Desain Penelitian Determinasi Tanaman Bahan yang Diuji Alur Penelitian

26

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan post test only control group design dengan melakukan uji toksisitas ekstrak etanol biji buah alpukat Persea americana Mill. terhadap larva Artemia salina Leach menggunakan metode BSLT. 40

3.2 Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2014 sampai bulan Agustus 2014 di Laboratorium Penelitian 1, Laboratorium Farmakognosi Fitokimia dan Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 3.3 Populasi dan Sampel 3.3.1 Populasi Populasi pada penelitian ini adalah Artemia salina Leach 3.3.2 Sampel 3.3.2.1 Kriteria inklusi  Larva Artemia salina Leach berumur 48 jam.  Larva Artemia salina Leach hidup.  Larva Artemia salina Leach yang bergerak aktif.

3.3.2.2 Kriteria eksklusi

Larva Artemia salina Leach yang tidak menunjukkan aktivitas pergerakan sebelum perlakuan.

3.3.2.3 Besar sampel

Jumlah larva Artemia salina Leach untuk tiap konsentrasi adalah 10 ekor larva. Pada penelitian ini dibuat tujuh konsentrasi untuk uji ekstrak etanol biji alpukat Persea americana Mill. dan satu konsentrasi untuk kontrol negatif. Dan setiap konsentrasi untuk uji dan kontrol negatif dilakukan replikasinya sebanyak tiga kali. Jadi, total sampel larva Artemia salina Leach yang dibutuhkan dalam penelitian adalah 240 ekor. 3.3.2.4 Cara pengambilan sampel Cara pengambilan sampel larva Artemia salina Leach dalam penelitian ini menggunakan purposive random sampling.

3.4 Determinasi Tanaman

Determinasi biji buah alpukat Persea americana Mill. dilakukan di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor, LIPI. Dengan dilakukan determinasi ini, maka bisa ditentukan spesies biji buah alpukat Persea americana Mill. yang digunakan peneliti sudah benar.

3.5 Bahan yang Diuji

Bahan yang digunakan adalah biji buah alpukat Persea americana Mill. yang diperoleh dari penjual buah di toko buah Ciputat yang akan dijadikan ekstrak dengan menggunakan pelarut etanol.

3.6 Alat dan Bahan Penelitian

3.6.1 Alat Penelitian

Botol kaca maserasi; cawan petri; cawan penguap; corong; gelas beaker; hot plate stirrer; kaca arloji; lup; mikropipet; neraca analitik; pipet tetes; rotatory evaporator; sendok kecil; seperangkat alat penetasan udang; tabung reaksi; tabung erlenmayer; plate.

3.6.2 Bahan Penelitian

Akuades; air laut; alumunium foil; serbuk kering biji buah alpukat Persea americana Mill.; kertas saring; etanol teknis 96 BRATACO; telur udang Artemia salina Leach BBAT; DMSO BIOMATIK A2424.

3.7 Cara Kerja Penelitian

3.7.1 Persiapan dan Pembuatan Simplisia

Buah alpukat yang diperoleh di toko buah Ciputat, dilakukan terlebih dahulu determinasi di Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor, LIPI untuk menentukan spesisesnya dan menentukan spesies yang digunakan peneliti sudah benar. Setelah dilakukan determinasi, 21 kg buah apulkat dipotong dan diambil bijinya saja yang akhirnya didapatkan seberat 5,5 kg, kemudian bijinya dibersihkan dan dicuci. Setelah itu, biji buah alpukat tersebut dibawa ke Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Balitro untuk dikeringkan dan dihaluskan menjadi simplisia kering dan halus yang beratnya sekitar 1,5 kg.

