Karakterisasi Biokimia Dan Amobilisasi Glukosa Oksidase Dari Aspergillus Niger Ipbcc.08.610 Pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi

KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN AMOBILISASI GLUKOSA
OKSIDASE DARI ASPERGILLUS NIGER IPBCC.08.610 PADA
ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI

TITI ROHMAYANTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Karakterisasi
Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari Aspergillus niger
IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar
Pustaka di bagian akhir disertasi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016
Titi Rohmayanti
NIM G851140111

RINGKASAN
TITI ROHMAYANTI. Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase
dari Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi.
Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan AKHIRUDDIN MADDU.
Penggunaan enzim saat ini sangat luas diberbagai bidang, seperti bidang
pangan, kesehatan, pertanian, maupun energi namun, Indonesia masih menjadi
pengimpor enzim terbesar. Salah satu enzim yang banyak digunakan adalah glukosa
oksidase (GOD). GOD merupakan enzim yang mengatalisis oksidasi dari β-Dglukosa menjadi D-glukono- -lakton dan hidrogen peroksida menggunakan
molekul oksigen sebagai penerima elektron. GOD pada penelitian ini diproduksi
langsung dari isolat lokal Aspergillus niger yang diisolasi dari tanaman pagar
Dryobalanops di daerah Tarakan, Kalimantan Utara. Aplikasi dari GOD ke
permukaan elektroda membutuhkan sistem amobilisasi. Proses amobilisasi enzim
yang tepat dianggap dapat meningkatkan kinerja elektroda. Amobilisasi GOD ke
nanofiber-polianilin pada permukaan elektroda pasta karbon diduga dapat

meningkatkan konduktansi elektroda.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan karakteristik kinetika aktivitas
GOD hasil pemurnian (NH4)2SO4 80% jenuh dan hasil amobilisasi GOD pada
elektroda pasta karbon termodifikasi (EPKT) nanofiber polianilin. Penilitian ini
terdiri atas sembilan tahap yakni: (1) Produksi dan isolasi GOD dari A.niger
IPBCC.08.610; (2) Pemurnian GOD dengan (NH4)2SO4 80% jenuh; (3) Uji
aktivitas GOD; (4) Kinetika GOD hasil pemurnian; (5) Optimasi ukuran diameter
tembaga Elektroda Pasta Karbon (EPK); (6) Pengukuran voltamogram siklik
elektroda pasta karbon (EPK) dan elektroda pasta karbon termodifikasi (EPKT); (7)
Amobilisasi GOD pada EPKT; (8) Pengukuran voltamogram siklik EPKT
teramobilisasi dan GOD yang tidak diamobilisasi; dan (9) Kinetika GOD
teramobilisasi pada EPKT.
Hasil penelitian diperoleh GOD dengan aktivitas tertinggi dihasilkan secara
intraseluler oleh A.niger. Ekstrak kasar GOD intraseluler kemudian dimurnikan
dengan pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh dan menghasilkan aktivitas spesifik
sebesar 27.77 U/mg. Tingkat kemurnian yang dihasilkan mencapai 20.22 kali dari
ekstrak kasarnya dengan yield sebesar 72.86%. Tembaga dengan diameter 3 mm
memiliki nilai knduktansi yang lebih baik. Nanofiber polianilin meningkatkan
konduktansi EPK sehingga lebih baik digunakan sebagai media amobilisasi glukosa
oksidase. Metode amobilisasi dengan penambahan glutaraldehida sebagai agen

pengikat silang GOD, dapat meningkatkan kinerja GODamo-IPB|EPKT. Karakteristik
kinetika GOD yang teramobil pada elektroda dapat menurunkan nilai Km (3.1 mM)
dan Imax yang dihasilkan besar (3.689 mA), sensitivitas yang tinggi 1.09 mA/mM
dan range konsentrasi glukosa sebesar 0.2-2 mM. Range konsentrasi glukosa ini
dapat digunakan dalam mendeteksi kadar glukosa dalam darah yakni sebesar 56.4
mg/dL selain itu, range ini juga dapat diaplikasikan dalam mendeteksi glukosa pada
buah peach (0.9 mM). GODamo-IPB|EPKT pada penelitian ini berpotensi untuk
dijadikan biosensor glukosa.
Kata kunci: Aspergillus niger, glukosa oksidase, amobilisasi enzim, elektroda pasta
karbon

SUMMARY

TITI ROHMAYANTI. Biochemistry Characterization and Immobilization Glukosa
Oxidase from Aspergillus niger IPBCC.08.610 Onto Modified Carbon Paste
Electrode. Supervised by LAKSMI AMBARSARI and AKHIRUDDIN MADDU.
Enzyme production based on microorganism is one of progressive step in
many fields such as food, agriculture, health and energy. One of widely used
enzyme is glucose oxidase (GOx). GOx is an enzyme that catalyze the oxidation of
β-D-glucose into D-gluconolactone and hydrogen peroxide. Nowadays, GOx was

generally applied to biosensor and other commercial applications. In this research,
GOx was produced directly from local Aspergillus niger which was isolated from
local vine Dryobalanops in Tarakan, East Borneo, Indonesia. GOx is very
interesting to be utilized as an electron transfer agent in biosensor because it has
specific substrate with high specificity. Glucose utilization as a substrate is very
convenient because glucose is abundant and sound. GOx application onto electrode
in biosensor system needs immobilization process. The immobilization process of
appropriate enzyme can elevate electrode performance. GOx immobilization into
polyaniline-nanofiber at carbon pasta electrode surface is presumably to rise
electrode conductance in biosensor. Nanometer-sized polyaniline widens electrode
surface so that its application may be more economically efficient.
The aim this research is to analyze biochemistry characteristic of GOx to
apply as glucose biosensor This research has seven objectives that include the
following: (1) GOx production and isolation from A.niger IPBCC.08.610; (2) GOx
purification using saturated (NH4)2SO4 80%; (3) GOx activity assay; (4) Enzyme
kinetics equation; (5) Optimation of diameter size carbon paste electrode (CPE); (6)
Measurement of CPE and modified carbon paste electrode (MCPE) cyclic
voltamogram; (7) Immobilization of GOx into MCPE; (8) Measurement of MCPEimmobalization GOx and MCPE-unimmobalized GOx cyclic voltamogram
performance; and (9) Immobilized GOx kinetics in MCPE.
GOx had purity level of 20.22 times of crude extract. Polyaniline-nanofiber

evolved CPE conductance, affectes itself as a better glucose oxidase immobilization
media. Enzyme immobilization was done by adding glutaraldehyde as the crosslinker agent of GOD, increased GODimmo-IPB|MCPE performance. GODimmoIPB|MCPE is potential to be developed as glucosa biosensor because it possessed
enough high Km, Imax, sensitivity, and glucose concentration range, those were
respectively 2.86 mM, 3.8 mA, 1.09 mA/mM and 0.2-4 mM.
Key words: Aspergillus niger; glucose oxidase; enzyme immobilization; carbon
paste electrode

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

KARAKTERISASI BIOKIMIA DAN AMOBILISASI GLUKOSA
OKSIDASE DARI ASPERGILLUS NIGER IPBCC.08.610 PADA
ELEKTRODA PASTA KARBON TERMODIFIKASI

TITI ROHMAYANTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:

Dr Nisa Rachmania, MSi

Judul Tesis

: Karakterisasi Biokimia dan Amobilisasi Glukosa Oksidase dari

Aspergillus

niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon

Termodiikasi
Nama

: Titi Rohmayanti

NIM

: 0851140111

j

Disetu ui oleh
Komisi Pembimbing

�·
Dr Laksmi Ambarsari, MS

Dr Akh

Ketua

�din Maddu, MSi
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

j

Tanggal U ian: 19 Agustus 2016

Tanggal Lulus:

