Uji Penghambatan Degranulasi Mastosit Tersensitisasi Aktif Oleh Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa (Scheff) Boerl) Pada Mencit Jantan

LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Ethical clearance

44

Lampiran 2. Surat LIPI

45

Lampiran 3. Bagan alur penelitian
Daun Mahkota Dewa
Dicuci dari pengotor sampai bersih
Ditiriskan
Ditimbang berat basahnya
Daun Mahkota Dewa
Pemeriksaan organoleptis dan
makroskopik
Dirajang dan dikeringkan pada suhu
±40 - 50°C
Ditimbang berat keringnya
Simplisia

Karakterisasi

Skrining fitokimia

1. Makroskopik
2. Mikroskopik
3. Penetapan Kadar
Air
4. Kadar Sari yang
Larut Dalam Air
5. Kadar Sari yang
Larut dalam
Etanol
6. Kadar Abu Total
7. Kadar Abu yang
tidak larut dalam
asam
Senyawa golongan
•

•
•
•
•
•

Alkaloida
Glikosida
Flavanoida
Steroid
Saponin
Tanin

300 gram serbuk simplisia
Dimasukkan dalam wadah
kaca
Ditambahkan etanol 96%
hingga serbuk terendam
Dibiarkan selama 3 jam
Dimasukkan kedalam alat

perkolator
Dituang penyari diatasnya
Ditutup mulut perkolator
selama 24 jam
Dibuka kran perkolator
Dibiarkan tetesan ekstrak
mengalir dengan kecepatan
1 ml/menit
Ditampung perkolat dalam
botol kaca
Dihentikan kran apabila
perkolat terakhir diuapkan
tidak meninggalkan sisa
Dipekatkan dengan rotary
evaporator
Ekstrak kental 69,15 g
Diuji aktivitas
penghambatan
degranulasi
Hasil

46

Lampiran 4. Gambar Tumbuhan Mahkota Dewa

47

Lampiran 5. Gambar Hasil Pemeriksaan Makroskopik

Gambar : Daun mahkota dewa

Gambar : Daun kering mahkota dewa

48

Gambar : Serbuk simplisia daun mahkota dewa

49

Lampiran 6. Gambar Mikroskopik dengan Perbesaran 10 x 40

4
1

2
3

Daun mahkota dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff) Boerl)
Keterangan :
1. Stomata
2. Hablur Kristal Oksalat bentuk prisma
3. Rambut Penutup
4. Silem

50

Lampiran 7. Gambar rotary evaporator

51

Lampiran 8. Gambar hewan

Gambar : Mencit Jantan

Gambar : Mencit setelah dislokasi

52

Lampiran 9. Gambar alat

Gambar : Pipet mikro 5 – 50 µl/ml

Gambar : Kamar hitung improved Neubauer hemocytometer (Marienfeld)

53

Gambar : Mikroskop

54

Lampiran 10. Perhitungan Hasil Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Perhitungan Penetapan Kadar Air
Kadar air simplisia =

������ ��� (��)

����� ������ (�)

� ��� %

a. Sampel I
Berat sampel

= 5,054 g

Volume air

= 0,4 ml

Kadar air

=

0,4 ��

5,054 �

� 100 %

= 7,915 %
b. Sampel II
Berat sampel

= 5,080 g

Volume air

= 0,35 ml

Kadar air

=

0,35 ��

5,080 �

� 100 %

= 6,890 %
c. Sampel III
Berat sampel

= 5,029 g

Volume air

= 0,3 ml

Kadar air

=

0,3 ��

5,054 �

� 100 %

= 5,965 %
Kadar air rata-rata

=

����� ��� (������ �+������ ��+������ ���)%

=

7,915+6,890+5,965

3

3

55

= 6,923 %

Perhitungan Penetapan Kadar Sari yang Larut Dalam Air
a. Sampel
I larut dalam air = ������ ���� (��) �
Kadar
sari yang
����� ������ (�)

