32
Atactodea striata
Gambar 8 Diagram alir proses ekstraksi bahan akti f dari Atactodea striata
3.3.3 Uji Inhibitor Topoisomerase I TopoGen 2006
Ekstrak ditambah dengan 13 µ l ddH
2
O, 2 µl DNA supercoil, 2 µl buffer TGS, 2 µl ekstrak, dan 2 µl enzim DNA topoisomerase, kemudian diinkubasi pada
suhu 37
o
C selama 30 menit. Setelah itu, reaksi dihentikan dengan menambah 2 µl SDS 10. Sisa enzim dinonaktifkan dengan 1 µl Proteinase-K 20 µgµl selama
60 menit pada suhu 37
o
C. Selanjutnya, 2 µl buffer loading dan 20 µl CIA Chloroform Isoamil Alkohol ditambahkan kedalam reaksi, kemudian divorteks.
Lapisan atas dianalisis menggunakan elektroforesis dengan gel agarosa 1 pada 55 volt selama 3 jam dan dilakukan pewarnaan dengan etidiumbromida untuk
penentuan kualitatif bentuk DNA nick dan supercoil. Aktivitas inhibisi enzim ditentukan dengan kemampuan enzim untuk merubah bentuk DNA supercoil
menjadi DNA bentuk nickrelaxed untuk topoisomerase I. Enzim DNA topoisomerase yang digunakan adalah Human Topoisomerase I Drug Screening
Kit dari topoGen. Kontrol positif adalah camptothecin. Aktivitas inhibitor topoisomerase I memilik dua mekanisme yaitu
mekanisme berbentuk poison, jika senyawa dapat menstabilkan ikatan enzim dan Maserasi 24 jam dengan heksana
Penghancuran Filtrasi
Filtrat I Evaporasi
Ekstrak Heksana Residu
Maserasi 24 jam dengan etil asetat Filtrasi
Filtrat II Evaporasi
Ekstrak Etil Asetat Maserasi 24 jam dengan metanol
Filtrasi Filtrat III
Evaporasi Ekstrak Metanol
Residu
Residu
P E
N C
U C
I A
N
33
substrat sehingga terjadi peningkatan Open Circular OC. Aktivitas hambatan katalitik ditunjukkan dengan tetap utuhnya substrat DNA.
3.3.4 Uji Kelompok Senyawa Kimia
Pengujian untuk mengetahui kelompok senyawa kimia yang terdapat pada ekstrak aktif meliputi uji ninhidrin untuk menentukan adanya asam amino bebas,
Molish untuk menentukan adanya karbohidrat dalam suatu bahan, Lieberman Burchard untuk menentukan adanya steroid dalam suatu bahan, Bradford untuk
mengetahui adanya protein dalam suatu bahan. Uji ini dilakukan dengan terlebih dulu masing-masing ekstrak ditimbang sebanyak 0,1 gr kemudian dilarutkan
dalam masing-masing pelarut sebanyak 5 ml Bintang, 1999. Selain itu juga dilakukan uji alkaloid, saponin, flavonoid, steroid Harborn 1987.
3.3.4.1 Uji Ninhidrin
Uji ninhidrin dilakukan untuk menentukan adanya asam amino bebas dalam suatu bahan. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino bebas gugus amida
membentuk senyawa berwarna ungu, sedangkan dengan prolin dan hidroksiprolin ninhidrin berwarna kuning. Cara pengujian adalah sebagai berikut : ekstrak aktif
Atactodea striata 1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi dan dibubuhi larutan ninhidrin 1 ml, lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 5 menit. Bila
terlihat warna ungu berarti positif. Uji ini dilakukan secara duplo. Pada prinsipnya asam amino bebas akan terhidrolisis melalui proses
pemanasan dengan terputusnya ikatan karbon yang mengikat gugus amida -NH
2
dan gugus karbonil -COOH sehingga ninhidrin akan mengisi kekosongan elektron bereaksi pada gugus amida dan membentuk senyawa berwarna ungu
sebagai indikasi adanya asam amino bebas pada bahan yang diuji.
