BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Alat – Alat
1. Gelas ukur 50 ml100 ml
Pyrex 2. Gelas Beaker
250 ml1000 ml Pyrex
3. Corong kaca 4. Corong pisah
500 ml Pyrex
5. Kolom kromatografi Pyrex
6. Tabung reaksi Pyrex
7. Plat tetes 8. Rotari evaporator
Büchi R-114 9. Labu alas
1 l Schott Duran
10. Alat pengukur titik lebur Fisher
11. Statif dan klem 12. Lampu UV
254 nm 356 nm UVGL 58
13. Spatula 14. Neraca analitis
Mettler AE 200 15. Pipet tetes
16. Penangas air Büchi B-480
17. Botol vial 18. Bejana Kromatografi Lapis Tipis
19. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
20. Spektrometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR-500MHz
21. Spektrofotometer UV-Visible 22. Kertas Saring
23. Pelat KLT Merck Kieselgel 60 F
254
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-Bahan
1. Kulit batang Jati Tectona Grandis L.f 2. Metanol Me-OH
Destilasi 3. N-heksana
Teknis 4. Etil asetat EtOAc
Teknis 5. Aquadest
6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KGaA
7. FeCl
3
Teknis 8. NaOH
Teknis 9. Mg-HCl
10. H
2
SO
4p
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit batang jati yang diperoleh dari jalan Sei silau kecamatan Medan Baru. Kulit batang jati dikeringkan di udara terbuka, lalu
dihaluskan dengan cara dipotong kecil-kecil sampai diperoleh serbuk kulit batang jati sebanyak 4000 g.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Kulit Batang Tumbuhan Jati
Serbuk kering kulit batang jati diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji busa
2. Skrining fitokimia 3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.1. Uji Busa
Ekstrak metanol kulit batang jati sebanyak 10 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi . Kemudian ditambah 10 ml akuades dan dipanaskan pada penangas air . Lalu dikocok–
kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit . Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam kulit batang tumbuhan jati tidak
terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit batang jati, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk kulit batang jati Tectona Grandis L.f yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan ± 100 ml metanol - Didiamkan selama 1 malam
- Disaring - Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi
- Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I
: dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II
: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan berwarna orange kekuningan
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda
d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet
Universitas Sumatera Utara
3.3.2.3 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang
digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ;
60:40 vv. Pelarut yang digunakan berdasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak yaitu campuran n-heksana : etil asetat 90:10vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak
pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang
telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat
dengan perbandingan 80 :20vv; 70:30vv; dan 60:40vv.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam kulit batang jati terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak
n-heksana : etil asetat 60:40vv
3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Kulit Batang Jati
Tectona Grandis L.f
Serbuk kulit batang jati ditimbang sebanyak 4000 g, dimasukkan ke dalam ekstraktor kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 7L sampai semua sampel terendam
dan dibiarkan selama ± 3 hari. Ekstrak disaring dan diperoleh ekstrak berwarna merah kecoklatan. Maserasi dilakuka secara berulang dengan menggunakan pelarut metanol
hingga ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoida. Ekstrak metanolmaserat yang
Universitas Sumatera Utara
diperoleh dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator pada suhu 60 C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut
metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu
diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol
dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu lapisan metanol dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol
sebanyak 6,066 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol dari kulit batang jati yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel
40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n- heksana : etil asetat dengan perbandingan 90 : 10 vv, 80 : 20 vv, 70:30vv dan
60:40vv.
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100 hingga silika gel dalam kolom padat dan homogen.
Dimasukkan 6,066 g ekstrak metanol kulit batang jati ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat
90 : 10 vv secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan
kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan 80 : 20 vv, 70:30vv dan 60:40vv. Hasil yang diperoleh
ditampung dalam botol vial setiap 13 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
Universitas Sumatera Utara
3.3.5 Pemurnian Rekristalisasi
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom harus dimurnikan.
Kristal yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat, diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan n – heksana
secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari
kristal hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut.
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40 vv.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat
KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari
bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa
flavonoida.
3.3.7 Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat pengukur titik lebur, diatur suhu. Lalu diamati suhu sampai kristal melebur.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
3.3.8.2. Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan aseton sebagai pelarut.
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
diekstraksi maserasi dengan metanol disaring
dipekatkan dibagi ke dalam 4 tabung reaksi
ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan pereaksi FeCl
3
pereaksi NaOH pereaksi Mg-HCl pereaksi
1 10 H
2
SO
4p
diamati peruba- diamati peruba- diamati peruba- diamati peru-
han warna han warna
han warna bahan warna
Larutan biru violet
Larutan merah muda
Larutan orange kekuningan
Larutan hitam
10 g serbuk kulit batang tumbuhan jati Tectona Grandis L.f
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung IV
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
diskrining fitokimia dimaserasi dengan metanol sebanyak 6 L
didiamkan selama 3 hari diulangi sebanyak 6 kali
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotari-evaporator
diuapkan hingga semua metanol menguap dilarutkan dengan etil asetat
disaring
dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga semua etil asetat menguap
dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
di-KLT untuk mengetahui sistem eluen yang sesuai pada kromatografi kolom dipisahkan tiap fraksi melalui kromatagrafi kolom dengan fasa gerak yaitu campuran pelarut n-
heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40
v v
ditampung tiap fraksi sebanyak 13 ml dalam botol vial di-KLT untuk mengetahi harga Rf
digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
ditentukan nilai Rf nya diuapkan
direkristalisasi diukur massa
diuji titik lebur dianalisis dengan Spektrofotometer UV-Visible,
spektrofotometer FT-IR, spektrometer
1
H-NMR 2000 g serbuk kulit batang tumbuhan jati Tectona
Grandis L.f
Ekstrak metanol
Kristal kuning muda
Ekstrak pekat Lapisan metanol
Lapisan n-heksana tidak dilanjutkan
Filtrat Residu
Padatan Ekstrak pekat metanol
Residu
Hasil analisis Fraksi
171-195 60:40
Fraksi 196-220
60:40 Fraksi 221-245
60:40 Fraksi 246-260
60:40
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak metanol dari kulit batang tumbuhan jati dengan penambahan pereaksi-pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa
kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoida yaitu; 1. H
2
SO
4 p
memberikan warna orange kekuningan 2. NaOH 10 memberikan warna biru violet
3. FeCl
3
1 memberikan warna hitam 4. Mg – HCl memberikan warna merah muda
Hasil isolasi senyawa flavonoida dari ekstrak kulit batang tumbuhan jati diperoleh dengan menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat 60:40vv, kristal
berwarna kuning, berbentuk kristal, massa = 18 mg, Rf=0,38 , dan titik lebur 175-177 C.
Dari hasil analisis Spektrofotometer ultra violet –visible UV – Visible dengan pelarut metanol memberikan panjang gelombang maksimum
λ maks 213,0
dan 287,9 nm yang menunjukkan golongan Flavanon. Lampiran D
Hasil analisis Spektrofotometer Inframerah FT-IR dari kristal hasil isolasi menghasilkan pita–pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut :
1. Pada bilangan gelombang 3334,92 cm
-1
menunjukkan adanya vibrasi –OH 2. Pada bilangan gelombang 2922,16 cm
-1
menunjukkan adanya vibrasi C=CH
3. Pada bilangan gelombang 2852,72 cm
-1
menunjukkan adanya vibrasi -CH aromatik.
Universitas Sumatera Utara
Kategori