2 3 St� LO.i6

PRAKATA
Alhamdulillah, puji syukur penulis ucapakan ke hadirat Allah SWT yang
selalu melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis bisa menyelesaikan
tesis yang berjudul “Karakterisasi Biokimia dan Amoblisasi Glukosa Oksidase dari
Aspergillus niger IPBCC.08.610 pada Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi”.
Penelitian ini dilakukan semata-mata berdasarkan pada firman Allah, yang
artinya: “Katakanlah: “Perhatikanlah apa yang ada di langit dan di bumi. Tidaklah
bermanfaat tanda-tanda kekuasaan Allah dan Rasul-rasul yang memberi peringatan
bagi orang-orang yang tidak beriman” (QS. 10:101). Kata ‘Perhatikanlah’ dapat
ditafsirkan sebagai ‘Lakukanlah Penelitian’. Ini merupakan suatu kalimat perintah
dari Allah untuk melakukan penelitian di berbagai disiplin ilmu pengetahuan,
terhadap apa yang ada dan terjadi dari alam raya sampai pada dasar bumi. Jika hal
ini tidak dilakukan, maka tanda-tanda kebesaran Allah Rabbul ‘Alamin dan RasulRasul-Nya yang memberi peringatan tidak akan bermanfaat bagi manusia, yaitu
bagi orang-orang yang tidak mempergunakan akal dan pikirannya dan keyakinan
akan kebesaran agama Islam.
Atas selesainya penlitian dan penyusunan tesis ini, Penulis mengucapkan
terima kasih kepada Dr Laksmi Ambarsari, MS dan Dr Akhiruddin Maddu, MSi
yang telah memberikan bimbingan, arahan, kritik, dan sarannya selama penelitian
dan penulisan tesis ini. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada

orang tua tercinta dan keluarga atas doa-doa yang telah terlantunkan. Terima kasih
juga penulis sampaikan kepada seluruh dosen dan staf Program Studi Biokimia, staf
laboratorium cendawan departemen Proteksi Tanaman, staf Bengkel Biofisika, dan
staf Laboratorium Bersama departemen Kimia yang telah membantu dalam hal
berdiskusi dan pengarahan selama penelitian serta teman-teman yang turut
memberikan bantuan, dukungan, motivasi, dan semangat selama penelitian dan
penulisan tesis.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan laporan
penelitian ini, maka diharapkan kritik dan saran yang membangun untuk perbaikan
dalam penulisan selanjutnya. Akhir kata penulis berharap tulisan ini dapat
bermanfaat dan menjadi sumbangan pemikiran bagi pihak yang membutuhkan.

Bogor, September 2016
Titi Rohmayanti

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

xii

DAFTAR LAMPIRAN

xii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Hipotesis Penelitian

1
1
2
2
2
3

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Prosedur Penelitian

3
3
4
4

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan

8
8
14

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

25
25
24

DAFTAR PUSTAKA

25

LAMPIRAN

29

RIWAYAT HIDUP

38

DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6

Jumlah Protein dan Aktivitas GOD
Parameter Kinetika GOD
Arus Oksidasi Puncak EPK Variasi Diameter Tembaga
Arus Oksidasi Puncak EPK dan EPKT
Arus Oksidasi Puncak Anoda GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT
Parameter Kinetika GODamo-IPB|EPKT

8
9
10
11
12
14

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6

Penentuan Kecepatan Awal Reaksi
8
Kurva Lineweaver-Burk
9
Voltamogram Siklik Kinerja EPK Variasi Diameter Tembaga
10
Voltamogram Siklik Kinerja EPK dan EPKT
11
Voltamogram Siklik Kinerja GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT 12
Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Arus GODIPB|EPKT dan
GODamo-IPB|EPKT
13
7 Kurva Lineweaver-Burk GODamo-IPB|EPKT
14
8 Stabilitas GODamo-IPB|EPKT
14
9 Pembentukan
Kompleks
Polianilin-Glutaraldehid-GOD
secara
Kovalen
21

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Bagan Alir Penelitian
29
Kurva Standar Glukosa dan Contoh Perhitungan kadar protein
30
Contoh perhitungan aktivitas GOD pengendapan amonium sulat 80% 31
Kinetika GOD raksi am sulat
32
Voltamogram siklik pengulangan EPK dan EPKT
33
Voltamogram siklik pengulangan GODIPB|EPKT
34
Kinetika GODamo-IPB|EPKT
35
Miselium A.niger, GOD ekstrak kasar, dan GOD
35
Elektroda pasta karbon
35
Alat potensiometer dan pengukuran elektroda
37

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam Indonesia masih perlu dioptimalisasi agar
dapat dijadikan objek penelitian yang sangat potensial. Produksi berbagai macam
enzim menggunakan mikroorganisme merupakan salah satu hal yang dapat
dikembangkan. Penggunaan enzim saat ini sangat luas diberbagai bidang, seperti
bidang pangan, kesehatan, pertanian, maupun energi. Ironisnya, sampai saat ini
Indonesia belum dapat memproduksi sendiri dan sepenuhnya masih bergantung
pada produk impor (Saryono 2008). Salah satu enzim yang banyak digunakan dan
dijual secara komersil adalah glukosa oksidase (GOD).
GOD merupakan enzim yang mengatalisis oksidasi dari β-D-glukosa
menjadi D-glukono- -lakton dan hidrogen peroksida menggunakan molekul
oksigen sebagai penerima elektron. D-glukono- -lakton lalu terhidrolisis secara
non-enzimatis menjadi asam glukonat dan FADH2-enzim yang tereduksi dioksidasi
kembali oleh molekul oksigen (Sabir et al. 2007). Enzim ini banyak digunakan
dalam industri untuk produksi asam glukonat dan sumber hidrogen peroksida dalam
pengawetan makanan (Ahmad et al. 2007). Selain itu, enzim ini juga digunakan
dalam biomedis untuk penentuan kadar glukosa darah. Penetapan kadar glukosa
darah menggunakan GOD baik secara kolorimetri maupun amperometri lebih
unggul dibandingkan dengan metode non-enzimatik lainnya karena GOD memiliki
spesifitas substrat yang tinggi terhadap β-D-glukosa (Ahmad et al. 2007). GOD
juga memiliki bilangan putaran dan kestabilan yang tinggi (Sherbenny et al. 2005).
Penggunaan GOD saat ini dikembangkan juga dalam aplikasi enzymatic fuel cell
(EFC) (Sabir et al. 2007). EFC merupakan salah satu jenis dari sel biofuel yang
menggunakan enzim sebagai biokatalis yang dapat mengubah energi biokimia
menjadi energi listrik secara langsung.
Nithiyaa et al. (2012) menemukan bahwa Aspergillus niger merupakan
sumber GOD yang paling baik karena enzim yang dihasilkan bersifat sangat stabil.
Penelitian Putri (2011) melaporkan bahwa isolat lokal A. niger IPBCC.08.610
berpotensi menghasilkan GOD. Berdasarkan Triana (2012) GOD yang dihasilkan
dari A. niger IPBCC.08.610 memiliki aktivitas total sebesar 92.87 U yang
terendapkan dengan baik pada (NH4)2SO4 80% jenuh dan konsentrasi substrat
untuk mencapai kecepatan maksimum (Km) sebesar 46 mM dengan laju maksimum
(vmaks) 11 U/mg. Selain itu, pada penelitian Selena (2014) aktivitas total GOD yang
diproduksi dari isolat lokal A. niger setelah dilakukan pemurnian dengan
kromatografi kolom filtrasi gel sebesar 126.41 U dengan nilai Km sebesar 39 mM.
GOD yang diproduksi langsung dari isolat lokal A.niger IPBCC.08.610 koleksi
Departemen Biologi IPB yang diisolasi dari serasah tanaman pagar Dryobalanops
di daerah Tarakan, Kalimantan Utara ini belum dikarakterisasi dan diaplikasikan
lebih lanjut pada elektroda.
Aplikasi dari GOD ke permukaan elektroda untuk sensor dan sel biofuel
membutuhkan sistem amobilisasi. Proses amobilisasi enzim yang tepat dianggap
dapat meningkatkan kinerja elektroda karena enzim dapat digunakan secara
berulang tetapi tetap stabil dan pemisahan antara produk dengan enzim dalam
larutan terjadi lebih mudah. Untuk mencapai efisiensi dalam mentransfer elektron,