3.3.4.2 Uji Molish
Uji ini adalah uji umum untuk menentukan adanya karbohidrat dalam suatu bahan. Karbohidrat akan dipecah oleh asam sulfat pekat menjadi gugus furfural
yang akan bereaksi dengan sulfonat alfa-naftol membentuk senyawa berwarna ungu. Pereaksi Molish terdiri atas alfa-naftol 5 dalam etanol 95 yang selalu
dibuat segar. Uji ini dilakukan secara duplo. Cara pengujiannya kedalam 1 ml ekstrak dibubuhi 2 tetes pereaksi Molish lalu ditambahkan asam sulfat pekat
34
melalui dinding tabung secara hati-hati. Bila terbentuk lapisan berwarna ungu, berarti positif mengandung karbohidrat karena terjadi reaksi kondensasi antara
furfural dengan alfa-naftol. Bila tidak ada karbohidrat maka akan berwarna hijau. Pada umumnya monosakarida stabil dalam larutan asam yang encer
walaupun dipanaskan, tetapi apabila dipanaskan dengan asam kuat yang pekat seperti asam sulfat pekat, monosakarida membentuk gugus furfural sebagai reaksi
dehidrasi atau pelepasan molekul air dari senyawanya. Gugus furfural yang terbentuk akan memberikan warna ungu bila bereaksi dengan alfa naftol, sehingga
reaksi ini dapat dijadikan sebagai reaksi pengenal untuk karbohidrat.
3.3.4.3 Uji Bradford
Uji ini untuk mengetahui adanya protein dalam suatu bahan. Cara pengujiannya adalah ekstrak 1 ml dimasukkan kedalam tabung kemudian
ditambah dengan 1 ml pereaksi Bradford. Tabung ditutup rapat dengan parafilm dan dikocok dengan cara membalikkan tabung perlahan-lahan beberapa kali.
Kemudian didiamkan selama lima menit atau paling lama satu jam. Bila terbentuk warna biru, berarti positif mengandung protein.
Protein merupakan molekul kompleks yang terdiri dari asam-asam amino dan dihubungkan dengan ikatan peptida. Secara umum, rumus molekul protein
terdiri atas sebuah atom karbon C yang mengikat sebuah gugus ami da -NH
2
, sebuah gugus karboksil COO
-
, sebuah atom hidrogen H dan sebuah gugus alkil R. Apabila sebuah molekul protein diberi pereaksi bradford yang terdiri dari
larutan kupriasetat dan asam asetat dalam air maka ion logam Cu akan direduksi oleh protein gugus COO
-
sehingga terbentuk Cu
2
O yang diindikasikan dengan terbentuknya warna biru.
3.3.4.4 Uji Alkaloid
Cuplikan sampel ditambah kloroform dan beberapa tetes amonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H
2
SO
4
2M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner.
Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih untuk pereaksi Meyer, endapan merah untuk pereaksi Dragendorf dan endapan coklat untuk
pereaksi Wagner.
35
Menurut Suradikusumah 1989, alkaloid umumnya dinyatakan sebagai senyawa basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen yang merupakan
bagian dari sistem siklik. Atom nitrogen ini hampir selalu dalam bentuk gugus amina atau amida. Substituen oksigen umumnya dalam bentuk gugus fenol -OH,
metoksil -OCH
3
atau metilendioksi -O
2
CH
3
. Penggunaan pereaksi Dragendorf, Meyer dan Wagner didasarkan pada reaksi oksidasi yang mana logam-logam pada
pereaksi merupakan oksidator ya ng membawa elektron sehingga terlepasnya atom H misalnya dari gugus OH dan selanjutnya berikatan dengan gugus amina atau
amida yang diindikasikan dengan terbentuknya warna. Warna yang terbentuk tergantung pada logam yang terdapat pada pereaksinya, misalnya Iodida pada
pereaksi Dragendorf akan memberikan warna merah. Beberapa pereaksi pengendapan digunakan untuk memisah-misahkan jenis
alkaloid. Pereaksi sering didasarkan pada kesanggupan alkaloid untuk bergabung dengan logam yang memiliki berat atom tinggi seperti merkuri, bismut, tungsten,
atau jood. Pereaksi Meyer mengandung kalium jodida dan merkuri klorida, pereaksi Dragendorf mengandung bismut nitrat dan merkuri klorida dalam asam
nitrit berair, pereaksi Burchard mirip dengan pereaksi Wagner dan mengand ung kalium jodida dan jood. Berbagai pereaksi tersebut menunjukkan perbedaan yang
besar dalam hal sensitivitas terhadap gugus alkaloid yang berbeda Sastrohamidjojo 1996.
