marker of bacterial leaf blight
resistance gene in introduction and dihaploid rice lines. Supervised by ARIS
TJAHJOLEKSONO and DWINITA WIKAN UTAMI.
Bacterial leaf blight (BLB), caused by bacterial pathogen Xanthomonas
oryzae pv. oryzae (Xoo), is one of the most devastating diseases in rice. The use

of BLB-resistant rice varieties is one of the most efficient ways to protect rice
from this disease. BLB-resistant varieties can be produced through the breeding
program using the diverse of rice germplasm. The objective of this research was
to identify the presence of resistance genes in rice lines using molecular marker.
We used 37 rice lines comprising introduction lines and dihaploid lines derived
from double crossing between IR54/Parekaligolara and Bio110/Markuti, 22
differential varieties (IRBBs) and one susceptible line (TN1) as controls. All plant
tested were inoculated with three selected dominant BLB races. Nineteen primers
previously selected were used to amplify the molecular marker of BLB resistance
genes in rice lines tested. The result of this research showed that 4 rice lines were
resistance to all BLB races tested. Three molecular markers (Xa7-OP40, Xa1OP14 and Xa4-OP50) were specifically associated with the resistance to race III;
to race IV (Xa1-OP5, Xa4-OP50 and Xa26-OP1), and to race VIII (Xa21-OP6,
Xa7-RM20590 and Xa7-OP40).
Key words: Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), molekular markers, resistant
rice lines

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

IDENTIFIKASI MARKA GEN KETAHANAN HAWAR DAUN
BAKTERI PADA GALUR PADI INTRODUKSI DAN GALUR
DIHAPLOID

OVI PRASETYA WINANDARI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR
2014

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr.Ir. Utut Widyastuti, M.Si

Judul Tesis : Identifikasi Marka Gen Ketahanan Hawar Daun Bakteri pada Galur
Padi Introduksi dan Galur Dihaploid
Nama
: Ovi Prasetya Winandari
NIM
: G353114031

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono, DEA
Ketua

Dr. Dwinita Wikan Utami, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biologi Tumbuhan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Miftahudin, MSi

Dr. Ir. Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 21 Juli 2014

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian
yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2013 ini berjudul Identifikasi Marka Gen

Ketahanan Hawar Daun Bakteri pada Galur Padi Introduksi dan Galur Dihaploid.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Aris Tjahjoleksono, DEA dan Dr
Dwinita Wikan Utami, M.Si selaku pembimbing. Ucapan terima kasih
disampaikan kepada Dr Ir Utut Widyastuti, M.Si sebagai penguji luar komisi pada
ujian tesis atas saran dan masukan yang diberikan. Ucapan terima kasih
disampaikan kepada DIKTI KEMENDIKBUD yang telah memberikan Beasiswa
Unggulan (BU). Ucapan terimakasih juga disampaikan kepada pimpinan Balai
Besar Bioteknologi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-Biogen) Bogor yang
telah memberikan izin menggunakan fasilitas, serta kepada para peneliti yang
telah membantu selama pelaksanaan penelitian. Penelitian ini didanai dari proyek
Peningkatan Kemampuan Peneliti dan Perekayasa (PKPP) No.X.110 tahun 2012
atas nama Dwinita Wikan Utami. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada
ayah dan ibu, serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Juli 2014
Ovi Prasetya Winandari

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xi

DAFTAR GAMBAR

xi

DAFTAR LAMPIRAN

xi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian

1
1
2

2 TINJAUAN PUSTAKA

Botani Tanaman Padi (Oryza sativa L.)
Penyakit Hawar Daun Bakteri (HDB)
Marka Molekuler untuk Identifikasi Gen Ketahanan HDB

2
2
3
4

3 METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Bahan Penelitian
Uji Ketahanan Padi Terhadap Xanthomonas
Isolasi DNA
Pengenceran Konsentrasi DNA
Analisis PCR untuk Survei Polimorfisme
Analisi PCR untuk Identifikasi Gen Ketahanan HDB
Elektroforesis DNA
Analisis Data

5
5
6
8
10
10
10
11
11
11

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Fenotipe
a. Respon ketahanan varietas diferensial (IRBB)
b. Respon ketahanan pada galur-galur uji
c. Pendugaan gen ketahanan pada galur-galur uji
Uji Genotipe
a. Survei polimorfisme
b. Uji genotipe pada varietas diferensial (IRBB)
c. Uji genotipe pada galur-galur uji

d. Hasil analisis asosiasi fenotipe dan genotipe pada galur uji

12
12
12
15
18
19
19
19
20
21

5 KESIMPULAN

24

SARAN

24

DAFTAR PUSTAKA

24

LAMPIRAN

27

RIWAYAT HIDUP

30

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Galur-galur padi yang digunakan dalam penelitian
Ras HDB yang digunakan dalam penelitian
Marka molekuler yang digunakan untuk identifikasi
Kriteria ketahanan varietas padi terhadap penyakit HDB
Primer hasil survei polimorfisme
Respon ketahanan padi varietas diferensial terhadap HDB
Respon ketahanan padi galur uji terhadap HDB
Pendugaan gen galur uji
Hasil analisis asosiasi fenotipe dan genotipe pada galur uji

6
7
7
9
11
13
17
18
23

DAFTAR GAMBAR
1 Peremajaan isolat bakteri Xanthomonas oryzae untuk evaluasi ketahanan
padi galur-galur uji dan varietas diferensial terhadap penyakit HDB
2 Media tanam untuk padi galur uji dan padi varietas diferensial (a),
tanaman padi yang berumur 2 minggu setelah tanam (b), dan tanaman
padi berumur 4 minggu yang siap diinokulasi (c)
3 Proses inokulasi isolat bakteri dengan metode pengguntingan (a) dan
pemberian air menggunakan sprinkle dilakukan untuk menjaga
kelembaban (b)
4 Galur padi yang tahan terhadap penyakit HDB (IS≤20%) (1), galur padi
yang agak tahan terhadap penyakit HDB (20%40%) (3)
5 Ketahanan padi varietas diferensial terhadap ras III, ras IV, dan ras VIII
6 Ketahanan padi galur uji terhadap ras III, ras IV, dan ras VIII
7 Hasil amplifikasi DNA tanaman kontrol peka TN1 dan kontrol tahan
IRBB7 menggunakan primer Xa1-OP5 dan Xa1-OP6
8 Hasil PCR menggunakan primer Xa1-OP5 pada varietas diferensial
9 Salah satu hasil PCR DNA galur uji menggunakan primer Xa1-OP5
10 Hasil analisis UPGMA menggunakan Tassel 3.0

8

9

9

12
15
16
19
20
21
22

DAFTAR LAMPIRAN
1 Hasil skoring uji genotipe
2 Primer yang digunakan untuk survei polimorfisme