Berat sampel

= 5,074 g

Berat sari

= 0,263 ml

Kadar sari

=

0,263 ��
5,074 �

�

= 25,92 %

100

� 100 %

100

� 100 %

100

� 100 %

20

���
��

� ��� %

b. Sampel II
Berat sampel

= 5,053 g

Berat sari

= 0,246 ml

Kadar sari

=

0,246 ��
5,053 �

�

= 24,34 %

20

c. Sampel III
Berat sampel

= 5,021 g

Berat sari

= 0,250 ml

Kadar sari

=

0,250 ��
5,021 �

= 24,89%
Kadar sari yang larut

�

20

=

kadar sari (sampel I + sampel II + sampel III) %

=

25,92+24,34+24,89

dalam air rata-rata

3

= 25,05 %

56

3

Penetapan Kadar Sari yang Larut Dalam Etanol
Kadar sari yang larut dalam etanol =

������ ���� (��)

����� ������ (�)

�

���
��

� ��� %

a. Sampel I
Berat sampel

= 5,030 g

Berat sari

= 0,581 ml

Kadar sari

=

0,581 ��
5,030 �

�

= 57,75 %

100

� 100 %

100

� 100 %

100

� 100 %

20

b. Sampel II
Berat sampel

= 5,071 g

Berat sari

= 0,479 ml

Kadar sari

=

0,479 ��
5,071 �

�

= 47,23 %

20

c. Sampel III
Berat sampel

= 5,023 g

Berat sari

= 0,596 ml

Kadar sari

=

0,596 ��
5,023 �

= 59,33%
Kadar sari yang larut

�

20

=

kadar sari (sampel I + sampel II + sampel III) %

=

57,75+47,23+59,33

dalam air rata-rata

3

= 54,77 %

57

3

Perhitungan Penetapan Kadar Abu Total
Kadar abu total =

����� ��� (�)

����� ������ (�)

� ��� %

a. Sampel I
Berat sampel

= 2,001 g

Berat abu

= 0,194 g

Kadar abu

=

0,194 �

� 100 %

2,001 �

= 9,69%
b. Sampel II
Berat sampel

= 2,005 g

Berat abu

= 0,149 g

Kadar abu

=

0,149 �

� 100 %

2,005 �

= 7,43%
c. Sampel III
Berat sampel

= 2,004 g

Berat abu

= 0,095

Kadar abu

=

0,095 �

� 100 %

2,004 �

= 4,74%
Kadar abu total rata-rata

=

=

kadar sari (sampel I + sampel II + sampel III) %
3

9,69+7,43+4,74
3

= 7,28%

58

Perhitungan Penetapan Kadar Abu yang Tidak Larut Asam

Kadar abu yang tidak larut dalam asam =

����� ��� (�)

����� ������ (�)

� ��� %

a. Sampel I
Berat sampel

= 2,001 g

Berat abu

= 0,004 g

Kadar abu

=

0,004 �

2,001 �

= 0,19%

� 100 %

Sampel II
Berat sampel

= 2,005 g

Berat abu

= 0,010 g

Kadar abu

=

0,010 �

2,005 �

= 0,49%

� 100 %

b. Sampel III
Berat sampel

= 2,004 g

Berat abu

= 0,006 g

Kadar abu

=

0,006 �

2,004 �

= 0,29%
Kadar abu yang tidak larut

� 100 %
=

kadar sari (sampel I + sampel II + sampel III) %

=

0,19+0,49+0,29

dalam asam rata-rata

3

= 0,32%

59

3

Lampiran 11. Perhitungan Uji Ketahanan Sel (Cell Viability Test) digunakan
Rumus Sebagai Berikut :
% �� = � 1 −
% �� = � 1 −

���
� � 100 %
���

27
� � 100 %
287

= 90,59 %
Dimana :
% VC
= Viable Cell (Sel yang hidup atau tidak terdegranulasi)
UVC
= Unviable Cell (Sel yang terdegranulasi berwarna biru)
TCC
= Total Cell (Jumlah seluruh sel yang ada)