2
penggunaan GOD sering dikombinasikan dengan senyawa mediator pada elektroda.
Pasta karbon yang dimodifikasi oleh nanofiber-polianilin digunakan dalam
penelitian ini sebagai mediator. Karbon dianggap memiliki biokompatibilitas,
stabilitas, dan konduktifitas (tidak korosif) yang baik sehingga tidak mempengaruhi
kinerja biologis (Surianty 2014). Polianilin merupakan bahan umum yang
digunakan dalam pembuatan elektroda pada biosensor, biofuel sel, dan aplikasi
super kapasitor dalam bentuk nano komposit. Berdasarkan Maddu et al. (2008),
nanofiber-polianilin disintesis dalam bentuk garam emeraldin dengan metode
interfasial polimerisasi. Penambahan polianilin ke dalam pasta karbon bertujuan
untuk menangkal ruang kosong antara partikel grafit sehingga dapat meningkatkan
konduktifitas listrik pada elektroda karena elektron akan ditransfer secara terus
menerus. Amobilisasi GOD ke nanofiber-polianilin pada permukaan elektroda
pasta karbon dapat digunakan sebagai bioanoda dalam aplikasi biofuel sel. GOD
akan bergerak ke permukaan elektroda menggunakan glutaraldehid sebagai
penghubung (Ambarsari et al. 2016).
Perumusan Masalah
Saat ini kebutuhan GOD semakin meningkat sehubungan dengan
pemanfaatannya sebagai biosensor glukosa dan bioanoda dalam biofuel sel.
Ironisnya Indonesia masih mengimpor enzim tersebut. Padahal iklim tropis dengan
tingkat kelembaban tinggi sangat mendukung pertumbuhan A. niger yang
merupakan sumber yang paling baik dalam menghasilkan GOD. Selain itu,
karakteristik biokimia GOD dari A. niger IPBCC.08.610 dan amobilisasinya pada
elektroda pasta karbon termodifikasi belum diketahui dan dianalisis untuk dapat
diaplikasikan lebih lanjut.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian adalah untuk mendapatkan karakteristik biokimia GOD
hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh yang dibandingkan dengan GOD hasil
amobilisasi menggunakan glutaraldehida pada elektroda pasta karbon termodifikasi
nanoserat polianilin.
Manfaat Penelitian
Melalui penelitian ini, diharapkan dapat memberikan informasi mengenai
karakteristik biokimia glukosa oksidase dari A. niger IPBCC.08.610 dan
amobilisasinya pada elektroda pasta karbon termodifikasi sehingga dapat dijadikan
panduan dalam aplikasi GOD pada biosensor glukosa.
Hipotesis
Hipotesis penelitian adalah terdapat GOD hasil amobilisasi pada EPKT yang
memiliki karakteristik biokimia yang lebih baik, efisien, dan ekonomis
dibandingkan GOD hasil pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh sehingga dapat
diaplikasikan sebagai biosensor glukosa.

3

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini berlangsung selama 9 bulan (September 2015 - Juni 2016).
Adapun tempat penelitian dilaksanakan di Laboratorium Penelitian Biokimia
FMIPA, Laboratorium Cendawan Departemen Proteksi Tanaman FAPERTA,
Laboratorium bersama Departemen Kimia FMIPA, dan Bengkel Departemen
Fisika FMIPA.
Alat dan Bahan
Alat
Pengukuran voltamogram siklik menggunakan potensiostat eDAQ EA163
yang dilengkapi program EChem v2.1.0, elektroda Ag|AgCl, dan elektroda Pt|Ti.
Peralatan lainnya antara lain alat-alat gelas, laminar air flow, neraca analatik,
tabung sentrifus, sentrifus (Beckman USA Mode J2-21), pipa kapiler, kawat
tembaga, pipet mikro, pipet volumetrik, mortar, pH meter (HANNA pH 21 pH/Mv
meter), penangas dan stirrer, autoklaf TOMY High Pressure Steam Sterilizer ES315, microplate COSTAR 96 , serta SPEKTROstar® Nano BMG LABTECH.
Bahan
Biakan isolat Aspergillus niger (IPBCC 08.610) koleksi Departemen
Biologi IPB yang diisolasi dari tanaman pagar di daerah Tarakan, Kalimantan
Utara, nanofiber-polianilin, glutaraldehida 2.5%, karbon grafit, orto-dianisidin dan
hidrogen peroksida (H2O2). Bahan-bahan lainnya terdiri atas media Potato
Dextrose Agar (PDA), sukrosa, pepton, (NH4)2HPO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4,
CaCO3, (NH4)2SO4 (ammonium sulfat), glukosa, pasir kuarsa, akuades steril, bufer
(natrium fosfat 0.1 M pH 6.0; fosfat sitrat 0.1 M pH 5.6; kalium fosfat 0.1 M pH
7.0, asetat 0.1 M pH 4.5), reagen Bradford, standar Bovine Serum Albumin (BSA),
akuabides, parafin, serbuk grafit, KCl 0.1 M, dan kalium ferisianida (Fe(CN)6), pipa
kapiler dan tembaga elektroda berdiameter 1 mm dan 3 mm.
Prosedur Penelitian
Produksi GOD (Modifikasi Singh dan Verma 2010)
Produksi GOD diawali dengan penyiapan media penyegaran, starter dan
produksi untuk A. niger. Bahan untuk media penyegaran adalah 1 gram PDA
dilarutkan dalam 25 mL akuades. Komposisi media starter, yaitu 0.4 g/L
(NH4)2HPO4; 0.2 g/L KH2PO4; 0.2 g/L MgSO4.7H2O; 10 g/L pepton; dan 70 g/L
sukrosa. Bahan-bahan untuk membuat media starter dilarutkan dalam 200 mL
akuades. Perbandingan larutan media dan labu Erlenmeyer yaitu 1:5. Media starter
dibagi dalam sepuluh Erlenmeyer 100 mL masing-masing diisi dengan 20 mL
media starter. Media produksi mengandung 0.4 g/L (NH4)2HPO4; 0.2 g/L KH2PO4;
0.2 g/L MgSO4.7H2O; 40 g/L CaCO3; 3.3 % sukrosa; dan 0.35 % glukosa. Media
diatur pada pH 5.5 dengan penambahan larutan H3PO4 1 M. Sebanyak sepuluh labu