27
28

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi (Oryza sativa L.) merupakan salah satu tanaman pangan utama di
dunia (Mudingotto et al. 2010). Di Indonesia, padi merupakan bahan makanan
pokok sehingga kebutuhan padi semakin meningkat pada setiap tahunnya seiring
dengan peningkatan jumlah penduduk. Peningkatan kebutuhan terhadap padi tidak
berbanding lurus dengan peningkatan produksi padi. Berdasarkan data dari Badan
Pusat Statistik tahun 2013, produktivitas padi mengalami penurunan sebanyak
1.08 juta ton (1.63 %) per tahun sedangkan laju pertumbuhan penduduk
meningkat 1.49% per tahun. Oleh karena itu, seiring dengan peningkatan jumlah
penduduk, maka peningkatan produksi padi harus senantiasa diupayakan.
Upaya peningkatan produksi padi tidak terlepas dari kendala-kendala
cekaman biotik dan abiotik. Cekaman biotik antara lain serangan hama seperti
wereng coklat, penggerek batang dan ganjur, serta serangan penyakit seperti
hawar daun bakteri (HDB) dan blas. Cekaman abiotik meliputi antara lain
kekeringan, keracunan besi (Fe) dan Al (aluminium) (Abdullah et al. 2001).
Penyakit hawar daun bakteri menyebabkan penurunan produksi padi yang cukup
tinggi. Di Indonesia, HDB menyebabkan penurunan hasil panen yang signifikan
dan dalam keadaan tertentu dapat menurunkan produksi sampai 60% (Triny et al.
2011). Penyakit HDB merupakan penyakit yang disebabkan oleh bakteri patogen
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) (Ou 1985).
Indonesia dikenal memiliki keanekaragaman spesies padi yang tinggi dan
memiliki sekitar 17.000 aksesi plasma nutfah (BPTP 2011). Keragaman genetik
plasma nutfah padi merupakan pondasi program pemuliaan tanaman padi. Di
antara koleksi plasma nutfah padi yang memiliki keragaman genetik yang luas
adalah aksesi padi lokal (landraces) dan aksesi galur-galur introduksi dari luar
negeri (Utami et al. 2011a).
Ketersediaan aksesi plasma nutfah yang beragam telah dimanfaatkan oleh
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik
(BB-Biogen) sebagai sumber genetik untuk melakukan pembentukan galur-galur
padi baru yang diantaranya ditargetkan sebagai galur padi tahan penyakit HDB.
Galur-galur padi yang digunakan pada penelitian ini diantaranya merupakan galur
haploid ganda turunan dari persilangan ganda antara padi Parekaligolara/IR54
dengan padi Bio110/Markuti. Padi Parekaligolara memiliki gen ketahanan
terhadap patogen HDB, IR54 memiliki gen ketahanan terhadap patogen blast dan
gen toleran terhadap kahat P, BIO110 memiliki gen ketahanan HDB dan blast,
dan markuti memiliki gen toleran terhadap keracunan Fe (Utami et al. 2009). Di
samping itu juga telah diintroduksi galur-galur yang berasal dari IRRI yang
berpotensi memiliki sifat-sifat unggul yang tahan penyakit HDB. Berdasarkan
ketersediaan galur-galur padi di atas, maka perlu dilakukan identifikasi adanya
gen ketahanan terhadap penyakit HDB baik secara fenotip dengan inokulasi
buatan maupun secara genotip dengan menggunakan marka molekuler.

2

Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi marka gen ketahanan
penyakit HDB pada galur-galur padi introduksi dan galur-galur dihaploid hasil
persilangan beberapa aksesi padi lokal Indonesia, baik secara fenotipe ataupun
genotipe.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Botani Tanaman Padi (Oryza sativa L.)
Tanaman padi termasuk Kingdom Plantae, Superdivisi Spermatophyta,
Divisi Magnoliophyta, Kelas Angiospermae, Subkelas Monocotyledoneae, Ordo
Poales, Famili Graminae, dan Genus Oryza (Siregar 1981). Tanaman padi yang
umum dibudidayakan sebagai penghasil beras memiliki nama ilmiah Oryza
sativa. Oryza sativa merupakan tanaman diploid. Satu set genomnya terdiri atas
12 kromosom (Chang & Bardenas 1965).
Padi merupakan tanaman semusim dan bersifat merumpun. Keseluruhan
organ tanaman padi terdiri dari dua kelompok, yaitu organ vegetatif dan organ
generatif (reproduktif). Organ vegetatif meliputi akar, batang dan daun, sedangkan
organ generatif terdiri dari malai, bunga dan buah padi (gabah) (Ismunadji &
Manurung 1988).
Sistem perakaran padi berupa akar serabut yang sangat efektif untuk
penyerapan hara. Batang berbentuk bulat, berongga, dan terdiri dari beberapa
ruas. Panjangnya ruas tidak sama, ruas yang terpendek terdapat pada pangkal
batang. Ruas yang kedua, ruas yang ketiga, dan seterusnya adalah lebih panjang
daripada ruas yang didahuluinya. Pada tiap-tiap ruas batang dibatasi oleh bukubuku. Pada buku batang keluar daun. Daun terdiri atas pelepah dan helaian daun.
Helaian daun memanjang seperti pita dengan tulang daun sejajar, sedangkan
bagian pelepah membalut ruas batang di atasnya. Di sebelah kanan dan kiri dasar
helaian daun terdapat auricle. Helaian daun yang membalut ruas batang paling
atas disebut daun bendera. Pada pertemuan antara helaian dan pelepah daun
terdapat lidah daun (ligula) (Chang & Bardenas 1965).
Pada ruas teratas batang terdapat pembungaan (panicle) yang bersifat
majemuk tak terbatas (racemosa). Ibu tangkai bunga (rachis) bercabang-cabang
membentuk cabang primer dan masing-masing cabang primer bercabang-cabang
lagi membentuk cabang sekunder. Pada tiap-tiap cabang sekunder terdapat cabang
bulir (pedicel) dan pada ujung tiap-tiap cabang bulir mendukung bunga padi
(spikelet) (Chang & Bardenas 1965). Bunga padi berkelamin dua, bunga jantan
memiliki enam buah stamen (benang sari) yang masing-masing mengandung dua
anther pada filament yang ramping. Bunga betina (pistil) mengandung satu ovum
yang memuat stilus pendek yang terbagi dalam dua cabang stigma yang berwarna
putih dan ungu. Buah padi (gabah) terdiri dari bagian luar yang disebut sekam dan
bagian dalam yang disebut kariopsis. Sekam terdiri dari lemma dan palea (Ou
1985).
Sejak berkecambah hingga panen tanaman padi membutuhkan waktu 3-6
bulan tergantung jenis dan varietas masing-masing padi. Padi terbagi dalam dua

3

fase yaitu fase vegetatif dan fase generatif. Fase vegetatif merupakan fase awal
pertumbuhan sampai pembentukan bakal malai (primordia). Fase vegetatif
merupakan fase pertumbuhan organ- organ vegetatif, seperti pertambahan jumlah
anakan, tinggi tanaman, dan luas daun. Lama fase ini beragam, sehingga
menyebabkan adanya perbedaan umur tanaman. Sedangkan fase reproduktif
dimulai dari primordia, pembuangaan, sampai pematangan buah (gabah). Fase
reproduktif ditandai dengan memanjangnya beberapa ruas teratas batang tanaman,
berkurangnya jumlah anakan (matinya anakan yang tidak produktif), munculnya
daun bendera, bunting, pembungaan dan pematangan. Inisiasi primordia malai
biasanya dimulai 30 hari sebelum heading dan waktunya hampir bersamaan
dengan pemanjangan ruas- ruas batang, yang terus berlanjut sampai berbunga.
Oleh sebab itu, stadia reproduktif disebut juga stadia pemanjangan ruas
(Ismunadji & Manurung 1988).
Padi dapat ditanam dari dataran rendah sampai dataran tinggi. Macammacam padi berdasarkan lahan tanam antara lain padi sawah, padi gogo, dan padi
rawa. Padi sawah merupakan padi yang ditanam di lahan sawah yang tergenang
air. Padi gogo merupakan padi yang di tanam di tanah kering (ladang). Sedangkan
padi rawa merupakan padi yang ditanam di lahan rawa dan lahan pasang surut
(Herawati 2011).