60

Lampiran 12. Gambar Sel Mastosit Pada Pengujian

b
a

Uji Ketahanan Sel (Cell Viability Test) dengan metode trypan blue exclusion
Keterangan : (a) = sel mastosit yang tidak terdegranulasi (tidak berwarna)
(b) = sel mastosit yang terdegranulasi (berwarna biru)

Pengujian dengan menggunakan pewarnaan biru toluidin dengan pembesaran
10x 40
Gambar : Sel mastosit yang tidak terdegranulasi

61

62

Lampiran 14. Hasil SPSS Data Normalitas

Descriptives
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnov
Statistic
Hewan 1

a

df

.134

Shapiro-Wilk

Sig.
8

Statistic

df

Sig.

*

.975

8

.931

*

.200

Hewan 2

.192

8

.200

.852

8

.099

Hewan 3

.290

8

.046

.832

8

.062

8

*

.956

8

.767

*

.914

8

.380

Hewan 4
Hewan 5

.152
.202

.200

8

.200

a. Lilliefors Significance Correction
*. This is a lower bound of the true significance.

63

Lampiran 15. Hasil SPSS Data Persen Degranulasi
% Degranulasi
95% Confidence
Interval for Mean

N

Mean

Std.

Std.

Lower

Upper

Deviation

Error

Bound

Bound

Minimum

Maximum

Normal

5

.0000

.00000

.00000

.0000

.0000

.00

.00

Kontrol

5

69.3720

6.83754

3.05784

60.8821

77.8619

58.42

75.00

Uji 100 µg/ml

5

63.1660

6.77403

3.02944

54.7549

71.5771

52.48

71.33

Uji 200 µg/ml

5

57.1960

6.96544

3.11504

48.5473

65.8447

46.53

64.52

Uji 300 µg/ml

5

50.1180

9.54762

4.26982

38.2631

61.9729

34.65

58.78

Uji 400 µg/ml

5

40.9160

12.54986

5.61247

25.3333

56.4987

24.75

55.91

Uji 500 µg/ml

5

29.3400

17.17029

7.67879

8.0203

50.6597

11.79

53.76

Kontrol positif

5

20.9680

12.53380

5.60529

5.4052

36.5308

8.49

34.47

40

41.3845

24.10499

3.81133

33.6754

49.0936

.00

75.00

negatif

Total

ANOVA
% Degranulasi
Sum of Squares
Between Groups
Within Groups
Total

df

Mean Square

19294.056

7

2756.294

3366.911

32

105.216

22660.967

39

64

F
26.197

Sig.
.000

Lampiran 16. Hasil SPSS Data Tukey HSD

Post Hoc Tests
Multiple Comparisons
% Degranulasi
Tukey HSD
(I) Perlakuan

(J)
Perlakuan

95% Confidence Interval

Mean
Difference

Upper

(I-J)
Normal

Kontrol

Std. Error

Sig.