4
Erlenmeyer 1 L disiapkan dan masing-masing diisi dengan 180 mL media produksi.
Setiap media disterilisasi dalam autoklaf 1210C selama 15 menit.
Sebanyak satu ose spora A. niger dipindahkan ke dalam agar-agar miring
PDA dengan metode cawan gores. Kemudian, agar-agar miring diinkubasi dalam
suhu ruang selama 3 hari. Spora dari stok media agar-agar miring isolat A. niger
sebanyak satu ose ditumbuhkan dalam media starter lalu diinkubasi pada suhu 300C
dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam. Selanjutnya subkultur tersebut
dimasukkan sebanyak 10% dari volume media produksi. Kemudian diinkubasi pada
suhu 300C kecepatan 120 rpm selama 40 jam. Setelah inkubasi, biakan berupa
miselium dipisahkan dari media pertumbuhan dengan cara disaring menggunakan
kain kasa. Hasil saringan berupa supernatan merupakan GOD ekstrak kasar
ekstraseluler. Berat miselium yang dihasilkan ditimbang dan digunakan untuk tahap
isolasi.
Isolasi GOD dari A. niger (Modifikasi Firman dan Aryantha 2003)
Enzim dalam sel diisolasi dengan cara penggerusan menggunakan mortar
steril dalam suhu 40C. Miselium hasil penyaringan digerus sampai halus
menggunakan pasir kuarsa dengan perbandingan 1:1. Sel yang telah lisis
ditambahkan dengan bufer natrium fosfat 0.1 M pH 6.0, kemudian disentrifugasi
pada kecepatan 12000 g suhu 40C selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan
merupakan ekstrak kasar GOD intraseluler. Ekstrak kasar diukur kadar protein dan
aktivitasnya lalu dilakukan tahap pemurnian dengan amonium sulfat.
Pemurnian GOD (Modifikasi Sherbeny et al. 2005)
Pemurnian GOD dilakukan melalui pengendapan dengan (NH4)2SO4 80%
jenuh. Larutan dihomogenisasi kemudian didiamkan selama semalam pada suhu
4oC, kemudian disentrifus pada kecepatan 12000 g dengan suhu 4oC selama 20
menit. Fraksi yang terendapkan dilarutkan dalam 1 mL bufer fosfat sitrat 0.1 M pH
5.6. Setiap fraksi yang diperoleh diukur kadar protein dan aktivitasnya.
Uji Aktivitas Glukosa Oksidase (Modifikasi Bergmeyer 1988)
Pereaksi pada pengujian aktivitas enzim terdiri atas 33.3 µL larutan glukosa
10% (b/v) yang didiamkan selama 1 jam setelah pembuatan agar terjadi mutarotasi,
160 µL o-dianisidin (6.6 mg o-dianisidin dalam 100 mL bufer kalium fosfat 0.1 M
pH 7), dan 20 µL hidrogen peroksidase 1 mg/mL dicampurkan dalam microplate.
Larutan diaduk selama 10 detik kemudian dibiarkan setimbang pada suhu ruang.
Nilai absorbannya diukur pada panjang gelombang 436 nm sebagai A0 hingga stabil.
Setelah itu, ditambahkan 20 µL GOD pada campuran dan diukur peningkatan nilai
absorbannya setiap 30 detik selama 5 menit pertama pada panjang gelombang 436
nm sebagai At. Laju awal ditentukan saat laju linear maksimum tercapai. Waktu
tercapainya laju awal digunakan sebagai waktu pengukuran untuk fraksi enzim
lainnya. Aktivitas enzim ditentukan melalui persamaan berikut.
Aktivitas enzim (U/mL) =

(At-Ao) x Vtotal ( δ) x Faktor Pengenceran
maks x d x Venzim ( δ) x t

5
Unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menggunakan satu
mikromol substrat per menit pada kondisi optimum.
Keterangan:
At = absorbansi pada menit ke-t
A0 = absorbansi pada menit ke-0
= koefisien ekstingsi o-dianisidin (8.3 mM-1 cm-1)
d = tebal larutan
t
= waktu inkubasi (menit)
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976)
Sebanyak 100 δ sampel ditambahkan 100 δ reagen Bradford, diaduk, lalu
diinkubasi selama 10 menit. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm.
Kurva standar dibuat dari larutan Bovine Serum Albumin (BSA). Konsentrasi BSA
yang digunakan adalah 0.0025-0.2 mg/mL. Persamaan garis kurva standar
digunakan untuk menentukan kadar protein sampel.
Penentuan Kinetika GOD (Modifikasi Odenbunmi dan Owalude 2007)
Penentuan kinetika enzim dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim pada
variasi konsentrasi substrat. Substrat yang digunakan adalah glukosa dengan
konsentrasi 8-100 mM. Hasil yang diperoleh dimasukkan ke dalam kurva
Michaelis-Menten dengan sumbu x sebagai konsentrasi substrat (S) dan sumbu y
sebagai aktivitas enzim (V). Melalui kurva Michaelis-Menten, dipilih variasi
konsentrasi substrat dengan aktivitas yang meningkat secara signifikan untuk
membuat kurva Lineweaver-Burk. Kurva Lineweaver-Burk dibuat dari setengah
kecepatan maksimum dengan menghubungkan satu per konsentrasi substrat (1/S)
sebagai sumbu x dan satu per aktivitas enzim (1/V) sebagai sumbu y. Persamaan
yang diperoleh dari kurva tersebut digunakan untuk menentukan Km dan vmaks.
Pengukuran Voltamogram Siklik Elektroda Pasta Karbon (EPK) dan
Elektroda Pasta Karbon Termodifikasi (EPKT) (Colak et al. 2012)
Preparasi EPK dan EPKT. EPK disiapkan dengan mencampurkan 100 µL
parafin dan 0.15 gram serbuk grafit di dalam mortar hingga menjadi pasta.
Selanjutnya, pasta karbon tersebut dimasukkan ke dalam tabung elektroda yang
disiapkan dari kaca kapiler dengan variasi ukuran diameter tembaga 1 mm dan 3
mm (Tang et al. 2014). Kemudian nilai arus terbaik EPK dari ukuran diameter
tembaga dimodifikasi dengan penambahan nanofiber polianilin (EPKT) sebanyak
2 mg polianilin yang dicampur ke dalam mortar dengan 100 µL parafin dan 0.15 g
serbuk grafit. Selanjutnya, masing-masing pasta karbon tersebut dimasukkan ke
dalam tabung elektroda dengan ukuran dimeter terbaik dan panjang karbon pasta
masing-masing 10 mm (Saglam et al. 2015).
Pengukuran Voltamogram Siklik Kinerja EPK dan EPKT. EPK dan
EPKT (elektroda kerja secara bergantian) bersama elektroda Ag|AgCl (elektroda
pembanding) dan elektroda platina (elektroda pelengkap) dimasukkan ke dalam
gelas kaca 10 mL yang berisi 3 mL larutan kalium klorida (KCl) 3 M. Ketiga