Penyakit Hawar Daun Bakteri (HDB)
Penyakit Hawar Daun Bakteri disebabkan oleh bakteri Xanthomonas oryzae
pv. oryzae (Xoo). Xoo termasuk dalam Kingdom Bacteria, Divisi Proteobacteria,
Kelas
Gamma
Proteobacteria,
Ordo
Xanthomonadales,
Famili
Xanthomonadaceae, Genus Xanthomonas. Xoo merupakan bakteri gram negatif,
berbentuk batang tunggal berukuran 0,45-0,75 x 0,65-2,1 µm dan bergerak
dengan flagel (Ou 1985). Hawar daun bakteri (HDB) atau bacterial leaf blight
(BLB) sudah dikenal di Jepang sejak tahun 1884. Penyakit ini tersebar luas di
berbagai negara penghasil padi, seperti Cina, Taiwan, Korea, Thailand, Vietnam,
Filipina, Sri Lanka, India, Afrika, Australia, dan Amerika Selatan (Ou 1985).
Penyakit hawar daun bakteri pertama kali dilaporkan di Indonesia oleh
Reitsman dan Schure pada tahun 1950. Schure mengidentifikasi organisme
penyebab hawar daun bakteri sebagai Xanthomonas kresek. Selanjutnya, hasil
penelitian Goto (1964) menunjukkan bahwa patogen penyebab hawar daun
bakteri di Indonesia sama seperti yang menyerang di Jepang, sehingga namanya
diganti Xanthomonas oryzae (Uyeda et Ishiyama) Dowson. Pada tahun 1976,
nama patogen ini menjadi Xanthomonas campestris pv. Oryzae dan sejak tahun
1990 dinamakan Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Swing et al. 1990).
Pada awalnya, pengelompokan isolat-isolat hawar daun bakteri di Indonesia
mengikuti sistem Kozaka seperti yang digunakan di Jepang. Sistem Kozaka telah
berhasil mengidentifikasi kelompok strain VI, VII, dan VIII (Kozaka 1969).
Yamamoto et al. (1977) berhasil mengelompokkan isolat Xoo yang ada di
Indonesia menjadi tiga kelompok strain, yaitu strain III, IV, dan V. Selanjutnya
Horino dan Hifni (1981), juga mengidentifikasi adanya kelompok strain yang baru
lagi yaitu strain I, II dan IX, sehingga kelompok strain yang ada di Indonesia
menjadi sembilan.

4

Bakteri Xoo membentuk strain-strain baru di lapangan sejalan dengan
perkembangan penggunaan varietas padi. Menurut Kozaka (1969) strain baru
tersebut telah diidentifikasi menjadi sebelas kelompok strain Xoo dengan tingkat
virulensi yang berbeda-beda. Di antara strain-strain tersebut, kelompok strain IV
merupakan kelompok strain yang virulensinya paling tinggi (Kardin & Hifni
1993). Sedangkan jika dilihat dari penyebarannya maka strain III, IV dan VIII
adalah strain-strain yang memiliki penyebaran paling luas dan bersifat dominan di
beberapa lokasi endemik hawar daun bakteri di Indonesia (Kadir et al. 2009).
Pertumbuhan bakteri Xoo pada medium agar selalu berwarna kuning dan
pertumbuhannya relatif lambat. Semua bakteri Xanthomonas bersifat patogenik
pada tanaman, dan hanya ditemukan berasosiasi dengan tanaman. Bakteri
biasanya masuk ke dalam inang melalui luka atau stomata, kemudian bakteri
menetap di jaringan xilem, berkembang biak dan menyebar keseluruh bagian
tanaman.penyakit ini dapat merusak klorofil daun, sehingga menyebabkan
penurunan kemampuan tanaman untuk melakukan fotosintesis. Jika serangan
terjadi pada awal pertanaman maka tanaman akan menjadi layu dan mati.
Sedangkan jika serangan terjadi pada fase pembungaan maka proses pengisian
gabah menjadi terganggu sehingga gabah tidak terisi penuh atau bahkan hampa
dan dapat menyebabkan kehilangan hasil mencapai 70% (Redy 1989).
Gejala penyakit HDB pada tanaman di persemaian, biasanya dicirikan oleh
warna menguning pada tepi daun yang tidak mudah diamati. Gejala yang
ditemukan pada fase pertumbuhan anakan sampai fase pemasakan adalah gejala
hawar (water soaked) sampai berupa garis kekuningan pada daun bendera. Gejala
mulai tampak pada ujung daun kemudian bertambah lebar, sampai menyebabkan
pinggir daun berombak. Selain itu, ditemukan juga eksudat bakteri berwarna susu
atau berupa tetes embun pada daun muda di pagi hari. Pada stadia perkembangan
gejala penyakit lebih lanjut, luka berubah warna mejadi kuning memutih.
Selanjutnya pada daun yang terinfeksi parah, warna daun cenderung menjadi abuabu disertai dengan munculnya jamur saprofit (Triny et al. 2011).
Proses penyebaran penyakit ditentukan oleh tiga komponen yang selalu
berinteraksi yaitu patogen, inang dan lingkungan. Masing-masing komponen
dapat berubah sifatnya sehingga dapat mempengaruhi tingkat keparahan penyakit
(Agrios 2005).
Penelitian strain Xoo sudah menggunakan teknologi molekuler melalui
pengamatan DNA. Fragmen DNA dari berbagai ukuran yang berasal dari semua
isolat Xoo yang digunakan mampu berhibridisasi dengan gen avirulensi avrBs3
yang berasal dari Xanthomonas campestris (Utami et al. 2011b).

Marka Molekuler untuk Identifikasi Gen Ketahanan HDB
Perkembangan teknologi saat ini yang begitu pesat berpengaruh besar
terhadap perkembangan biologi molekuler terutama dalam penggunaan marka
molekuler untuk identifikasi gen-gen ketahanan terhadap penyakit. Penggunaan
marka molekuler lebih efisien dibandingkan dengan cara konvensional.
Keuntungan lain dari penggunaan marka molekuler adalah tidak dipengaruhi oleh
faktor lingkungan seperti geografi dan fluktuasi musim (Wang & Tanksley 1989).