Lower Bound

Bound

*

6.48740

.000

-90.3866

-48.3574

*

6.48740

.000

-84.1806

-42.1514

*

6.48740

.000

-78.2106

-36.1814

*

6.48740

.000

-71.1326

-29.1034

*

6.48740

.000

-61.9306

-19.9014

-29.34000

*

6.48740

.002

-50.3546

-8.3254

-20.96800

6.48740

.051

-41.9826

.0466

-69.37200

negatif
Uji 100

-63.16600

µg/ml
Uji 200

-57.19600

µg/ml
Uji 300

-50.11800

µg/ml
Uji 400

-40.91600

µg/ml
Uji 500
µg/ml
Kontrol
positif
Kontrol negatif

Normal

69.37200

*

6.48740

.000

48.3574

90.3866

Uji 100

6.20600

6.48740

.977

-14.8086

27.2206

12.17600

6.48740

.576

-8.8386

33.1906

19.25400

6.48740

.092

-1.7606

40.2686

*

6.48740

.003

7.4414

49.4706

*

6.48740

.000

19.0174

61.0466

*

6.48740

.000

27.3894

69.4186

µg/ml
Uji 200
µg/ml
Uji 300
µg/ml
Uji 400

28.45600

µg/ml
Uji 500

40.03200

µg/ml
Kontrol

48.40400

positif
Uji 100 µg/ml

Normal

63.16600

*

6.48740

.000

42.1514

84.1806

Kontrol

-6.20600

6.48740

.977

-27.2206

14.8086

negatif

65

Uji 200

5.97000

6.48740

.982

-15.0446

26.9846

13.04800

6.48740

.490

-7.9666

34.0626

*

6.48740

.032

1.2354

43.2646

*

6.48740

.000

12.8114

54.8406

*

6.48740

.000

21.1834

63.2126

µg/ml
Uji 300
µg/ml
Uji 400

22.25000

µg/ml
Uji 500

33.82600

µg/ml
Kontrol

42.19800

positif
Uji 200 µg/ml

Normal

57.19600

*

6.48740

.000

36.1814

78.2106

Kontrol

-12.17600

6.48740

.576

-33.1906

8.8386

-5.97000

6.48740

.982

-26.9846

15.0446

7.07800

6.48740

.954

-13.9366

28.0926

16.28000

6.48740

.228

-4.7346

37.2946

*

6.48740

.003

6.8414

48.8706

*

6.48740

.000

15.2134

57.2426

negatif
Uji 100
µg/ml
Uji 300
µg/ml
Uji 400
µg/ml
Uji 500

27.85600

µg/ml
Kontrol

36.22800

positif
Uji 300 µg/ml

Normal

50.11800

*

6.48740

.000

29.1034

71.1326

Kontrol

-19.25400

6.48740

.092

-40.2686

1.7606

-13.04800

6.48740

.490

-34.0626

7.9666

-7.07800

6.48740

.954

-28.0926

13.9366

9.20200

6.48740

.842

-11.8126

30.2166

20.77800

6.48740

.054

-.2366

41.7926

*

6.48740

.002

8.1354

50.1646

*

6.48740

.000

19.9014

61.9306

*

6.48740

.003

-49.4706

-7.4414

negatif
Uji 100
µg/ml
Uji 200
µg/ml
Uji 400
µg/ml
Uji 500
µg/ml
Kontrol

29.15000

positif
Uji 400 µg/ml

Normal
Kontrol

40.91600

-28.45600

negatif

66

-22.25000

*

6.48740

.032

-43.2646

-1.2354

-16.28000

6.48740

.228

-37.2946

4.7346

-9.20200

6.48740

.842

-30.2166

11.8126

11.57600

6.48740

.634

-9.4386

32.5906

19.94800

6.48740

.073

-1.0666

40.9626

*

6.48740

.002

8.3254

50.3546

*

6.48740

.000

-61.0466

-19.0174

*

6.48740

.000

-54.8406

-12.8114

-27.85600

*

6.48740

.003

-48.8706

-6.8414

-20.77800

6.48740

.054

-41.7926

.2366

-11.57600

6.48740

.634

-32.5906

9.4386

8.37200

6.48740

.896

-12.6426

29.3866

Normal

20.96800

6.48740

.051

-.0466

41.9826

Kontrol

*

6.48740

.000

-69.4186

-27.3894

*

6.48740

.000

-63.2126

-21.1834

*

6.48740

.000

-57.2426

-15.2134

-29.15000

*

6.48740

.002

-50.1646

-8.1354

-19.94800

6.48740

.073

-40.9626

1.0666

-8.37200

6.48740

.896

-29.3866

12.6426

Uji 100
µg/ml
Uji 200
µg/ml
Uji 300
µg/ml
Uji 500
µg/ml
Kontrol
positif
Uji 500 µg/ml