6
elektroda kemudian disambungkan dengan tiga kabel berbeda yang telah terhubung
dengan potensiostat. Setelah itu, voltamogram siklik yang terbentuk diamati dan
dianalisis nilai arus serta potensial maksimumnya menggunakan menu “Data pad”.
Amobilisasi Glukosa Oksidase pada EPKT (Modifikasi Colak et al. 2012)
Sebanyak 50 µL GOD hasil pengendapan amonium sulfat 80% ditambahkan
dengan 1 mg BSA, 50 µL bufer asetat 0.1 M pH 4.5, dan 30 µL glutaraldehid 2.5%.
Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro dan dikocok perlahan.
Kemudian diteteskan di atas permukaan EPKT sebanyak 5 µL. Elektroda yang
menggunakan GOD teramobil dari isolat lokal disimbolkan dengan GODamoo
IPB|EPKT. Selanjutnya, GODamo-IPB|EPKT tersebut dikeringkan pada suhu 4 C.
Setelah kering, lalu dicuci beberapa kali dengan bufer asetat pH 4.5 untuk
menghilangkan enzim yang tidak teramobil. Elektroda disimpan dalam lemari
pendingin refrigerator pada suhu 4oC.
Pengukuran Voltamogram Siklik Kinerja EPKT dengan GOD Teramobil dan
GOD Tidak Teramobil (Modifikasi Colak et al. 2012)
Elektroda kerja yang akan diukur terdiri atas dua jenis yaitu GODamodan GODIPB|EPKT (GOD dari isolat lokal IPB yang tidak diamobilisasi)
untuk melihat perbedaan nilai arus yang dihasilkan dari GOD yang teramobil dan
GOD yang tidak teramobil. Kedua elektroda kerja tersebut secara bergantian
dimasukkan ke dalam gelas kaca 10 mL yang berisi 3 mL larutan uji (1 mL larutan
bufer asetat 0.1 M pH 4.5 yang ditambah 1 mL kalium ferisianida 0.1 M dan 180
µL larutan glukosa 1 mM) bersama elektroda Ag|AgCl (elektroda pembanding) dan
elektroda platina (elektroda pelengkap). Ketiga elektroda (kerja, pembanding, dan
pelengkap) kemudian disambungkan dengan tiga kabel berbeda yang telah
terhubung dengan potensiostat. Setelah itu, voltamogram siklik yang terbentuk
diamati dan dianalisis nilai arus serta potensial maksimumnya menggunakan menu
“Data pad”.

IPB|EPKT

Kinetika Glukosa Oksidase Teramobil pada EPKT (modifikasi Ambarsari
2016)
Voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT diukur dalam 1 mL larutan bufer
asetat 0.1 M pH 4.5 yang ditambah 1 mL kalium ferisianida 0.1 M dan 180 µL
larutan standar glukosa dengan konsentrasi 0.2-8 mM. Penentuan parameter
kinetika elektroda GODamo-IPB|EPKT ditentukan dengan terlebih dahulu dibuat
kurva linieritas dari kurva Michaelis-Menten, lalu daerah linieritas yang diperoleh
kemudian dibuat plot Lineweaver-Burk, kemudian ditentukan nilai Km dan Imaks.
GODamo-IPB|EPKT dengan nilai arus terbaik pada kondisi kinetika diukur
stabilitasnya selama tiga bulan.

7

3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
GOD Intraseluler, Ekstraseluler, dan Laju Reaksi Awal
GOD yang dihasilkan oleh isolat lokal A.niger IPBCC.08.610 merupakan
enzim intraseluler. Hal ini dibuktikan dari hasil uji aktivitas enzim intraseluler
melalui proses lisis miseliumnya lebih tinggi dibandingkan aktivitas enzim
ekstraseluler. Aktivitas ekstrak kasar GOD intraseluler sebesar 1.31 U/mL
sedangkan aktivitas ekstrak kasar GOD ektraseluler hanya 0.17 U/mL. Biomassa
yang dihasilkan oleh A.niger berupa sel bulat berukuran cukup besar dan berwarna
putih (Lampiran 8). Biomassa berupa miselium ini kemudian dilisis menggunakan
pasir kuarsa untuk mengeluarkan enzim yang terdapat di dalam sel.
Pengukuran aktivitas GOD dilakukan dengan menentukan kecepatan reaksi
awal (Vo) terlebih dahulu. Kecepatan awal reaksi ditentukan berdasarkan laju linear
maksimum pada kurva yang menghubungkan antara waktu dan absorbansi
pengujian enzim (Gambar 1). Kecepatan awal reaksi GOD diperoleh sebesar
0.95/menit dengan nilai absorbansi setimbang yaitu 0.95. Setelah laju awal reaksi
enzim diketahui, aktivitas sampel diukur dengan waktu pengukuran 1 menit.
2

Absorban 436

1.5

1

0.5

0
0

60

120

180

240

300

360

Waktu (detik)
Gambar 1 Penentuan kecepatan awal reaksi (V0)
Fraksi GOD Ekstrak Kasar dan Pengendapan (NH4)2SO4 80% Jenuh
Produksi GOD dilakukan pada 3 liter media dengan waktu fermentasi
selama 40 jam. Ekstrak kasar GOD yang diperoleh lalu digunakan untuk tahap
pemurnian dengan (NH4)2SO4 80% jenuh. Tabel 1 menunjukkan jumlah protein dan
aktivitas yang dimiliki GOD ekstrak kasar dan fraksi pengendapan amonuium sulfat.
Dari 3 liter volume media, dihasilkan 200 mL ekstrak kasar GOD dan dari volume
ekstrak kasar tersebut dihasilkan 15 mL GOD fraksi pengendapan dengan amonium
sulfat 80%. Protein yang dihasilkan pada GOD ekstrak kasar sebesar 193.92 mg
dan menurun hingga 6.99 mg saat diendapkan oleh (NH4)2SO4 80% jenuh. Kurva
standar glukosa untuk menghitung protein ditunjukkan pada Lampiran 2. Ekstrak

8
kasar GOD dari isolat lokal A. niger (IPBCC.08.610) diketahui memiliki aktivitas
spesifik sebesar 1.349 U/mg dengan yield sebesar 100%. GOD ekstrak kasar
diendapkan dengan fraksi amonium sulfat yang memiliki tingkat kejenuhan 60%80%. Fraksi pemurnian dengan (NH4)2SO4 80% jenuh memiliki aktivitas spesifik
yang lebih tinggi yaitu sebesar 27.77 U/mg dan yield 72.86% dengan tingkat
kemurnian hingga 20.22 kali dari ekstrak kasarnya. Perhitungan aktivitas GOD
dapat dilihat pada Lampiran 3.
Tabel 1 Jumlah protein dan aktivitas GOD intraseluler dari A.niger IPBCC.08.610
Fraksi Aktivitas [Protein] Volume Aktivitas Protein Aktivitas
(U/mL) (mg/mL) (mL) Total (U) Total (mg) spesifik
(U/mg)
1
1.31
0.97
200
261.68
193.92
1.34
2
12.71
0.46
15
190.66
6.99
27.77
Fraksi 1 : Ekstrak kasar GOD intraseluler
Fraksi 2 : GOD pengendapan (NH4)2SO4 80% jenuh

Yield Kemurnian
(%)
(kali)
100
72,86

1.00
20.22

Kinetika Glukosa Oksidase
Kinetika aktivitas enzim yang melebihi nilai konsentrasi substrat akan
membentuk kurva hiperbola rektangular atau kurva dari Michaelis-Menten
(Gambar 2). Pada kurva ini terjadi peningkatan aktivitas enzim seiring dengan
peningkatan konsentrasi glukosa yang digunakan. Konsentrasi glukosa yang
digunakan yaitu 8-100 mM. Aktivitas enzim pada konsentrasi glukosa yang rendah
meningkat secara linier terhadap konsentrasi. Akan tetapi, pada konsentrasi glukosa
melebihi 0.06 M, laju peningkatan aktivitas enzim mengalami penurunan terhadap
konsentrasi. Kurva tersebut kemudian di plot ke dalam kurva Lineweaver-Burk
yang merupakan metode umum untuk menghitung nilai Km. Persamaan
Lineweaver-Burk digunakan untuk menentukan kinetika GOD dari A.niger
(IPBCC.08.610).

