26
3.3 Metode Penelitian
Penelitian ini terdiri atas dua tahap. Tahap I meliputi analisa komposisi kimia, analisa asam amino, dan ekstraksi senyawa bioaktif dari kerang mas ngur
Atactodea striata. Tahap II meliputi pengujian inhibitor topoisomerase I, penentuan MIC ekstrak aktif, pengujian kelompok senyawa kimia protein, asam
amino bebas, karbohidrat, alkaloid, steroid, terpenoid dan saponin, isolasi golongan senyawa aktif inhibitor topoisomerase I.
3.3.1 Analisa Komposisi Kimia dan Asam Amino AOAC 1995 3.3.1.1 Analisa Komposisi Kimia
Atactodea striata
Analisa komposisi kimia yang dilakukan meliputi kadar air, abu, lemak, protein, serat kasar, dan karbohidrat. Analisa komposisi kimia dilakukan di
Laboratorium Kimia Pangan, Departemen ITP, IPB Bogor. Analisa kadar air dilakukan dengan terlebih dulu memanaskan cawan
bersih dalam oven pada suhu 102
o
C – 105
o
C selama 10-12 jam, kemudian dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit, lalu ditimbang A.
Selanjutnya, kedalam cawan dimasukkan 1-4 gram kerang Atactodea striata kering yang telah dihaluskan diblender lalu ditimbang B. Kemudian
dikeringkan dalam oven pada suhu 102
o
C - 105
o
C sampai beratnya konstan. Setelah itu, dikeluarkan dari oven dan didinginkan dalam desikator dan
selanjutnya ditimbang C. Kadar air dapat dihitung dengan rumus : 100
x A
B C
A air
Kadar −
− =
Keterangan : A = berat cawan kosong gram B = berat cawan berisi contoh sebelum dioven gram
C = berat cawan berisi contoh setelah dioven gram
Analisa kadar abu dilakukan dengan terlebih dulu cawan porselin dipijarkan dalam tanur bersuhu 650°C ± 30 menit, kemudian didinginkan dalam desikator lalu
ditimbang A. Sebanyak 2 g kerang Atactodea striata kering yang telah dihaluskan diblender ditimbang dalam cawan tersebut B, kemudian dipanaskan
dalam oven sampai hampir kering dan selanjutnya diabukan dalam tanur yang bersuhu 650°C sampai diperoleh abu yang berwarna putih ± 24 jam. Selanjutnya abu
didinginkan dalam desikator selama 30 menit lalu ditimbang C. Kadar abu dapat
27
dihitung dengan rumus : 100
x A
B C
A air
Kadar −
− =
Keterangan : A = berat cawan kosong gram B = berat cawan berisi contoh sebelum pengabuan gram
C = berat cawan berisi contoh setelah pengabuan gram
Analisa kadar lemak dilakukan dengan terlebih dulu labu soxhlet kosong bersih dikeringkan dalam oven selama 30 menit, didinginkan dalam desikator kemudian
ditimbang B. Sebanyak 2 gram A kerang Atactodea striata kering yang telah dihaluskan diblender, dikeringkan dalam oven 105°C terlebih dahulu selama ± 2
jam di atas kertas saring bebas lemak, Selanjutnya contoh yang sudah kering dibungkus dengan kertas saring kemudian diekstraksi. Lemak diekstrak menggunakan
pelarut heksana selama 6 jam. Pemanasan labu soxhlet dilakukan dengan penangas air bersuhu 70°C - 80°C. Setelah waktu ekstraksi cukup, heksana yang tersisa dalam labu
soxhlet diuapkan sampai habis di dalam oven 100°C, lalu didinginkan dalam desikator dan segera ditimbang hingga diperoleh berat konstan C. Kadar lemak dapat
dihitung dengan rumus : 100
X A
B C
lemak Kadar
− =
Keterangan : A = berat contoh gram B = berat labu kosong kering gram
C = berat labu berisi minyak setelah ekstraksi gram
Analisa kadar protein kerang Atactodea striata kering dilakukan dengan perhitungan total nitrogen secara semi-mikro Kjeldahl dan dikalikan dengan 6,25
faktor konversi protein-nitrogen. Kerang Atactodea striata kering yang telah dihaluskan diblender, ditimbang sebanyak 2 g kemudian dimasukkan ke dalam
labu Kjeldhal 100 ml, dan ditambahkan tablet Kjeldahl 2 buah. Selanjutnya ditambahkan 15 ml H
2
SO
4
lalu didestruksi selama ± 30 menit sampai diperoleh cairan yang berwarna hijau jernih. Cairan didinginkan, kemudian ditambah akuades
5 ml dan dipindahkan ke tabung destilasi dengan hati-hati, lalu dibilas dengan akuades 5-10 ml. Selanjutnya ke dalam tabung destilasi ditambahkan sebanyak 10 -
12 ml larutan NaOH 60 g NaOH + 5 g Na
2
S
2
O
3
5H
2
O dalam 100 ml akuades sampai cairan berwarna coklat kehitaman dan kemudian segera didestilasi. Hasil destilasi
28
ditampung dengan gelas erlenmeyer 125 ml yang berisi 10 ml larutan H
3
BO
4
dan 2-3 tetes indikator campuran metil merah dan metil biru. Hasil destilasi kemudian dititrasi
dengan larutan HCl 0,02 N sampai larutan berubah menjadi merah muda. Analisis blanko dilakukan seperti prosedur di atas tanpa menggunakan bahan yang dianalisa.