Normal
Kontrol

29.34000

-40.03200

negatif
Uji 100

-33.82600

µg/ml
Uji 200
µg/ml
Uji 300
µg/ml
Uji 400
µg/ml
Kontrol
positif
Kontrol positif

-48.40400

negatif
Uji 100

-42.19800

µg/ml
Uji 200

-36.22800

µg/ml
Uji 300
µg/ml
Uji 400
µg/ml
Uji 500
µg/ml
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

67

% Degranulasi
a

Tukey HSD
Perlakuan

Subset for alpha = 0.05
N

1

2

3

4

5

Normal

5

.0000

Kontrol positif

5

20.9680

Uji 500 µg/ml

5

29.3400

29.3400

Uji 400 µg/ml

5

40.9160

40.9160

40.9160

Uji 300 µg/ml

5

50.1180

50.1180

50.1180

Uji 200 µg/ml

5

57.1960

57.1960

Uji 100 µg/ml

5

63.1660

Kontrol negatif

5

69.3720

Sig.

20.9680

.051

.073

Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000.

68

.054

.228

.092

DAFTAR PUSTAKA
Agoes, A. H., (2010). Tanaman Obat Indonesia. Buku 2. Jakarta: Penerbit
Salemba Medika. Halaman 71.
Alvianti, F., Mukhtar, R., dan Marianne., (2012). Penghambatan Degranulasi
Mastosit Tersensitisasi Aktif oleh Curcuma Mangga Val. & Zijp Pada
Mencit Secara In Vitro. Journal of Pharmaceutics and Pharmacology.
Medan: Jurusan Farmasi. Universitas Sumatera Utara.1 (1): 44-54.
Baratawidjaja, G.K., (1996). Imunologi Dasar. Edisi III. Jakarta: Gaya Baru.
Halaman 16-17.
Campbell, Reece dan Mitchell, L., (2000).Biologi. Edisi Kelima. Jilid 1. Jakarta:
Penerbit Erlangga. Halaman 77,78,85.
Choudary, G.P., (2010). In Vitro Mast Cell Stabilization Activity of Onosma
Bracteatum Wall.J. Pharm. & Bio Sci. 6(2):54-60.
Ditjen POM., (1979). Farmakope Indonesia. Edisi III. Jakarta: Departemen
Kesehatan RI. Halaman 33.
Depkes RI., (1999). Inventaris Tanaman Obat Indonesia.Jilid V. Jakarta:
Departemen Kesehatan RI dan Kesejahteraan Sosial RI Badan Penelitian
dan Pengembangan Kesehatan. Halaman 147.
Depkes RI., (1995). Materia Medika Indonesia. Jilid VI. Jakarta : Depkes RI.
Halaman. 321,325,333-334,336.
Depkes RI., (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta:
Departemen Kesehatan RI. Halaman 1-11.
Dowd. John, A. Marotti. Nedle danYogiela., (2011). Pharmacology and
Therapeutic for Dentistry.Sixth Edition.Mosty Elsevier.Halaman 329, 359,
361.
Dyah, N dan Firman., (2007). Mahkota Dewa dan Manfaatnya. Bekasi: Ganeca
Exact. Halaman.5-7.
Farnsworth, N.R. (1966). Biologycal and Phytochemical Screening of
Plants.Journal of Pharmaceutical Sciense.55:264.
Gunawan, G.S., (2007). Farmakologi dan Terapi.Edisi V. Jakarta: Gaya Baru.
Halaman 255.
Guyton, A.C.dan Hall., (2008). Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Editor dan
Penerjemah: Irawati Setiawan, I,MA Ken Ariata Tengadi dan Alex
Santoso, Edisi ke-9.Jakarta:EGC. Halaman 57-60.