Gambar 2 Kurva Michaelis-Menten pengaruh konsentrasi substrat glukosa dan
aktivitas GOD

9
Persamaan linier Lineweaver-Burk (Gambar 3) digunakan untuk
menentukan nilai Km dan Vmaks. Dari kurva tersebut diperoleh persamaan garis y=
0.0027x+0.0482 dengan regresi linier sebesar 99.23%. Persamaan tersebut
menunjukkan hubungan antara 1/konsentrasi glukosa terhadap 1/aktivitas enzim.
Berdasarkan tabel 2 nilai vmaks dan Km GOD isolat A. niger (IPBCC.08.610) hasil
pengendapan amonium sulfat 80% yang diperoleh sebesar 20.747 U/mg dan 56 mM.
Konsentrasi glukosa sebesar 56 mM merupakan jumlah glukosa yang dibutuhkan
untuk mencapai setengah kecepatan maksimum GOD. Parameter lain yang
digunakan untuk mempelajari kinetika dari suatu enzim adalah kcat atau bilangan
putaran. Nilai kcat GOD dari fraksi amonium sulfat 80% diperkirakan sekitar 53 s-1.
Efisiensi fraksi enzim yang dihasilkan yaitu 0.95 s-1 mM-1. Perhitungan kinetika
kimia GOD hasil pengendapan amonium sulfat ditunjukkan pada Lampiran 4.

Gambar 3 Kurva Lineweaver-Burk linieritas antara konsentrasi substrat glukosa
dan aktivitas GOD
Tabel 2 Parameter kinetika GOD
Fraksi GOD
Am. Sulfat 80%

Vmax (U mg-1)
20.747

Km (mM)
56

Kcat (s-1)
53

Efisiensi (s-1 mM-1)
0.95

Voltamogram Siklik EPK dan EPKT
Pengukuran voltamogram siklik diperlukan untuk mengetahui kinerja
elektroda dalam mendeteksi pergerakan elektron dari suatu reaksi oksidasi-reduksi
yang terjadi dalam teknik sensor. Hasil ini memvisualisasikan besar arus yang
dihasilkan oleh sel elektrokimia sebagai fungsi potensial. Sel elektrokimia yang
dimaksud terdiri atas elektroda kerja (EPK dan EPKT), elektroda pelengkap (Pt|Ti),
dan elektroda pembanding (Ag|AgCl) dalam larutan elektrolit yang diberi potensial.
Pada setiap siklus dalam voltamogram siklik, puncak arus oksidasi muncul saat
pemayaran depan yang dimulai dari titik -2 V menuju titik 2 V kemudian berbelok
kembali menuju titik -2 V dengan laju pemayaran sebesar 100 mV/s. Larutan
elektrolit yang digunakan yaitu larutan KCl 3 M. Gambar 4 menunjukkan

10
voltamogram siklik EPK dengan variasi ukuran diameter tembaga sebesar 1 mm
dan 3 mm. EPK dengan diameter tembaga 3 mm memiliki nilai arus yang lebih
besar dibandingkan 1 mm yaitu 0.362 mA dan tegangan potensial sebesar 0.695 V
(Tabel 3). EPK berdiameter tembaga 3 mm selanjutnya dimodifikasi dengan
penambahan nanofiber polianilin (EPKT). Masing-masing elektroda dilakukan
sebanyak tiga kali ulangan (Lampiran 5).
Tabel 3 Arus oksidasi puncak anoda EPK ukuran diameter 1 mm, panjang 10 mm
dan EPK ukuran diameter 3 mm, panjang 10 mm
Ukuran Elektroda
(mm)
EPK1mm
EPK3mm

Potensial maksimum (V)
0.435
0.695

Arus maksimum (A)
0.228 x 10-3
0.362 x 10-3

Gambar 4 Voltamogram siklik kinerja EPK dengan variasi ukuran diameter
tembaga pada laju pemayaran 100 mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000
mV, final E -1000 mV, upper E 2000 mV, dan lower E -2000 mV. E =
tegangan, I = arus,
EPK1mm, ------- EPK3mm
Voltamogram siklik yang terbentuk dari EPK dan EPKT menunjukkan
kinerja dari kedua elektroda tersebut terhadap larutan KCl 3 M. Gambar 5
menunjukan voltamogram siklik EPK dan EPKT yang memiliki peningkatan arus
dan rentang potensial yang lebih besar pada voltamogram siklik EPKT.
Peningkatan arus dan potensial yang lebih besar diikuti dengan perbedaan luas
daerah voltamogram siklik. Luas daerah voltamogram siklik mengindikasikan
kualitas konduktansi (daya hantar listrik) atau kerapatan arus yang tinggi. Hal ini

11
dikarenakan pada EPKT terdapat penambahan modifikasi polianilin yang
berbentuk nanofiber. Nanofiber polianilin yang digunakan pada penelitian ini
adalah hasil sintesis dari penelitian Ambarsari et al. (2016) dan tidak dilakukan
karakterisasi ulang. Ambarsari et al. (2016) menyebutkan ukuran nanofiber
polianilin ini sekitaar 110-120 nm, berbentuk butiran kasar, dan berwarna hijau tua
kecokelatan. Morfologi polianilin yang disintesis secara polimerisasi interfasial
tersebut diamati menggunakan mikroskop elektron (SEM).
Selain luas daerah voltamogram siklik, nilai arus oksidasi maksimum yang
dihasilkan juga menjadi parameter lain untuk menunjukkan kualitas elektroda
dalam menghantarkan elektron. Pemilihannya didasarkan reaksi dominan yang
terjadi pada reaksi katalitik oleh GOD, yakni reaksi oksidasi. Peningkatan nilai arus
oksidasi pada EPKT dibandingkan EPK diikuti dengan peningkatan potensial. Pada
pengujian voltametri siklik dengan EPK, larutan KCl 3 M teroksidasi sempurna
pada potensial 0.69 V dan menghasilkan arus 0.36 mA. Sementara itu, larutan KCl
3 M dengan menggunakan EPKT sebagai elektroda kerja, baru teroksidasi
sempurna pada potensial 0.99 V dan menghasilkan arus 1.10 mA (Tabel 4).

Gambar 5 Voltamogram siklik kinerja EPK dan EPKT pada laju pemayaran 100
mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000 mV, final E -1000 mV, upper E
2000 mV, dan lower E -2000 mV. E = tegangan, I = arus,
EPK,
------- EPKT
Tabel 4 Arus oksidasi puncak anoda EPK dan EPKT
Sampel
EPK
EPKT

Potensial maksimum (V)
0.69
0.99

Arus maksimum (A)
0.36 x 10-3
1.10 x 10-3

12
GOD Teramobilisasi pada Elektroda
EPKT kemudian digunakan sebagai media amobilisasi enzim. Teknik
amobilisasi enzim dalam matriks polimer (polianilin) dengan polimerisasi pada
elektrokimia hanya melibatkan penerapan potensial yang sesuai pada elektroda
dalam pelarut yang cocok terhadap monomer dan enzim. Polimer konduktif
memiliki kemampuan untuk mentransfer elektron yang dihasilkan oleh reaksi
redoks dari analat sehingga dapat terbaca pada potensiostat. Gambar 6
menunjukkan voltamogram siklik dari dua elektroda kerja yakni EPKT dengan
GOD teramobil menggunakan glutaraldehida 2.5% (GODamo-IPB|EPKT) dan tanpa
glutaraldehida (GODIPB|EPKT) dengan scan rate 100 mV/s. Masing-masing
elektroda dilakukan tiga kali ulangan (Lampiran 6). Perbandingan voltamogram
siklik GODamo-IPB|EPKT dengan GODIPB|EPKT memiliki nilai puncak arus oksidasi
dan rentang potensial yang berbeda. Luas voltamogram siklik GODamo-IPB|EPKT
lebih besar dibandingkan GODIPB|EPKT. Hal ini menunjukkan EPKT dengan
penambahan GOD teramobil menggunakan glutaraldehida bersifat lebih konduktif.
Puncak arus okidasi GODamo-IPB|EPKT yang ditunjukkan pada tabel 5 berada
pada 3.92 mA dengan potensial maksimum sebesar 1.5 V sementara GODIPB|EPKT
pada 1.93 mA dengan potensial maksimum sebesar 1.7 V. GODamo-IPB|EPKT dipilih
sebagai elektroda dengan respon terbaik berdasarkan nilai puncak arus oksidasi dan
rentang potensial yang lebih besar pada voltamogram sikliknya. Larutan elektrolit
yang digunakan yaitu Kalium Ferisianida (K3Fe(CN)6).