3.7.2 Ekstraksi Biji Buah Alpukat

Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserasi yang mana simplisia yang telah bercampur dengan pelarut diaduk ataupun dikocok sampai seluruh simplia bercanpur seluruhnya dengan pelarut. Simplisia yang telah berbentuk serbuk kering dan halus seberat 1,5 kg dan pelarut etanol 96 dimasukkan ke botol kaca maserasi sampai simplisia tersebut terendam sepenuhnya dengan pelarut etanol 96. Setelah direndam selama 4 hari dan diaduk serta dikocok, kemudian dilanjutkan dengan proses penyaringan dengan kertas saring. dari hasil penyaringan ini, didapatkan filtrat dan residu. Residu yang berupa ampas dimasukkan kembali ke botol kaca maserasi, sedangkan filtratnya ditampung terlebih dahulu dan kemudian dilanjutkan proses pemekatan dengan menggunakan rotary evaporator pada suhu 45 o C dan akhirnya didapatkan ekstrak yang agak kental dari biji buah alpukat. Kemudian untuk mendapatkan hasil akhir ekstrak biji buah alpukat yang benar- benar kental, maka dilakukan penguapan di oven dengan suhu 40 o C selama satu minggu sampai akhirnya didapatkan ekstrak etanol kental dari biji buah alpukat seberat 70,46 gram. 3.7.3 Penetasan Larva Udang Artemia salina Leach Persiapan yang dilakukan untuk penetasan larva udang Artemia salina Leach yaitu, membuat tempat penetasan. Tempat penetasan yang digunakan adalah wadah plastik berukuran 30 cm x 20cm x 10cm yang dibagi menjadi dua wilayah gelap dan wilayah terang yang dibatasi oleh sterofoam yang pada bagian bawah tengahnya sudah dibuat lubang. Wilayah gelap merupakan tempat telur larva Artemia salina Leach yang belum menetas, sedangkan wilayah terang merupakan tempat larva Artemia salina Leach yang sudah menetas. Lubang pada sterofoam berfungsi sebagai jalur tempat keluarnya telur Artemia salina Leach yang menetas. Untuk airnya sendiri digunakan air laut sebanyak 1 L dan telur larva Artemia salina Leach sebanyak 1 gram dengan pH basa yang dimasukkan di wadah plastik sampai merendam sepertiga sampai setengah wadah plastik. Dalam proses penetasan larva udang ini sendiri juga digunakan lampu untuk menghangatkan dan menerangi wilayah terang serta membuat larva Artemia salina Leach bergerak dari wilayah gelap ke wilayah terang. Untuk wilayah gelap sendiri dibuat dengan cara ditutup dengan kertas alumunium foil dan ditempel dengan lakban hitam. Setelah telur menetas menjadi larva yang berusia 24 jam, kemudian dipindahkan ke wadah lain hingga berumur 48 jam, maka bisa segera dilakukan tahap pembuatan konsentrasi larutan uji dan uji toksisitas akut dengan metode BSLT.

3.7.4 Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji

Dalam penentuan konsentrasi ekstrak yang efektif untuk membunuh larva Artemia salina Leach, terlebih dahulu dilakukan uji orientasi untuk menentukan persentase kamatian 10 - 90 kematian larva dengan pembuatan konsentrasi sebesar 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, dan 10 ppm. Untuk pembuatan larutannya, diambil ekstrak seberat 2000 mg yang ditimbang dengan neraca analitik. Kemudian dilarutkan dengan DMSO seberat 2 mL dan setelah itu ditambah pelarut akuades sampai volume tabung erlanmeyer mencapai 100 mL sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk dengan konsentrasi 20.000 ppm. Untuk mendapatkan larutan yang homogen dilakukan dengan cara diaduk dengan menggunakan hot plate stirrer. Setelah didapatkan larutan induk 20.000 ppm, kemudian dilakukan pengenceran untuk mendapatkan larutan uji dengan konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 50 ppm, 25 ppm, 10 ppm. Setelah didapatkan persentase kematian 10 – 90, dilakukan pembuatan larutan uji sebenarnya dengan konsentrasi 80 ppm,70 ppm, 60 ppm, 50 ppm, 40 ppm, 30 ppm, 20 ppm. Dalam proses pengenceran tersebut menggunakan rumus pengenceran sebagai berikut: V 1 M 1 = V 2 M 2 Keterangan: V I = Volume Awal M 1 = Konsentrasi Awal V 2 = Volume Akhir M 2 = Konsentrasi Akhir