3.3.4.5 Uji Saponin
Sampel sebanyak 1 gr ditambahkan air secukupnya selanjutnya dipanaskan pada air mendidih water bath selama 5 menit. Setelah proses pemanasan, larutan
didinginkan kemudian dikocok. Jika timbul busa yang bertahan lebih dari 10 menit menunjukkan adanya saponin.
Busa yang terbentuk secara stabil pada larutan cair disebabkan karena bahan yang diekstrak mengandung surfaktan yaitu senyawa glikosida yang berfungsi
sebagai detergen alami. Biasanya saponin memiliki satu atau lebih monosakarida yang mudah terhidrolisis dengan panas dan dalam keadaan dingin bila dikocok
mudah membentuk busa yang stabil Rao 1996.
36
3.3.4.6 Uji Flavonoid
Sampel sebanyak 1 gr ditambahkan metanol 30 sampai sampel terendam kemudian dipanaskan sampai didapatkan filtrat yang pekat. Setelah pemanasan,
filtrat yang diperoleh ditaruh ke dalam papan uji spot plate, kemudian ditambahkan H
2
SO
4
. Jika pada penambahan asam sulfat terbentuk warna merah maka positif mengandung flavonoid.
Flavonoid merupakan golongan senyawa yang memiliki kerangka karbon terdiri dari dua gugus C
6
cincin benzena tersubstitusi disambungkan oleh rantai alifatik tiga-karbon. Penambahan metanol 30 kemudian dipanaskan akan
memudahkan reduksi asam sulfat pekat menghasilkan warna merah pada flavonol, flavanon, flavanonol dan xanton Robinson 1995.
3.3.4.7 Uji Triterpenoid dan Steroid
Uji Lieberman Burchard dilakukan berdasarkan asetilasi 3 β
hidroksi oleh asam anhidrida dalam H
2
SO
4
. Ester asetil 3 β
hidroksi sterol yang mengandung ikatan ganda didalam asam akan mengalami epimerisasi menjadi bentuk 3
α dan
reaksi eliminasi yang menimbulkan produk berwarna. Uji triterpenoid ditandai dengan warna ungu atau merah, sedangkan steroid warna hijau atau biru. Sampel
sebanyak 2 gr ditambahkan 25 ml etanol 30 kemudian dipanaskan 50
o
C dan disaring. Filtrat yang diperoleh diuapkan, selanj utnya ditambahkan eter. Lapisan
eter yang terbentuk dipipet dan diletakan pada papan uji spot plate kemudian ditambah pereaksi Lieberman Burchard 3 tetes asam asetat anhidrin dan 1 tetes
H
2
SO
4
pekat, selanjutnya diamati warna yang terbentuk.