41

Handayani, D., Aldi, Y., dan Zumiati. (2008). Uji Aktivitas Penghambatan
Degranulasi Mastosit yang Tersensitisasi terhadap Ekstrak Metanol Spon
Laut ( Acathodendrilla SP.). Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi. Padang:
Jurusan Farmasi FMIPA Universitas Andalas Padang. 13(1): 43-48.
Hariana, A. H., (2009). Tumbuhan Obat dan Khasiatnya. Seri kedua, Jakarta:
Penerbit Penebar Swadaya. Halaman 109.
Harr. Robert. R., (2002).Resensi Ilmu Laboratorium Klinis. Jakarta: Penerbit
Buku Kedokteran EGC. Halaman 53.
Hermanto, N., (2004). Mahkota Dewa. Jakarta: Agro Media Pustaka. Halaman 52.
Ibrahim, J., Harun, N.H., Septama, A.W.,Murad, S., dan Mesaik, M.A.,(2010).
Inhibition of Chemiluminescence and Chemotactic Activity of Pagocytes
In-Vitro by The Extracts of Selected Medical Plant. J. Nat. Med. 65(2):
400-405.
Katzung, G., Bertram., (2001). Farmakologi Dasar dan Klinik. Edisi Pertama.
Jakarta: Salemba Medika. Halaman 357;358.
Katzung and Trevors., (2008). Pharmacology.Eighth Edition. America: Mc Graw
Hill Companies. Halaman 168.
Kimura, M., I., dan Kobuko, M. (1978).Inhibition Of Compound 48/80 Mediated
Histamin Release From Isolated Rat Mast Cell By Oosponol Related
Compounds (4-acyl-isocoumarins).Japan. J. Pharmacol. 28(1): 639-673.
Kresno, S. B. (2010). Imunologi,Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Edisi V.
Jakarta: Balai Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
Halaman 162,163.
Louis, K.S., dan Siegel, A.C. (2011). Cell Viability Analysis Using Trypan Blue:
Manual and Automated Methods. Mamalia Cell Viability: Methode in
Molecular Biology.740; 7-10.
Muttaqin.A., (2008).Buku Ajar Asuhan Keperawatan dengan Gangguan Sistem
Pernapasan.Jakarta: Penerbit Salemba Medika. Halaman 172,173.
Nahak, M. M., (2013). Shock Anafilaksis Akiba Anastesi Lokal Menggunakan
Lidocaine. Jurnal Kesehatan Gigi. Denpasar.1(2):106-108.
Rifa’i, M., (2010). Autoimun dan Bioregulator. Malang: Universitas Brawijaya.
UB Press. Halaman 1-2.

42

Rohyami, Y., (2008). Penentuan Kandungan Flavanoid dari Ekstrak Metanol
Daging Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa Scheff Boerl.
Program DIII, Kimia Analisis, UII, Yogyakarta: Jurusan FMIPA. 5(1):1-8.
Sari, K, L.O.R., (2006).Pemanfaatan Obat Tradisional dengan Pertimbangan
Manfaat dan Keamanannya.Majalah Ilmu Farmasi, 3(1):1-2.
Sukandar, E.Y. (2006). Trend dan Paradigma Dunia Farmasi, Industri Klinik
Teknologi Kesehatan, Disampaikan Dalam Orasi Ilmiah Dies Natalis ITB.
http//ac.id./focus/focus_file/orasi-ilmiah-dies-45.pdf.
Tambayong, J., (2000). Patofisiologi Keperawatan. Jakarta: Pernerbit EGC.
Halaman 52.
Tan, H.T., dan Rahardja, K., (2007). Obat-Obat Penting. Edisi ke-4. Jakarta: Elex
Media Komputindo. Halaman 813.
Wahab, A., Samik dan Julia, Madarina., (2002). Sistem Imun, Imunisasi, dan
Penyakit Imun. Jakarta: Widya Medika. Halaman 67;69;75;79;84.
WHO.,

(1998). Quality Control Methods for
Material.Switzerland: Geneva press. Halaman 31-33.

