3
II. METODOLOGI 2.1 Penyediaan Bakteri Probiotik
Bakteri probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri NP5, yang merupakan bakteri dari genus Bacillus. Bakteri NP5 ini merupakan bakteri
yang diisolasi dari saluran pencernaan ikan nila dan telah dilakukan beberapa uji seperti uji ketahanan terhadap pH asam, uji penempelan, serta uji patogenisitas
Putra 2010. Penyediaan bakteri probiotik diawali dengan menumbuhkan bakteri NP5 ke dalam media Trypticase Soy Agar TSA miring dan diinkubasi selama 24
jam dalam inkubator. Setelah itu dilakukan kultur bakteri NP5 dalam 10 ml media Trypticase Soy Broth TSB steril dan diinkubasi selama 24 jam di dalam water
bath shaker dengan kecepatan 140 rpm. Selanjutnya dilakukan pemanenan bakteri probiotik dengan memindahkan suspensi bakteri ke dalam tabung Corning dan
disentrifuse selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm yang bertujuan untuk memisahkan bakteri probiotik dengan media kulturnya. Kemudian dilakukan
pencucian dengan menambahkan Phosphate Buffer Saline PBS steril sebanyak 10 ml, lalu dihomogenkan dengan menggunakan vortex dan disentrifuse kembali
dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Setelah itu dilakukan tahap pencucian kedua dengan menambahkan 4 ml PBS steril lalu dihomogenkan
dengan vortex dan suspensi bakteri probiotik siap dicampurkan ke dalam pakan.
2.2 Ekstraksi OligosakaridaPrebiotik
Prebiotik yang digunakan berasal dari ubi jalar varietas sukuh Ipomea batatas L.. Proses ekstraksi oligosakarida dilakukan dengan menggunakan etanol
70 sebagai pelarutnya, mengacu pada metode Muchtadi 1989. Sebanyak 10 gram tepung kukus ubi jalar dilarutkan ke dalam etanol 70 sebanyak 100 ml dan
diaduk dengan menggunakan magnetic stirer selama 15 jam pada suhu ruang. Setelah itu larutan diendapkan lalu disaring dengan menggunakan kertas saring
steril. Cairan hasil penyaringan disentrifuse selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm untuk mengendapkan sisa residu yang tertinggal. Selanjutnya dilakukan
penyaringan kembali dengan menggunakan kertas saring steril dan filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan evaporator vacuum pada suhu 40
o
C.
4 Hasil pemekatan diencerkan dengan akuades steril dengan jumlah yang ditentukan
melalui perhitungan total padatan terlarut TPT.
2.3 Perhitungan Total Padatan Terlarut
Total padatan terlarut TPT diukur berdasarkan metode Apriyantono et al. 1989 yang bertujuan untuk melihat kepekatan padatan terlarut prebiotik yang
berguna pada analisa oligosakarida. Cawan porselin dikeringkan dalam oven selama 1 jam dengan suhu 100
˚C, kemudian didinginkan selama 30 menit agar berat cawan stabil dan cawan ditimbang a gram. Sebanyak 1 ml ekstrak
oligosakarida ditempatkan dalam cawan porselin tersebut dan cawan ditimbang b gram. Kemudian cawan yang berisi ekstrak oligosakarida dimasukkan ke dalam
oven bersuhu 100 ˚C selama 24 jam, lalu cawan tersebut didinginkan dalam
desikator selama 30 menit agar berat cawan stabil dan cawan ditimbang c gram. Total padatan terlarut dihitung berdasarkan hasil perbandingan berat ekstrak
setelah dikeringkan dengan berat ekstrak sebelum dikeringkan. TPT =
x 100 Keterangan:
a = berat cawan sebelum diisi ekstrak oligosakarida
b = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida
c = berat cawan setelah diisi ekstrak oligosakarida dan dioven 24 jam
2.4 Pengujian Sinbiotik secara In Vivo 2.4.1 Persiapan Wadah dan Ikan Uji
Kategori