5

Pemanfaatan marka DNA sebagai alat bantu seleksi Marker-Assisted
Selection (MAS) dapat meningkatkan presisi seleksi tanaman target karena seleksi
dengan bantuan marka molekuler didasarkan pada sifat genetik tanaman dan tidak
dipengaruhi oleh faktor lingkungan (Bustamam & Moeljopawiro 1998).
SSR adalah sequence sederhana yang berulang-ulang yang melimpah dalam
genom suatu spesies. SSR memiliki pengulangan sequence yang berurutan dua
sampai empat motif sequence nukleotida sebagai sequence konservatif. Marka ini
sangat berguna sebagai marka genetik karena bersifat kodominan, sehingga dapat
mendeteksi keragaman alel pada level yang tinggi, mudah dan ekonomis dalam
mengaplikasikannya karena menggunakan proses PCR (Blair & Couch 1990).
Penelitian yang lain juga telah memperoleh beberapa marka gen STS (SequenceTagged Sites) yang spesifik sebagai penanda gen-gen Xa7, Xa21, Xa26, dan Xa4
(Utami et al. 2010). Marka molekuler tersebut diperoleh dengan menggunakan
pendekatan pemetaan LD (Linkage Disequilibrium) karena menggunakan
populasi yang sangat beragam (Morton 2005). Marka molekuler Xa21-LD21
untuk gen Xa21, Xa26-LD36 untuk gen Xa26 dan Xa4-LD15 untuk gen Xa4
(Utami et al. 2010).
Untuk mengetahui gen yang paling berpotensi mengendalikan HDB, telah
dilakukan penelitian dengan mengintroduksi varietas differensial (IRBB) dari
IRRI untuk di uji dengan tiga strain penyebab HDB yang paling dominan di
Indonesia. Varietas diferensial antara lain memiliki satu gen yaitu gen Xa7 yang
diidentifikasi secara molekuler berkaitan dengan sifat tahan terhadap HDB. Hasil
pengujian menunjukkan bahwa galur yang memiliki gen Xa7, ternyata tahan
terhadap ketiga strain III, IV dan VIII (Utami et al. 2007).
Beberapa penelitian telah dilakukan dengan menggunakan marka molekuler
terkait identifikasi gen Xa yang merupakan gen ketahanan terhadap penyakit
HDB. Gen Xa tersebut telah banyak yang dipetakan. Beberapa marka molekuler
diketahui terpaut dan bersegregasi bersama dengan sifat ketahanan terhadap
penyakit HDB. Salah satu dari gen tersebut adalah gen Xa7 dengan marka SSR
(Simple Sequence Repeat), yaitu RM20589, RM20590 dan RM20591 yang
ketiganya terdapat pada fragmen AP006056 kromosom 6 pada genom padi (Chen
et al. 2008). Gen Xa7 menyandi protein kinase domain, protein yang
menyebabkan sifat tahan terhadap Ras IV dan VIII dan menyandi protein 3hydroxyisobutirate dehidrogenase yang menyebabkan sifat tahan terhadap Ras IV
(Utami et al. 2007). Gen Xa1, Xa21 dan Xa26 merupakan kelompok gen yang
mengandung nucleotide binding site-leucine rich repeat (NBS-LRR), produk
yang dihasilkan dari gen tersebut adalah protein kinase domain. Protein ini
berfungsi sebagai ketahanan terhadap virulen (Yoshimura et al. 1998).

3 METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2013 sampai Desember 2013
di Laboratorium Biologi Molekuler, kelompok penelitian Biologi Molekuler,

6

Balai Besar Bioteknonogi dan Sumber Daya Genetik Pertanian (BB-Biogen),
Bogor.

Bahan Penelitian
Populasi tanaman yang diuji adalah galur-galur introduksi dan galur-galur
haploid ganda turunan dari hasil persilangan beberapa aksesi padi lokal terpilih,
yaitu IR54/parekaligolara//Bio110/markuti yang seluruhnya berjumlah 37 galur
padi. Beberapa varietas padi diferensial yang telah diketahui memiliki gen
ketahanan HDB juga digunakan sebagai pembanding sifat ketahanan padi yang
diuji. Varietas padi diferensial yang digunakan berjumlah 22 varietas. Galur dan
varietas padi yang digunakan pada penelitian ini ditunjukan pada Tabel 1.
Tabel 1 Galur-galur padi yang digunakan dalam penelitian
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42

Galur/Varietas
IR83821-95-3-2-3
IR83860-503-1-1-2
IR83860-513-3-3-2
IR84047-24-3-3-3
IR84941-12-1-2
IR83650-59-2-5-2-2
IR83822-512-3-2-2
IR83689-14-1-2-1-3
IR84744-94-3-3-2
IR84790-73-2-2-2
IR85627-46-1-2-3
IR82571-581-1-2-3
IR82571-602-3-2-2
IR82480-104-2-2-3-2
IR10L369
IR10L440
IR74371-70-1-1
IR74371-54-1-1
IR80311-10-B-B-2-B
IR77408-40-3-2-1-B
IR54751-1-2-44-15-2-3-B
Beras Merah D1
BMIP-46-4-1
IPBM-32-1-3-3
BMIP-18-4-4-1
BMIP-18-4-4-2
BMIP-24-4-3-1
BMIP-20-4-3-2
BMIP-24-1-2-1
BMIP-44-4-3-1
BMIP-44-4-3-2
BMIP-20-2-1-1-1
IRHS-12-14-1
Ciherang
Inpari 13
Code
IR64
TN1
IRBB1
IRBB2
IRBB3
IRBB4

Aksesi padi
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Introduksi IRRI
Back Cross
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Haploid ganda
Varietas unggul
Varietas unggul
Varietas unggul
Varietas unggul
Introduksi China
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial

Keterangan
Indica/aromatic
Indica/aromatic
Indica/aromatic
NPT/Aromatik
Indica/Salinity
Padi tipe baru II
Padi tipe baru II
Padi mikronutrisi
Padi tipe baru II
Padi tipe baru II
Padi tipe baru II
Indica
Indica
Padi mikronutrisi
Padi tadah hujan
Padi tadah hujan
Padi uji plot
Padi uji plot
Persilangan intra spesies
Persilangan intra spesies
Persilangan intra spesies
Galur harapan padi beras merah
Bio110/Markuti//IR54/Parekaligolara
IR54/Parekalogolara//Bio110/Martkuti
Bio110/Markuti//IR54/Parekaligolara
Bio110/Markuti//IR54/Parekaligolara
Bio110/Markuti//IR54/Parekaligolara
Bio110/Markuti//IR54/Parekaligolara
Bio110/Markuti//IR54/Parekaligolara
Bio110/Markuti//IR54/Parekaligolara
Bio110/Markuti//IR54
Bio110/Markuti//IR54
Galur harapan padi produksi tinggi
IR18349-53-1-3-1-3/IR19661-131-3-1-3//IR64
OM606/IR18348-36-3-3
IR64/IRBB7
IR5657/IR2061
Padi kontrol peka HDB
Monogenik Xa1
Monogenik Xa2
Monogenik Xa3
Monogenik Xa4

7

No
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60

Galur/Varietas
IRBB5
IRBB7
IRBB8
IRBB10
IRBB11
IRBB13
IRBB14
IRBB21
IRBB50
IRBB51
IRBB52
IRBB53
IRBB54
IRBB56
IRBB57
IRBB58
IRBB64
IRBB66

Aksesi Padi
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial
Varietas Diferensial

Keterangan
Monogenik Xa5
Monogenik Xa7
Monogenik Xa8
Monogenik Xa10
Monogenik Xa11
Monogenik Xa13
Monogenik Xa14
Monogenik Xa21
Digenik Xa4+Xa5
Digenik Xa4+Xa13
Digenik Xa4+Xa21
Digenik Xa5+Xa13
Digenik Xa5+Xa21
Multigenik Xa4+Xa5+Xa13
Multigenik Xa4+Xa5+Xa21
Multigenik Xa4+Xa13+Xa21
Multigenik Xa4+Xa5+Xa7+Xa21
Multigenik Xa4+Xa5+Xa7+Xa13+Xa21