3.3.5 Isolasi Senyawa Aktif Inhibitor Topoisomerase I
Ekstrak terpilih adalah ekstrak yang memiliki rendemen terbesar serta memiliki aktivitas inhibitor topoisomerase. Ekstraksi senyawa kimia ini meliputi :
1. Isolasi Alkaloid. Metode yang digunakan mengacu pada Sugita et al. 2006.
Ekstrak metanol sebanyak 1,5 gr direndam dengan metanol-air 4:1 selama 24 jam. Setelah itu disaring dan filtratnya dimaserasi sampai sisa 110
volume awal pada suhu 40
o
C. Selanjutnya diasamkan dengan H
2
SO
4
2M sampai pH 3-4. Kemudian ekstraksi dengan kloroform proses ini dilakukan
sebanyak tiga kali yang mana akan terbentuk dua lapisan yaitu lapisan
37
bawah merupakan lapisan kloroform dan lapisan atas merupakan lapisan air asam. Lapisan kloroform bawah dipipet untuk tiga kali ekstrak dan
diuapkan pada suhu 40
o
C sampai berbentuk pasta. Selanjutnya ekstrak dikerok dan dimasukkan dalam botol sampel. Proses ekstraksi tersebut
secara rinci terlihat pada Lampiran 2. 2.
Isolasi Steroid. Metode ekstraksi steroid mengacu pada Bahti et al. 1983 dalam Heryani 2002. Cuplikan ekstrak metanol dihidrolisis dengan KOH
10 dalam etanol diatas penangas air pada suhu 100
o
C selama 3 jam. Selanjutnya di saring, dan hidrolisat yang diperoleh dievaporasi sampai
kering hidrolisat kering. Kemudian diekstraksi dengan dietil eter, dan ekstrak dietil eter dicuci berturut-turut dengan air, HCl 2N, air, NaHCO
3
jenuh, NaCl jenuh. Akhir pencucian akan diperoleh fase dietil eter dan selanjutnya dikeringkan dengan Na
2
SO
4
anhidrat sehingga diperoleh ekstrak dietil eter steroid bebas. Proses ekstraksi steroid terlihat pada Lampiran 3.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Komposisi Kimia Atactodea striata
Komposisi kimia daging kerang mas ngur Atactodea striata disajikan pada pada Tabel 1.
Tabel 1. Komposisi kimia serbuk kering Atactodea striata dibandingkan dengan sumber nutrisi lain
Nutrisi berat kering
Kerang mas ngur A. striata
Kerang Mytilus viridis L
Teripang batu H. scabra
Teripang pasir H. nobilis
Kadar air 7,84
35,68 10,34
1,88 Protein
56,08 42,17
54,05 46,56
Lemak 5,95
5,06 6,30
4,86 Abu
7,88 17,09
28,02 45,41
Serat kasar 1,25
- -
- Karbohidrat
21 8,45
1,29 1,29
Sumber : berbagai publikasi penelitian dari Balai Penelitian Perikanan Laut dari tahun 1984 – 2004 dalam Witjaksono 2005
Komposisi kimia kerang mas ngur Atactodea striata dibandingkan dengan sumber nutrisi lain berdasarkan berat keringnya Tabel 1 menunjukkan kadar
protein yang tinggi sehingga peluang pemanfaatannya sebagai salah satu sumber protein hewani cukup besar. Bahan pangan yang dikonsumsi manusia sebenarnya
bukan saja yang mempunyai komposisi gizi yang baik serta penampakan dan cita rasanya menarik, tetapi juga harus memiliki fungsi fisiologis terutama dalam
upaya penyembuhan penyakit. Berdasarkan komposisi kimia diatas maka kerang mas ngur Atactodea
striata termasuk salah satu hasil perikanan berprotein tinggi lebih dari 50 dan lemak sedang diatas 5 serta tinggi karbohidrat lebih dari 20 sehingga baik
untuk dikonsumsi khususnya bagi penderita sakit hati Primadhani 2006. Secara tradisional kerang mas ngur Atactodea striata digunakan untuk
mengobati penyakit hati, dan kenyataan ini jika dikaji dari segi kandungan gizi dapat dibenarkan karena penderita sakit hati umumnya memiliki gangguan pada
metabolisme protein, lemak dan karbohidrat dimana gangguan ini terjadi akibat dari fungsi hati yang tidak berjalan secara normal sehingga dapat menyebabkan
akumulasi bermacam-macam racun. Menurut Morgan dan Heaton 2000, metabolisme karbohidrat, protein, lemak, dan alkohol diatur di hati. Oleh karena