Kadar protein dapat dihitung dengan rumus : 100
25 ,
6 007
, 14
x gr
contoh berat
x x
N x
b a
protein Kadar
− =
Keterangan : a
= volume ml HCl untuk titrasi larutan contoh b
= volume ml HCl untuk titrasi larutan blanko N
= normalitas larutan HCl 14,007 = berat atom nitrogen
6,25 = faktor konversi protein-nitrogen untuk ikan dan produk sampingannya
Perhitungan kadar serat kasar dilakukan dengan melarutkan sampel kering sebanyak 1 gram dengan 100 ml H
2
SO
4
1,25, kemudian dipanaskan hingga mendidih dan di destruksi selama 30 menit. Selanjutnya disaring menggunakan
kertas saring Whatman dan dengan bantuan corong Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20-30 ml air mendidih kemudian dengan 25 ml air
sebanyak 3 kali. Residu didestruksi kembali dengan 100 ml NaOH 1,25 selama 30 menit. Lalu disaring dengan cara seperti di atas dan dibilas berturut-turut
dengan 25 ml H
2
SO
4
1,25 mendidih, 2,5 ml air sebanyak tiga kali dan 25 ml alkohol. Residu berserta kertas saring dipindahkan ke cawan poselin dan
dikeringkan dalam oven 130 °
C selama 2 jam. Setelah dingin residu beserta cawan porselin ditimbang A, lalu dimasukkan dalam tanur 600
° C selama 30 menit,
didinginkan dan ditimbang kembali B. Kadar serat kasar dapat dihitung dengan rumus :
100
2 1
3
x w
w w
kasar serat
Kadar −
= Ketetangan :
W1 = bobot residu setelah dibakar dalam tanur = B - bobot cawan ; B : bobot residu + cawan
W2 = berat contoh gram
W3 = bobot residu sebelum dibakar dalam tanur
= A - bobot kertas saring+cawan ;A: bobot residu+ kertas saring+cawan
29
Perhitungan kadar karbohidrat dilakukan menggunakan metode by difference, yaitu pengurangan 100 dengan jumlah dari hasil analisis kadar air,
abu, protein, lemak, serat kasar. Perhitungannya adalah sebagai berikut :
3.3.1.2.Analisa Asam Amino Atactodea striata
Analisa asam amino meliputi asam amino esensial dan non esensial. Analisa asam amino ini dilakukan di Laboratorium Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan Pascapanen Bogor. Sampel kerang Atactodea striata kering dianalisis lebih lanjut dengan
metode High Performance Liquid Cromatography HPLC. Sebelum digunakan, perangkat HPLC harus dibilas dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3
jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan aquades. Analisa asam amino dengan menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap,
yaitu: 1 tahap pembuatan hidrolisat protein ; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; 4 tahap injeksi serta analisis asam amino.
1 Tahap pembuatan hidrolisat protein Untuk preparasi sampel yaitu tahap pembuatan hidrolisat protein, sampel
ditimbang sebanyak 0,1 g dan dihancurkan. Selanjutnya ditambahkan dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 ml, kemudian dipanaskan dalam oven pada
suhu 100
o
C selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan peni upan dengan gas nitrogen N untuk menghilangkan gas O
2
sebelum diekstraksi. Hal ini dimaksudkan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada sampel
agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan. Proses pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis. Setelah pemanasan selesai,
hidrolisat protein disaring dengan menggunakan milipore berukuran 45 mikron.
2 Tahap pengeringan Hasil saringan diambil sebanyak 10 µl dan ditambahkan dengan 30 µl
larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamin dengan perbandingan 2:2:1. Setelah
Kadar karbohidrat = 100 - kadar air + abu + protein + lemak + serat kasar
30
100 x
g 0,25
sampel Bobot
BMA x
5ml x
molml 2,5
x standar
area luas
sampel area
luas amino
Asam =
ditambahkan larutan pengering, dilakukan pengeringan dengan pompa vakum untuk mempercepat pengeringan dan mencegah oksidasi.
3 Tahap derivatisasi Larutan derivatisasi sebanyak 30 µl ditambahkan pada hasil pengeringan.
Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antar larutan metanol, pikoiotiosianat, dan trimetilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses
derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada sampel. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara
menambahkan 10 ml asetonitril 60 dan natrium asetat 1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali dengan menggunakan
milipore berukuran 0,45 mikron. 4 Injeksi ke HPLC
Hasil saringan diambil sebanyak 20 µl untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Untuk perhitungan konsentrasi asam amino pada bahan, dilakukan
pembuatan kromatogram standar dengan menggunakan asam amino standar yang telah siap pakai yang mengalami perlakuan yang sama dengan sampel.
Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino : Temperatur Kolom
: 38
o
C Jenis kolom
: Pico tag 3.9 x 150 nm coulomb Kecepatan alir eluen : Sistem linier gradien 1 mlmenit
Program : Gradien
Tekanan : 3000 psi
Fase gerak : Asetonitril 60 dan Natrium asetat 1 M 40
Detektor : UV, 254 nm
Merk : Waters
Kandungan asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus yaitu presentase asam amino dalam 100 g sampel :
Keterangan : BMA = berat molekul asam amino
31
3.3.2 Ekstraksi Senyawa Bioaktif Atactodea striata Harborne 1987
Kategori