Isolat HDB yang digunakan adalah ras-ras HDB yang dominan di beberapa
lokasi endemik penyakit HDB di Indonesia, yakni ras III, ras IV dan ras VIII.
Spesifikasi Ras HDB ditunjukkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Ras HDB yang digunakan dalam penelitian
No
1
2
3

Ras HDB
III
IV
VIII

Kode isolat
Ixo 94-013
Ixo 80-004
Ixo 79-008

Kultivar asal
Way Seputih
Lokal
IR36

Lokasi
Jatisari, Cikampek
Cianjur, Jawa Barat
Pusaka Negara, Subang

Identifikasi gen ketahanan HDB pada galur-galur yang diuji (Tabel 1) di
lakukan dengan menggunakan marka molekuler. Identifikasi gen Xa1, Xa4, Xa7,
Xa13, Xa21, Xa22, Xa26 dilakukan dengan menggunakan marka molekuler STS
(Sequence-Tagged Sites), sedangkan untuk gen Xa7 digunakan dua jenis marka
yaitu marka STS dan marka terpaut gen (marka SSR Xa7). Marka molekuler yang
digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3 Marka molekuler yang digunakan untuk identifikasi
No
1
2
3
4
5
6
7
8

Gen
Xa1
Xa4
Xa7
Xa13
Xa21
Xa22
Xa26
Xa7

Nama marka
Xa1-OP
Xa4-OP
Xa7-OP
Xa13-OP
Xa21-OP
Xa22-OP
Xa26-OP
Xa7-RM

Posisi gen*
Krom 4; 31.452.992-31.459.688 bp
Krom 11; 27.626.581-29.640.967 bp
Krom 6; 27.370.133-28.100.952 bp
Krom 8; 109.3-111.2 cM
Krom 11 : 20.336.827-20.337.354 bp
Krom 11; 112.8-119.5 cM
Krom 11; 27.626.581-29.564.870 bp
Krom 6; 27.370.133-28.100.952 bp

Jenis marka
Marka STS
Marka STS
Marka STS
Marka STS
Marka STS
Marka STS
Marka STS
Marka SSR

*) : berdasarkan peta genetik gen target dari Rice Genome Browser (www.gramene.org)

8

Marka molekuler pada Tabel 3 digunakan untuk uji polimorfisme dan
analisis genotipe. Jumlah seluruh primer yang digunakan adalah 208 primer untuk
uji polimorfisme (Lampiran 2). Kemudian primer yang menghasilkan marka yang
bersifat polimorfisme digunakan untuk uji genotipe sifat ketahanan padi terhadap
penyakit HDB.

Uji Ketahanan Padi Terhadap Xanthomonas
Inokulum bakteri Xanthomonas oryzae disiapkan dengan cara meremajakan
isolat yang telah tersedia yaitu Ras III, IV dan VIII pada cawan petri (Gambar 1)
dengan media agar (20 gr sukrose, 5 gr peptone, 0.5 gr Ca(NO3)2.4H2O, 1.8 gr
Na2.4PO4.7H2O, 0.05 gr FeSO4.7H2O, 18 gr Bacto Agar dalam 1 liter dH2O).
Bakteri diinkubasikan di dalam inkubator bersuhu 37oC selama 3 hari.
a

b

c

Gambar 1 Peremajaan isolat bakteri Xanthomonas oryzae untuk evaluasi
ketahanan padi galur-galur uji dan varietas diferensial terhadap
penyakit HDB. a) Koloni tunggal murni, b) Kultur isolat yang akan
digunakan untuk inokulasi, c) Inokulum
Benih padi varietas diferensial maupun galur uji dikecambahkan dengan
cara direndam air di dalam cawan petri selama 1 minggu sebelum penanaman.
Kemudian benih padi tersebut ditanam pada bak plastik yang telah diisi media
tanah dan kompos (2:1) yang telah disterilkan pada suhu 1000C. Bak plastik yang
digunakan berjumlah 3 buah dengan ukuran lebar 30 cm, panjang 40 cm, dan
tinggi 12 cm. Masing-masing bak ditanami 20 galur uji. Setiap galur ditanam
dalam satu baris yang terdiri dari 6 tanaman sebagai ulangan dengan jarak antar
tanaman 2 cm. Jarak antar galur adalah 5 cm. Kebutuhan air dan pupuk tetap
dipenuhi dengan cara disiramkan ke media tanah hingga proses inokulasi.
Pemupukan pada tanah dilakukan 1 minggu sebelum penanaman dan 2 minggu
setelah benih di tanam. Pupuk yang digunakan pada setiap pemupukan adalah
pupuk NPK sebanyak 5-6 gr per liter untuk satu bak tanam.

9

a

c

b

Gambar 2 Media tanam untuk padi galur uji dan padi varietas diferensial (a),
tanaman padi yang berumur 2 minggu setelah tanam (b), dan tanaman
padi berumur 4 minggu yang siap diinokulasi (c)
Bakteri yang telah tumbuh pada cawan petri kemudian diresuspensikan
dengan ddH2O sebanyak 25 ml menggunakan spatula. Resuspensi bakteri
dipindahkan ke dalam labu Erlenmeyer 50 ml dan digunakan sebagai inokulum.
Inokulasi pada tanaman dilakukan dengan cara menggunting ujung daun ke-3 dan
ke-4 dari setiap tanaman (Gambar 3). Gunting dicelupkan terlebih dahulu ke
dalam inokulum setiap akan menggunting satu daun. Konsentrasi inokulum
sebesar 109 CFU/ml. Tanaman padi diinokulasi setelah berumur 3-4 minggu
karena pada umur tersebut tanaman padi memasuki fase vegetatif.
a

b

Gambar 3 Proses inokulasi isolat bakteri dengan metode pengguntingan (a) dan
pemberian air menggunakan sprinkle dilakukan untuk menjaga
kelembaban (b)
Pengamatan terhadap penyakit HDB dilakukan pada hari ke-14 setelah
proses inokulasi. Intensitas serangan bakteri dihitung dengan membagi panjang
serangan dengan panjang daun yang diinokulasi yaitu daun ke-3 dan daun ke-4.
Hasil pengamatan terhadap tingkat keparahan serangan Xoo, diklasifikasikan
berdasarkan kriteria ketahanan menurut Standard Evaluation System (IRRI 1996)
dan disesuaikan dengan kondisi di setiap set pengujian berdasarkan tanaman
kontrol peka. Kriteria ketahanan varietas padi terhadap penyakit HDB disajikan
pada Tabel 4.
Tabel 4 Kriteria ketahanan varietas padi terhadap penyakit HDB (IRRI 1996)
No
1
2
3

Intensitas serangan (IS)
IS≤20%
20%40%

Tingkat ketahanan
Tahan (T)
Agak Tahan (AT)
Peka (P)

