bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan dalam buah dan sayuran Hattenschwiler, 2000. Struktur dasar polifenol dapat dilihat pada Gambar 2.4.
Gambar 2.4 Struktur dasar polifenol Hattenschwiler, 2000.
2.5 Spektrofotometri UV-Visible
Prinsip kerja Spektrofotometer Visible adalah sinarcahaya dilewatkan melewati sebuah wadah kuvet yang berisi larutan, dimana akan menghasilkan
spektrum. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan. Nilai absorbansi dari cahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan
konsentrasi larutan di dalam kuvet. Alat ini menggunakan hukum Lambert Beer sebagai acuan Ewing, 1975.
Ahli kimia telah lama menggunakan warna sebagai bantuan dalam mengenali zat-zat kimia. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu
pemeriksaan visual, yaitu dengan menggunakan alat untuk mengukur absorpsi energi radiasi macam-macam zat kimia dan memungkinkan dilakukannya
pengukuran kualitatif dari suatu zat dengan ketelitian yang lebih besar Day, 1994.
Spektrofotometer UVVisibel pada dasarnya terdiri atas sumber sinar monokromator, tempat sel untuk zat yang diperiksa, detektor, penguat arus dan
alat ukur atau pencatat. Panjang gelombang untuk sinar ultraviolet antara 200-400
Universitas Sumatera Utara
nm sedangkan panjang gelombang untuk sinar tampakvisible antara 400-750 nm Rohman, 2007.
2.6 Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH Metode untuk menentukan aktivitas antioksidan ada beberapa cara, yaitu:
1. BCB Method β-Carotene Bleaching Method atau Metode Pemutihan β-
karoten, 2. DPPH 1,1-difenil-2- picrylhydrazil Radical Scavenging Method
Metode Pemerangkapan Radikal Bebas DPPH, 3. Thiobarbituric Acid- Reactive Substance TBARS Assay, 4. ORAC Assay Oxygen-Radical
Absorbance Capacity, 5. CUPRAC Assay Cupric Reducing Antioxidant Capacity, 6. FRAP Assay Ferric Reducing Antioxidant Power, 7.
Determination of Conjugated Dienes, 8. Determination of Lipid Hydroperoxides De la Rosa, 2010.
Pada tahun 1922, Goldschmidt dan Renn menemukan senyawa berwarna ungu radikal bebas stabil DPPH, yang sekarang digunakan sebagai reagen
kolorimetri untuk proses redoks. DPPH berwarna sangat ungu seperti KMnO
4
dan bentuk tereduksinya yaitu 1,1-difenil-2- picrylhydrazine DPPH-H yang
berwarna oranye-kuning. DPPH bersifat tidak larut dalam air Ionita, 2003. DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada suhu kamar dan sering
digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara transfer
elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan radikal bebas dari DPPH dan membentuk DPPH tereduksi. Jika semua elektron pada radikal bebas
DPPH menjadi berpasangan, maka warna larutan berubah dari ungu tua menjadi
Universitas Sumatera Utara
kuning terang dan absorbansi pada panjang gelombang 517 nm akan hilang. Perubahan ini dapat diukur sesuai dengan jumlah elektron atau atom hidrogen
yang ditangkap oleh molekul DPPH akibat adanya zat reduktor Molyneux, 2004.
Metode DPPH merupakan suatu metode yang cepat, sederhana, dan murah yang dapat digunakan untuk mengukur kemampuan antioksidan yang terkandung
dalam makanan. Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang padat dan juga dalam bentuk larutan dan berlaku untuk keseluruhan kapasitas antioksidan
sampel. Prinsipnya adalah elektron ganjil pada molekul DPPH memberikan serapan maksimum pada panjang gelombang tertentu yang berwarna ungu. Warna
ini akan berubah dari ungu menjadi kuning lemah apabila elektron ganjil tersebut berpasangan dengan atom hidrogen yang disumbangkan senyawa antioksidan.
Perubahan warna ini berdasarkan reaksi kesetimbangan kimia Prakash, 2001.
Molyneux 2004, menyatakan bahwa suatu zat mempunyai sifat antioksidan bila nilai IC
50
kurang dari 200 ppm. Bila nilai IC
50
yang diperoleh berkisar antara 200-1000 ppm, maka zat tersebut kurang aktif namun masih
berpotensi sebagai zat antioksidan. Rumus molekul DPPH dapat dilihat pada Gambar 2.5.
a b Gambar 2.5
Rumus Bangun DPPH Molyneux, 2004
Universitas Sumatera Utara
Keterangan: a. bentuk radikal DPPH
b. bentuk nonradikal DPPH-H
DPPH merupakan radikal bebas yang stabil karena resonansi yang dialaminya. Resonansi DPPH dan reaksi DPPH dengan atom H netral yang
berasal dari senyawa-senyawa yang bersifat antioksidan dapat dilihat pada Gambar 2.6 dan Gambar 2.7.
Gambar 2.6 Resonansi DPPH Molyneux, 2004
Gambar 2.7 Reaksi antara DPPH dengan atom H netral yang berasal dari
antioksidan Molyneux, 2004. Parameter yang dipakai untuk menunjukan aktivitas antioksidan adalah
harga konsentrasi efisien atau efficient concentration EC
50
atau Inhibition Concentration IC
50
yaitu konsentrasi suatu zat antioksidan yang dapat menyebabkan 50 DPPH kehilangan karakter radikal atau konsentrasi suatu zat
Universitas Sumatera Utara
antioksidan yang memberikan penghambatan 50. Zat yang mempunyai aktivitas antioksidan tinggi, akan mempunyai harga EC
50
atau IC
50
yang rendah Molyneux, 2004.
2.6.1 Pelarut
Metode ini akan memberikan hasil yang baik dengan menggunakan pelarut metanol atau etanol dan kedua pelarut ini tidak mempengaruhi dalam
reaksi antara sampel uji sebagai antioksidan dengan DPPH sebagai radikal bebas Molyneux, 2004.
2.6.2 Pengukuran absorbansi – panjang gelombang
Panjang gelomb ang maksimum
maks
yang digunakan dalam pengukuran sampel uji sangat bervariasi. Menurut beberapa literatur panjang gelombang
maksimum untuk DPPH antara lain 515 nm, 516 nm, 517 nm, 518 nm, 519 nm dan 520 nm. Pada prakteknya hasil pengukuran yang memberikan peak
maksimum itulah panjang gelombangnya yaitu sekitar panjang gelombang yang
disebutkan diatas Molyneux, 2004. 2.6.3 Waktu pengukuran
Pada metode sebelumnya waktu reaksi yang direkomendasikan adalah 60 menit, dan telah dilakukan pada beberapa penelitian. Waktu yang paling cepat
yang pernah digunakan adalah 5 menit atau 10 menit. Kenyataannya waktu reaksi yang tepat adalah ketika reaksi sudah mencapai kesetimbangan. Kecepatan reaksi
dipengaruhi oleh sifat dari aktivitas antioksidan yang terdapat di dalam sampel
Molyneux, 2004.
Universitas Sumatera Utara
BAB III METODE PENELITIAN