3.7.5 Uji Toksisitas Akut dengan Metode BSLT

Uji toksisitas akut dilakukan dengan cara mempersiapkan plate yang masing-masing sumurnya diisi dengan 1 mL senyawa uji dan ditambahkan juga 1 mL air laut dengan menggunakan mikropipet sehingga didapatkan volume 2 mL. Kemudian 10 larva Artemia salina Leach dipindahkan dengam menggunakan mikropipet ke masing-masing sumur. Untuk setiap konsentrasi dan kontrol negatif dilakukan triplo pengulangan sebanyak tiga kali. Setelah 24 jam, kemudian dihitung jumlah larva yang hidup untuk mengetahui jumlah larva yang mati. Untuk melihat larva Artemia salina Leach sudah mati atau tidak, digunakan lup atau digital colony counter apakah ada gerakan atau tidak oleh larva Artemia salina Leach selama pengamatan. Untuk memastikan juga, bisa memberikan rangsangan berupa cahaya dan menggerakkan plate untuk melihat apakah larva Artemia salina Leach sudah mati atau tidak. Pengamatan dilakukan selama 1 jam. Tabel 3.1 Ilustrasi Konsentrasi Ekstrak pada Plate 1 2 3 4 5 6 A 1 mL ekstrak 80 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 80 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 80 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 40 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 40 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 40 ppm + 1 mL air laut + 10 larva B 1 mL ekstrak 70 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 70 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 70 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 30 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 30 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 30 ppm + 1 mL air laut + 10 larva C 1 mL ekstrak 60 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 60 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 60 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 20 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 20 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 20 ppm + 1 mL air laut + 10 larva D 1 mL ekstrak 50 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 50 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 1 mL ekstrak 50 ppm + 1 mL air laut + 10 larva 2 mL air laut + 10 larva 2 mL air laut + 10 larva 2 mL air laut + 10 larva

3.8 Alur Penelitian

Gambar 3.1 Bagan alur penelitian A. 1 gram telur Artemia Leach B. Penetasan telur Artemia salina D. Larva Artemia salina Leach yang telah bersifat homogen dengan jenis dan cara penyediaan yang sama G. Volume akhir pada setiap sumur adalah 2 mL H. Setiap konsentrasi dilakukan 3 kali replikasi E. Pengambilan larva Artemia salina Leach secara random J. Pembuatan larutan uji yang sebenarnya Sumur A : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 80 ppm + 1 mL air laut Sumur B : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 70 ppm + 1 mL air laut Sumur C : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 60 ppm + 1 mL air laut Sumur D : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 50 ppm + 1 mL air laut Sumur E : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 40 ppm + 1 mL air laut Sumur F : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 30 ppm + 1 mL air laut Sumur G : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 20 ppm + 1 mL air laut Kontrol- : 10 larva + 2 mL air laut F. Uji Orientasi Sumur A : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 1000 ppm + 1 mL air laut Sumur B : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 500 ppm + 1 mL air laut Sumur C : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 250 ppm + 1 mL air laut Sumur D : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 100 ppm + 1 mL air laut Sumur E : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 50 ppm + 1 mL air laut Sumur F : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 25 ppm + 1 mL air laut Sumur G : 10 larva + 1 mL konsentrasi ekstrak 10 ppm + 1 mL air laut Kontrol- : 10 larva + 2 mL air laut C. Larva Artemia salina Leach yang berumur 48 jam I. Setelah 24 jam pemberian ekstrak, dilakukan perhitungan dan persentase larva yang mati L. Penentuan nilai LC 50 dengan metode probit K. Lakukan kembali langkah G-I, kemudian lanjutkan ke langkah L

3.9 Pengolahan dan Analisis Data