10

Isolasi DNA
Benih padi yang digunakan dikecambahkan pada cawan petri dengan media
kertas saring yang dibasahi dengan air. Benih-benih tersebut dibiarkan
berkecambah pada suhu ruang sampai berumur 2 minggu. Daun-daun padi dari
kecambah yang tumbuh dipanen untuk ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA dilakukan
dengan menggunakan metode Doyle & Doyle (1990) dengan sedikit modifikasi
dalam proses perusakan sel jaringan tanaman padi yaitu dengan menggunakan alat
ekstraksi DNA tissuelyserII Qiagen. Sebanyak 0.5 gram sampel daun padi
dipotong kecil-kecil agar dapat dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf
berukuran 2 ml, kemudian direndam dalam nitrogen cair selama 2 menit. Tabung
dimasukkan ke dalam mesin tissuelyser selama 2 menit dengan frekuensi 25/detik,
kemudian ditambah 750 µl buffer CTAB 2%. Sampel diinkubasi selama 30 menit
pada suhu 600C, kemudian ditambah 750 µl larutan kloroform isoamil alkohol
(24:1). Sampel disentrifugasi dengan Legend Micro 17 R centrifuge selama 5
menit pada suhu 40C dan kecepatan 12.000 rpm. Supernatan diambil sebanyak
500 µl dan dipindahkan ke dalam tabung baru, kemudian ditambah 100 µl natrium
asetat 3 M pH 5.2 dan 1000 µl etanol absolut. Sampel didiamkan di dalam lemari
es selama 60 menit. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi kembali pada 12.000 rpm
dengan suhu 40C selama 10 menit. Selanjutnya supernatan dibuang kemudian
endapan ditambah dengan 200 µl etanol 70% untuk membilas. Endapan tersebut
kemudian dikeringkan dan dilarutkan dalam 100 µl TE (Tris-HCl 40 mM pH 8.3,
EDTA 1 mM) sebagai larutan stok DNA dan ditambahkan RNAse agar diperoleh
DNA yang tidak terkontaminasi oleh RNA.

Pengenceran Konsentrasi DNA
Konsentrasi DNA diukur dengan menggunakan spektrofotometer NanoDrop
2000, dimana DNA yang diukur diambil sebanyak 1 µl dari DNA stok. Setelah
diukur konsentrasinya, suspensi DNA tersebut kemudian diencerkan hingga
konsentrasi akhir 10 ng/µl untuk proses amplifikasi DNA menggunakan mesin
PCR (Thermal Cycler) DNA Engine Tetrad 2 MJ Research.

Analisis PCR untuk Survei Polimorfisme
Reaksi PCR untuk survei polimorfisme dilakukan dengan menggunakan
volume 10 µl terdiri atas 4.5 µl master mix PCR KAPA®, 1.5 µl primer, dan 4 µl
DNA. Master mix PCR KAPA® mengandung Taq DNA Polymerase 5 U/µl,
dNTP mix 10mM, MgCl2 25 mM, dan loading dye. Primer yang digunakan
sebanyak 208 primer yang terdiri atas beberapa primer marka SSR untuk gen Xa7
dan primer marka STS untuk gen Xa1, Xa4, Xa7, Xa13, Xa21, Xa22, dan Xa26.
DNA yang digunakan adalah DNA dari padi TN1 sebagai tanaman padi kontrol
peka dan padi IRBB7 sebagai tanaman padi kontrol tahan penyakit HDB.
Tahap-tahap PCR dengan menggunakan marka STS meliputi proses
denaturasi awal 4 menit pada suhu 950C, dilanjutkan denaturasi selama 45 detik
pada suhu 950C, annealing selama 45 detik pada suhu 550C, ekstensi primer

11

selama 30 detik pada suhu 720C. Tahap denaturasi, annealing dan ekstensi primer
diulang sebanyak 27 kali, dengan program penurunan suhu annealing secara
teratur dengan perbedaan sebanyak 0.50C setiap siklusnya supaya diperoleh suhu
optimum untuk penempelan primer, kemudian diikuti dengan proses ekstensi
primer akhir selama 5 menit pada suhu 720C. Tahap terakhir adalah inkubasi pada
suhu 100C selama 30 menit (Utami et al. 2011).
Proses PCR menggunakan marka SSR meliputi proses denaturasi awal 3
menit pada suhu 950C, dilanjutkan denaturasi selama 1 menit pada suhu 940C,
annealing selama 1 menit pada suhu 500C, ekstensi primer selama 2 menit pada
suhu 720C. Tahap denaturasi, annealing dan ekstensi primer diulang sebanyak 35
kali, kemudian diikuti dengan proses ekstensi primer akhir selama 5 menit pada
suhu 720C. Tahap terakhir adalah inkubasi pada suhu 100C selama 30 menit
(Utami et al 2009).

Analisis PCR untuk Identifikasi Gen Ketahanan HDB
Proses identifikasi gen ketahanan HDB padi dilakukan dengan PCR.
Komposisi PCR yang digunakan sama dengan komposisi PCR untuk survei
polimorfisme yaitu 4.5 µl master mix KAPA®, 1.5 µl primer hasil survei
polimorfisme (Tabel 5), dan 4 µl DNA dari 37 galur-galur uji material genetik, 22
varietas padi diferensial, dan 1 padi kontrol peka. Tahap-tahap PCR juga sama
dengan kondisi PCR pada uji survei polimorfisme.
Tabel 5 Primer hasil survei polimorfisme
No

Nama primer

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Xa1-OP5
Xa1-OP7
Xa1-OP13
Xa1-OP14
Xa1-OP15
Xa1-OP31
Xa4-OP28
Xa4-OP44
Xa4-OP50
Xa7-OP40
Xa7-OP51
Xa7-OP54
Xa13-OP51
Xa21-OP6
Xa21-OP27
Xa22-OP17
Xa26-OP1
Xa26-OP2
Xa7-RM20590

Jenis
marka
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
STS
SSR

Sekuen primer forward (5’→3’)

Sekuen primer reverse (5’→3’)

TTTCTGGCGCTTTTTCTTGT
TCATTCAATCAAATCTCAACTGAAG
ACGGCCCTACTGATCAATGC
CTAGCTTTTGAGGCGGTGAC
CATGGAATCTTGCCCCTAGA
CCTCTCTTGCTTCCTTGTGG
TTTCTTTCATGCTGGTGCTG
GGGGCTCTAGGTTTTCCATC
TTCGGGTATGCCTTGTTTTC
CTACACACGCGAGGAAGACA
GAATTGGCCCAACTTTGAGA
GGCAAGTGTTCGACCGTTAT
ACGTGTCCAATCAAAGCACA
AGCTAGCTGCTCGCAATCTC
ATGAATCCCTGCCCGTCGTA
TGCACACTTGGTTTCAGCTC
TGACCTCACTGCACTTCTGG
GTAAAGCGTCACGGAAGAGC
TTCGATGAGCACCTTTCCTTGTCC

CGACCAACAGCATGTACCAC
CATGTTTTGGACGCTTCCTC
TCGAGTTATGATGCGGATACAC
GGATGCACGAATACACTGCT
CGCTATCGACCTGAGGAGAC
GCTCAAGCACTCACCAAACA
CAAGTCTTTTGCCGCTTTTC
GTAGGGAACCATGGATGTGG
GGCCGAATTACGTGTGAAGT
ATGGCAGTAGCGTAGCGAGT
TGGGATTTGGGATTTGGATA
AGGCCTAAGAAAGGCGAAAG
GTCAAACGTTGCAAGCAAAA
CTAGCCTCGCCTTCTACGAC
GATTCAGTACCTGACGAG
TCTCCTTTGCTACGGCAGAT
TGGAGAGGTTCCCTATGGTG
TTCTTCAACGTCACAACAACATC
GCCTCGCCGATTCACTTATGC