Gambar 6 Voltamogram siklik kinerja GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT pada
laju pemayaran 100 mVs-1, potensial 2 V, Initial E -1000 mV, final E 1000 mV, upper E 2000 mV, dan lower E -2000 mV. E = tegangan, I =
arus,
GODIPB|EPKT,
GODamo-IPB|EPKT

13
Tabel 5 Arus oksidasi puncak anoda GODIPB|EPKT dan GODamo-IPB|EPKT
Sampel
Potensial maksimum (V)
Arus maksimum (A)
GODIPB|EPKT
1.7
1.93 x 10-3
GODamo-IPB|EPKT
1.5
3.92 x 10-3

Parameter Kinetika Enzim teramobil pada EPKT
Penentuan parameter kinetika GOD diperlukan untuk mengetahui
karakteristik dari aktivitas GOD tersebut sebagai elektroda enzim, yang dapat
digunakan sebagai informasi dasar untuk pengembangan selanjutnya. Parameter
kinetika GOD yaitu nilai Km dan Imaks ditentukan berdasarkan hasil dari uji kinerja
GODamo-IPB|EPKT terhadap konsentrasi substrat glukosa yang divariasikan pada
rentang konsentrasi 0.2 – 8.0 mM secara siklik voltametri. Voltamogram siklik
yang dihasilkan dari kinerja GODamo-IPB|EPKT terhadap variasi konsentrasi glukosa
yang diuji dapat dilihat pada Gambar 7. Voltamogram siklik tersebut menunjukkan
terbentuknya puncak oksidasi dari elektroda tersebut.
Parameter kinetika, terlebih dahulu ditentukan dengan kurva MichaelisMenten dan kurva linieritas hubungan antara konsentrasi glukosa dan nilai arus
oksidasi elektroda GODamo-IPB|EPKT. Kurva Michaelis-Menten diperoleh dengan
menghubungkan nilai arus yang dihasilkan pada puncak oksidasi dalam
voltamogram siklik elektroda GODamo-IPB|EPKT terhadap konsentrasi substrat
glukosa yang diuji. Berdasarkan kurva Michaelis-Menten yang dapat dilihat pada
Gambar 6, ketika konsentrasi glukosa di bawah 2 mM, kinerja elektroda GODamoIPB|EPKT terhadap substrat terus mengalami peningkatan seiring dengan
peningkatan konsentrasi glukosa namun, ketika konsentrasi glukosa mencapai 2
mM aktivitas GOD mulai mencapai maksimum, sehingga peningkatan konsentrasi
glukosa yang lebih tinggi dari 2 mM tidak memberi pengaruh yang signifikan
terhadap nilai arus oksidasi yang dihasilkan oleh elektroda GODamo-IPB|EPKT.
Konsentrasi glukosa pada konsentrasi terendah yakni 0.2 mM menghasilkan nilai
arus sebesar 0.413 mA dan konsentrasi 2 mM menghasilkan nilai arus sebesar 3.869
mA.
Kurva linieritas antara konsentrasi substrat glukosa terhadap nilai arus
elektroda GODamo-IPB|EPKT ditentukan berdasarkan kurva Michaelis-Menten
(Gambar 8). Daerah linier dari kinerja elektroda GODamo-IPB|EPKT yakni setengah
dari kecepatan maksimum berada pada rentang konsentrasi 0.2 – 1.6 mM, dengan
nilai regresi 98.6% (Gambar 8). Persamaan Lineweaver-Burk dalam penentuan
nilai Km dan Imaks ditentukan berdasarkan kurva linieritas yang diperoleh pada
Gambar 6. Berdasarkan persamaan tersebut, diketahui bahwa Km dan Imaks untuk
aktivitas GOD dalam EPKT nanofiber polianilin masing-masing sebesar 2.88 mM
dan 3.869 mA dengan bilangan putaran (Kcat) sebesar 13 s-1. Sensitivitas yang
dimiliki sebesar 1.09 mA/mM (Tabel 5). Waktu respon untuk menghasilkan puncak
arus maksimum sebesar 25 detik. Perhitungan kinetika kimia GODamo-IPB|EPKT
ditunjukkan pada Lampiran 7.

14

Gambar 7 Pengaruh konsentrasi substrat glukosa terhadap nilai arus elektroda
GODamo-IPB|EPKT

Gambar 8 Kurva Lineweaver-Burk dalam penentuan parameter kinetika
Tabel 6 Parameter kinetika elektroda GODamo-IPB|EPKT
Elektroda
GODIPB-amobil/ EPKT3,10

Kcat (s-1)
13

Range [glukosa]
(mM)
0.2-1.6

Sensitivitas
(mA mM-1)
1.09

Km (mM)
2.88

Imaks
(mA-1)
3.869

15
Kemudian konsentrasi substrat 2 mM diuji stabilitas elektrodanya. Hasil ini
ditunjukkan pada Gambar 9. Elektroda setelah disimpan selama satu bulan lalu
dilakukan pengukuran, nilai arus menurun menjadi 3.22 mA. Dua bulan berikutnya
nilai arus juga menurun menjadi 1.1 mA, dan pada bulan ketiga nilai arus semakin
menurun menjadi 0.2 mA.

Gambar 9 Stabilitas GODamo-IPB|EPKT selama tiga bulan

Pembahasan
GOD Intraseluler, Ekstraseluler, dan Laju Awalnya
GOD yang dihasilkan oleh A.niger dapat berupa enzim ekstraseluler
maupun intraseluler (Simpson 2005). GOD yang dihasilkan oleh isolat lokal ini
merupakan enzim intraseluler. Hal ini ditunjukkan pada GOD instraseluler
memiliki aktivitas enzim yang lebih besar. Pemanenan biomassa dilakukan dengan
penyaringan menggunakan kain kasa. Enzim diisolasi dengan cara lisis mekanik
terhadap biomassa yang dihasilkan. Miselia A. niger digerus menggunakan mortar
dengan bantuan pasir kuarsa untuk mempermudah proses lisis. Proses lisis ini
merupakan ciri dari enzim tipe instraseluler. Selain itu, kapang memiliki dinding
sel yang lebih tebal dibandingkan bakteri yang menyebabkan proses difusi GOD
dari dalam sel ke luar sel lebih sulit sehingga GOD intraseluler lebih tinggi
dibandingkan ekstraseluler (Indriani 2015). Ekstrak kasar yang diperoleh dari
kultur lalu diukur aktivitas dan konsentrasi proteinnya. Oleh karena itu dapat
disimpulkan bahwa GOD pada isolat A. niger (IPBCC.08.610) lebih banyak
diproduksi sebagai enzim intraseluler. Hal ini sesuai dengan pernyataan Sabir et al.
(2007) bahwa GOD pada Aspergillus sp. merupakan enzim intraseluler, berbeda
dengan GOD pada Penicillium sp. yang banyak ditemukan dalam bentuk enzim
ektraseluler.