Elektroforesis DNA
Sebanyak 2 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml buffer TAE 1X (TrisHCl 40 mM pH 8.3, asam asetat 1.98 mM, EDTA 1 mM) dan dipanaskan dalam
microwave selama kurang lebih 3 menit. Setelah gel agarosa memadat, gel
dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi buffer TAE 1X. Sebanyak

12

4 µl produk PCR dielektroforesis. Disertakan 100 bp ladder sebagai marker untuk
melihat ukuran DNA. Selanjutnya gel direndam dalam Ethidium Bromide (10
mg/l) selama 10 menit untuk proses pewarnaan DNA. Setelah itu direndam
dengan akuades selama 10 menit untuk penghilangan warna pada gel. Gel agarose
selanjutnya divisualisasi dengan ChemiDocTM XRS + System with Image LabTM
Software Bio-Rad untuk melihat pita DNA yang diperoleh.
Analisis Data
Tingkat ketahanan tanaman padi terhadap penyakit HDB dianalisis genotipe
berdasarkan ada atau tidaknya pita DNA pada gel elektroforesis dari masingmasing galur tanaman padi yang diuji dan dihitung ukuran pita yang diperoleh.
Hasil analisis genotipe diasosiasikan dengan hasil analisis berdasarkan
pengamatan fenotipe. Analisis dilakukan menggunakan program Tassel 3.0.
Marka yang berasosiasi dengan respon fenotipe (p_Value kurang dari 0.05)
menunjukkan bahwa marka tersebut berasosiasi dengan respon ketahanan
tanaman terhadap Ras penyakit HDB yang diinokulasikan.

4 HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
Uji Fenotipe
Pada penelitian ini padi varietas diferensial dan galur-galur uji memberikan
respon ketahanan yang berbeda-beda terhadap penyakit Hawar Daun Bakteri
(HDB). Hal ini ditunjukkan pada Gambar 4

1

2

3

Gambar 4 Galur padi yang tahan terhadap penyakit HDB (IS≤20%) (1), galur padi
yang agak tahan terhadap penyakit HDB (20%40%) (3)
a. Respon ketahanan varietas diferensial (IRBB)
Varietas diferensial menunjukkan respon yang berbeda terhadap ras III, ras
IV dan ras VIII (Tabel 6). Untuk varietas-varietas diferensial yang memiliki satu
gen ketahanan (monogenik), respon paling tahan ditunjukkan oleh varietas padi
IRBB7 yang mengandung gen ketahanan Xa7, dimana varietas IRBB7 ini mampu
bertahan terhadap serangan patogen ras III, ras IV dan ras VIII dengan panjang
serangan 0%. Selanjutnya respon ketahanan ditunjukkan pada varietas diferensial
IRBB5 yang mengandung gen ketahanan Xa5 dan IRBB21 yang mengandung gen

13

ketahanan Xa21. Pada padi IRBB5, memperlihatkan respon tahan terhadap
serangan patogen ras III dan ras IV, serta respon agak tahan terhadap ras VIII,
dengan intensitas serangan berturut-turut 7.60%, 12.08% dan 23.57%.
Padi IRBB21, memperlihatkan respon tahan terhadap patogen ras III dan ras
VIII, serta respon agak tahan terhadap patogen ras IV, dengan intensitas serangan
berturut-turut 5.60%, 15.88% dan 21.28% (Tabel 6).
Tabel 6 Respon ketahanan padi varietas diferensial terhadap HDB
No

Varietas

Gen

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22

IRBB1
IRBB2
IRBB3
IRBB4
IRBB5
IRBB7
IRBB8
IRBB10
IRBB11
IRBB13
IRBB14
IRBB21
IRBB50
IRBB51
IRBB52
IRBB53
IRBB54
IRBB56
IRBB57
IRBB58
IRBB64
IRBB66

Xa1
Xa2
Xa3
Xa4
Xa5
Xa7
Xa8
Xa10
Xa11
Xa13
Xa14
Xa21
Xa4+Xa5
Xa4+Xa13
Xa4+Xa21
Xa5+Xa13
Xa5+Xa21
Xa4+Xa5+Xa13
Xa4+Xa5+Xa21
Xa4+Xa13+Xa21
Xa4+Xa5+Xa7+Xa21
Xa4+Xa5+Xa7+Xa13
+Xa21

23

TN1

Respon ketahanan terhadap HDB
Ras III
Ras IV
Ras VIII
IS (%)
Respon
IS (%)
Respon
IS (%) Respon
10.20
T
36.00
AT
51.53
P
10.10
T
37.08
AT
50.43
P
9.70
T
49.75
P
56.35
P
9.70
T
47.90
P
49.33
P
7.60
T
12.08
T
23.57
AT
0.00
T
0.00
T
0.00
T
11.10
T
46.83
P
32.05
AT
11.20
T
53.00
P
46.67
P
10.80
T
52.38
P
50.22
P
9.00
T
44.32
P
46.22
P
12.20
T
53.25
P
43.22
P
5.60
T
21.28
AT
15.88
T
5.40
T
5.05
T
11.82
T
10.10
T
46.08
P
46.22
P
4.20
T
12.92
T
9.45
T
3.40
T
4.70
T
6.25
T
3.80
T
5.47
T
5.62
T
5.80
T
5.63
T
11.37
T
10.00
T
40.00
AT
30.35
AT
8.10
T
8.82
T
17.50
T
1.10
T
0.22
T
3.03
T
1.20

T

1.48

T

3.22

T

43.70

P

79.93

P

63.65

P

Keterangan: T: Tahan, AT: Agak Tahan, P: Peka.

Varietas diferensial IRBB1 yang mengandung gen Xa1, relatif memiliki
kesamaan dengan varietas IRBB2 yang mengandung gen Xa2. Keduanya
memiliki respon yang sama terhadap patogen. Varietas IRBB1 dan IRBB2 tahan
terhadap patogen ras III, agak tahan terhadap ras IV dan peka terhadap ras VIII.
Respon lain ditunjukkan oleh varietas IRBB8 yang mengandung gen ketahanan
Xa8. Varietas IRBB8 ini tahan terhadap patogen ras III, agak tahan pada ras VIII,
tetapi peka terhadap patogen ras IV. Varietas diferensial yang lain menunjukkan
respon tahan terhadap patogen ras III tetapi peka terhadap patogen ras IV dan
VIII.
Tabel 6 memperlihatkan beberapa gen ketahanan HDB yang berbeda
memiliki respon yang sama terhadap gen virulen pathogen ras tertentu. Misalnya
gen Xa1 dan Xa2 yang memiliki respon sama terhadap ras III, ras IV dan ras VIII.
Hal ini mungkin dipengaruhi oleh interaksi gene to gene antara gen ketahanan
HDB pada tanaman inang dan gen virulen (avr) pada patogen HDB. Pada
tanaman inang umumnya gen yang memberikan respon tahan bersifat dominan

14

(R), sedangkan gen yang memberikan respon rentan bersifat resesif (r). Pada
patogen, gen avirulen (tidak memiliki kemampuan untuk menginfeksi) bersifat
dominan (Avr), sedangkan gen virulen (mampu menginfeksi) bersifat resesif
(avr). Pada interaksi Avr-R bersifat incompatible, artinya tanaman inang memiliki
gen ketahanan (R) yang mampu mengenali gen avirulen (Avr) dari patogen
sehingga tanaman bersifat tahan. Interaksi Avr-r bersifat compatible, tanaman
tidak memiliki gen ketahanan R untuk mengenali gen avirulen dari patogen
sehingga patogen dapat menyerang dengan gen virulen yang lain.interaksi avr-R
menyebabkan respon rentan karena meskipun tanaman mempunyai gen ketahanan
R , patogen tidak memiliki gen avirulen yang dikenali oleh gen ketahanan R
sehingga mekanisme pertahanan tidak diaktifkan. Interaksi avr-r menimbulkan
reaksi rentan karena tanaman tidak memiliki ketahanan dan patogen bersifat
virulen sehingga patogen menyerang tanaman (Agrios 2005). Dengan demikian
diduga bahwa gen-gen ketahanan yang memiliki respon sama tersebut sama-sama
bersifat dominan pada ras tertentu sehingga bersifat incompatible pada satu ras
atau beberapa ras tertentu.
Varietas diferensial yang memiliki dua gen ketahanan (digenik) dan varietas
diferensial yang memiliki lebih dari dua gen ketahanan (multigenik) ternyata
memiliki respon yang berbeda dengan varietas yang monogenik. Hal ini biasa
disebut dengan pyramiding gene effect. Efek ini dapat menimbulkan respon positif
(tahan). Varietas yang menunjukkan pyramiding gene effect pada penelitian ini
salah satunya adalah varietas IRBB50 (Xa4+Xa5). Gen Xa4 yang berada dalam
keadaan tunggal (single gene) menunjukkan respon tahan terhadap patogen ras III,
tetapi peka terhadap patogen ras IV dan ras VIII, sedangkan Xa5 dalam keadaan
gen tunggal menghasilkan respon tahan terhadap patogen ras III dan ras IV, serta
agak tahan terhadap patogen ras VIII. Jika kedua gen tersebut terdapat dalam satu
varietas seperti pada varietas diferensial IRBB50, maka akan menghasilkan
respon positif yang tahan terhadap semua serangan patogen ras III, ras IV dan ras
VIII. Respon positif yaitu tahan terhadap serangan patogen untuk semua ras, hal
ini juga ditunjukkan oleh varietas IRBB52 yang mengandung gen Xa4 dan Xa21,
IRBB53 yang mengandung gen Xa5 dan Xa13, IRBB54 yang mengandung gen
Xa5 dan Xa21, IRBB56 yang mengandung gen Xa4, Xa5 dan Xa13, IRBB57 yang
mengandung gen Xa4, Xa5 dan Xa21, IRBB58 yang mengandung gen Xa4, Xa13
dan Xa21, IRBB64 yang mengandung gen Xa4, Xa5, Xa7 dan Xa21, dan IRBB66
yang mengandung gen Xa4, Xa5, Xa7, Xa13 dan Xa21. Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa gene pyramiding mampu membentuk varietas yang memiliki
sifat ketahanan yang lebih luas (Huang et al. 1997) dan menjadi cara yang paling
efektif untuk menanggulangi patogen yang kemungkinan berubah sifat
patogenitasnya dari waktu ke waktu (Jeung et al. 2006).
Varietas differensial yang memiliki gen digenik tetapi respon ketahanan
terhadap patogen ras tertentu menunjukkan hasil yang sama dengan varietas
diferensial yang monogenik ditunjukkan oleh varietas IRBB51 yang mengandung
gen Xa4 dan Xa13, dimana kedua gen tersebut secara bersama-sama menunjukkan
respon ketahanan yang sama dengan monogenik Xa4 dan Xa13 terhadap patogen
ras IV dan ras VIII. Varietas IRBB4 yang mengandung gen Xa4 dan IRBB13
yang mengandung gen Xa13 memiliki respon tahan terhadap ras III, tetapi peka
terhadap ras IV dan ras VIII. Ketika kedua gen Xa4 dan Xa13 terdapat dalam satu
varietas yaitu IRBB 51, ternyata respon yang dihasilkan tetap sama seperti ketika

15

gen-gen tersebut belum digabungkan, yaitu tahan terhadap ras III dan peka
terhadap ras IV dan ras VIII. Dalam hal ini respon menunjukkan bahwa kedua gen
ketahanan tersebut hanya mampu mengenali gen virulen dari ras III. Hasil yang
berbeda ditunjukkan pada respon tanaman IRBB53 yang mengandung gen
ketahanan Xa5 dan Xa13, Xa5 memberikan efek positif (bersifat dominan)
sehingga ketika digabungkan dengan gen Xa13 maka akan tetap memberikan
respon yang tahan terhadap semua ras yang diujikan.

Gambar 5 Ketahanan padi varietas diferensial terhadap ras III, ras IV, dan ras VIII
Semua varietas diferensial yang digunakan pada penelitian ini menghasilkan
respon tahan terhadap patogen ras III, 10 varietas diantaranya juga tahan terhadap
patogen ras IV atau ras VIII (Gambar 5). Varietas yang tahan terhadap ras IV
adalah IRBB5, IRBB7, IRBB50, IRBB52, IRBB53, IRBB54, IRBB56, IRBB58,
IRBB64, dan IRBB66, sedangkan yang tahan terhadap Ras VIII adalah IRBB7,
IRBB21, IRBB50, IRBB52, IRBB53, IRBB54, IRBB56, IRBB58, IRBB64, dan
IRBB66. Di antara 22 varietas differensial yang digunakan, terdapat 9 varietas
yang tahan terhadap ras III, ras IV dan ras VIII. Varietas yang tahan terhadap
ketiga ras patogen adalah IRBB7, IRBB50, IRBB52, IRBB53, IRBB54, IRBB56,
IRBB58, IRBB64, dan IRBB66 (Tabel 6).
b. Respon ketahanan pada galur-galur uji
Penelitian ini menggunakan galur-galur uji sebanyak 37 galur, 1 tanaman
kontrol tahan (IRBB7) dan 1 tanaman kontrol peka (TN1). Pemilihan tanaman
kontrol tahan didasarkan pada hasil uji lapang pada penelitian Utami et al. (2007)
bahwa padi IRBB7 mampu bertahan dari serangan penyakit HDB ras III, IV dan
VIII.
Galur uji yang digunakan dalam penelitian ini memberikan respon
ketahanan yang bervariasi terhadap setiap ras patogen yang diinokulasikan.
Sebagian besar tahan atau agak tahan terhadap 2 ras. Hanya 4 galur yang tahan
terhadap ketiga ras patogen, yaitu IR 3822-512-3-2-2, IR 82571-581-1-2-3, IR
82571-602-3-2-2, dan Beras Merah D1 (Tabel 7).

16

Pada Gambar 6 dapat diketahui bahwa pada ras III, terdapat 7 galur uji yang
tahan, 16 galur uji bersifat agak tahan dan 14 galur uji bersifat peka. Respon
ketahanan terhadap ras IV menunjukkan 13 galur bersifat tahan, 13 galur uji
bersifat agak tahan dan 11 galur uji bersifat peka. Sedangkan respon ketahanan
terhadap ras VIII menunjukkan 5 galur uji bersifat tahan, 10 galur uji bersifat agak
tahan da