16
Sumber nutrisi bagi A. niger yaitu sumber C. Sukrosa salah satu sumber C,
bertindak sebagai induser. Lampiran 8 menunjukkan bahwa sukrosa yang berada di
luar sel memberikan sinyal kepada Aspergillus niger. Sukrosa terlebih dahulu
dipecah menjadi senyawa yang lebih sederhana untuk dapat masuk kedalam
membran sel, yaitu dengan bantuan GOD. Dalam membran sel, DNA memberikan
sinyal kepada mRNA untuk mengkode terbentunya asam-asam amino penyusun
GOD. Ribosom merupakan tempat penyusunan terbentuknya GOD. Setelah GOD
terbentuk, GOD disekresikan keluar membran sel untuk membantu pemecahan
sukrosa. Proses pembentukan GOD akan terus berjalan, apabila masih terdapat
nutrisi terutama sumber karbon (Indriani et al. 2015).
Produksi GOD dilakukan pada dua media yang berbeda. Media pertama
merupakan media starter yang mengandung pepton, glukosa, (NH4)2HPO4,
KH2PO4, MgSO4.7H2O. Media kedua merupakan media produksi yang terdiri atas
sukrosa, glukosa, CaCO3, (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O. Sumber karbon
yang digunakan dalam media produksi berupa sukrosa dan glukosa. Sukrosa yang
digunakan untuk media lebih banyak dibandingkan glukosa. Hal ini dikarenakan
menurut Bankar et al. (2009) sukrosa merupakan substrat yang dapat merangsang
produksi GOD dengan lebih optimal. Konsentrasi glukosa yang tinggi
mengakibatkan penurunan massa miselia, pH kultur, dan konsentrasi GOD
(Simpson 2005). Konsentrasi glukosa optimal untuk produksi GOD pada A. niger
mutant G-13 yaitu 8% sedangkan konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini
yaitu 0.35%. Berdasarkan penelitian Sabir et al. (2007) yang menggunakan
berbagai macam sumber karbon dalam produksi enzim GOD dari Penicillium
notatum didapat bahwa penggunaan sukrosa dalam media menunjukkan aktivitas
GOD yang dihasilkan paling tinggi dibandingkan penggunaan maltosa, glukosa,
fruktosa, dan pati.
Media yang digunakan pada penelitian ini memiliki konsentrasi CaCO3 4%
dan pH 5.5. Konsentrasi CaCO3 yang optimum untuk produksi GOD menurut
Hatzinikolaou et al. (1996) adalah 4%. Simpson (2005) melaporkan bahwa CaCO3
merupakan penginduksi yang kuat dalam pembentukan GOD pada A. niger.
Berdasarkan penelitian Hatzinikolaou et al. (1996) didapat bahwa aktivitas enzim
glukosa-6-fosfat isomerase sebagai enzim glikolisis lebih tinggi pada media tanpa
CaCO3 sedangkan aktivitas GOD dan katalase cukup rendah. Penambahan CaCO3
mengakibatkan peningkatan aktivitas GOD dan katalase seiring dengan penurunan
aktivitas glukosa-6-fosfat isomerase. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa
adanya CaCO3 mengubah jalur metabolik A. niger dari glikolisis menjadi jalur
pentosa fosfat, yang dapat meningkatkan jumlah glukosa oksidase (Simpson 2005).
Berdasarkan penelitian Khurshid et al. (2011), pH optimum untuk produksi GOD
pada A. niger adalah 5.5. Produksi glukosa oksidase selama fermentasi dapat
berlangsung pada pH minimal 4 (Simpson 2005).
Konsentrasi KH2PO4 dan MgSO4 yang digunakan dalam media produksi
pada penelitian ini yaitu 0.02%. Khurshid et al. (2011) menyatakan bahwa aktivitas
GOD maksimum terjadi pada konsentrasi KH2PO4 0.4% dan kemudian menurun
pada konsentrasi lebih dari itu. Selain itu peningkatan konsentrasi MgSO4 mulai
dari 0.01% mengakibatkan penurunan aktivitas GOD sehingga penggunaan MgSO4
harus seminimal mungkin. Hamid et al. (2003) juga menyatakan bahwa
penambahan Mg2+ pada media merupakan inhibitor kuat pada produksi GOD.

17
(NH4)2HPO4 dengan kadar 0.2 % merupakan sumber fosfor yang baik bagi
pertumbuhan A. niger karena dapat meningkatkan aktivitas glukosa oksidase.
Pengukuran aktivitas GOD dilakukan dengan menentukan kecepatan reaksi
awal (Vo) terlebih dahulu. Pada tahap awal reaksi, tidak dihasilkan produk, tetapi
pada tahap reaksi berikutnya, reaksi balik menjadi lebih penting pada saat
mendekati kesetimbangan. Konsentrasi substrat linear seiring dengan pertambahan
waktu, kemudian aktivitas enzim juga menurun karena enzim menjadi jenuh
terhadap substrat. Akhirnya enzim dihambat oleh produk yang terbentuk atau
menjadi lambat aktivitasnya. Pengukuran aktivitas biasanya dilakukan segera
setelah reaksi dimulai untuk menghindari terjadinya pengurangan laju akibat
pengurangan substrat dan penumpukan produk (Metzler 2003). Oleh karena itu
aktivitas enzim (V) ditentukan oleh vo ketika pengaruh tersebut sangat kecil.
Kecepatan awal reaksi (Vo) ditentukan berdasarkan laju linear maksimum pada
kurva yang menghubungkan antara waktu dan absorbansi pengujian enzim.
Kecepatan awal reaksi GOD diperoleh sebesar 0.95/menit. Setelah laju awal reaksi
enzim diketahui, aktivitas masing-masing sampel diukur dengan waktu pengukuran
1 menit. Waktu ini ditentukan berdasarkan waktu yang menunjukkan terjadinya laju
linear tertinggi pada reaksi enzim (to).
Prinsip pengujian enzim GOD berdasarkan oksidasi β-D-glukosa oleh GOD
dengan bantuan oksigen menjadi β-D-glukono- -lakton dan hidrogen peroksida.
Hidrogen peroksida yang terbentuk digunakan untuk mengoksidasi substrat
kromogen pada reaksi kedua dengan GOD menghasilkan perubahan warna.
Perubahan warna kemudian diamati secara spektrofotometri (Sukhacheva et al.
2004). Pada penelitian ini menggunakan orto-dianisidin sebagai substrat kromogen.
Perubahan warna yang terjadi diukur pada panjang gelombang 436 nm. Warna yang
dihasilkan yakni merah muda. Larutan glukosa yang digunakan didiamkan terlebih
dahulu selama 1 jam agar terjadi mutarotasi menjadi β-D-glukosa (Simpson 2005).
GOD Fraksi Ekstrak Kasar dan Pengendapan Amonium Sulfat
Produksi GOD dilakukan pada 3 liter media dengan waktu fermentasi
selama 40 jam. Ekstrak kasar diperoleh dari hasil isolasi A. niger (IPBCC 08.610)
yang ditumbuhkan dalam media produksi setelah melalui tahap inkubasi selama 40
jam. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Khursid et al. (2011) menyebutkan
bahwa waktu produksi GOD paling maksimal dilakukan dalam waktu 48 jam.
Optimasi waktu produksi A. niger (IPBCC 08.610) juga dilakukan oleh Triana
(2012), aktivitas total GOD yang dihasilkan pada 48 jam lebih tinggi daripada
waktu produksi selama 72 jam, nilai yang diperoleh yaitu sebesar 134.21 U dan
103.72 U. Pada penelitian ini, aktivitas total ekstrak kasar yang diperoleh lebih
tinggi daripada yang diperoleh oleh Triana (2012) yaitu sebesar 261.68 U. Unit
merupakan satuan dari aktivitas enzim. Unit didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang diperlukan untuk menggunakan satu mikromol substrat per menit pada suhu
dan temperatur tertentu