Medicinal

Plant

Vogel, H. G., (2008). Methods for Testing Immunological Factors.Editor: Hans
Gerhard Vogel. Dalam: Drug Discovery and Evaluation Pharmacological
Essays,Edisi ke-3. Jilid2. Berlin Springer.Halaman 1143.
Yurt, R.W., Leid, R.W., dan Austen, K.F. (1977). Native Heparin From Rat
Peritonial Mast Cells. The Journal of Biological Chemistry. U.S.A.252(2):
518-521.

43

BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara eksperimental parametrik meliputi
pengumpulan bahan, pengolahan bahan, pembuatan ekstrak etanol daun mahkota
dewa, penyiapan hewan percobaan (mencit), dan pengujian penghambatan
degranulasi mastosit pada hewan percobaan secara in-vitro dengan menggunakan
alat Improved neubauer hemocytometer. Data hasil penelitian dianalisis secara
ANAVA dua arah (two way anava) dan dilanjutkan dengan uji bedaTukey HSD
menggunakan program SPSS (Statistical and Product Service Solution) versi 18.

3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat - alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas
laboratorium, perkolator, blender, rotary evaporator, seperangkat alat destilasi
penetapan kadar air, kertas saring, spot plat, penjepit tabung, spatula, kertas
perkamen, lumpang dan stamper,aluminium foil, seperangkat alat bedah, spuit 1
ml dan spuit 10 ml, kandang mencit, neraca listrik, mikroskop (Boeco), neraca
hewan (Presica Geniweigher GW-1500), pipet mikro, alat sentrifuge, waterbath,
microtube, pipet mikro, kamar hitung improved Neubauer hemocytometer
(Marienfeld).
3.1.2 Bahan - bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi daun mahkota
dewa, etanol 96%, putih telur ayam, toluen, akuades, asam klorida 2 N, pereaksi
Mayer (raksa (II) klorida dan kalium iodida), pereaksi Dragendorff (bismuth ,

18

asam nitrat dan kalium iodida), pereaksi Bourchardat (iodium dan kalium iodida),
serbuk Zn, asam klorida pekat, amil alkohol, asam sulfat pekat, pereaksi Molish
( ∝ - naftol dan asam nitrat), pereaksi besi (III) klorida, n-heksana,pereaksi
Liebermann Burchat ( asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat), kloroform,

kloralhidrat, larutan NaCl 0,9%, Aminofilin 24 mg/ml, dimetil sulfoksida
(DMSO), asam asetat glasial, formaldehid 37%, biru toluidin, natrium
klorida,kalim klorida, dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat,
akuabidest, trypan blue 0,4 %,

3.2 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian adalah mencit jantan
dengan berat 20-30 gram sebanyak 5 ekor. Sebelum digunakan sebagai hewan
percobaan, semua mencit dipelihara terlebih dahulu selama dua minggu untuk
penyesuaian lingkungan.

3.3 Penyiapan Tanaman
Penyiapan tanaman meliputi pengumpulan tanaman, identifikasi tanaman
dan pengolahan tanaman.
3.3.1 Pengumpulantanaman
Pengumpulantanaman

dilakukan

secara

purposif

yaitu

tanpa

membandingkan tanaman yang sama dari daerah lain. Sampel yang diambil yaitu
daun mahkota dewa yang masih segar dari Lawe kersik, Kabupaten Aceh
Tenggara.

19

3.3.2 Identifikasi tanaman
Identifikasi tanaman dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani,
Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
3.3.3 Pengolahan tanaman
Daun mahkota dewa yang telah dikumpulkan dibersihkan dari pengotoran,
selanjutnya dicuci dibawah air mengalir beberapa kali hingga bersih, kemudian
ditiriskan lalu disebarkan diatas perkamen sampai merata hingga airnya terserap,
setelah itu ditimbang diperoleh daun sebanyak 2,5 kg, kemudian dikeringkan
dilemari pengering. Setelah sampel kering ditimbang berat keringnya, diperoleh
berat kering sebanyak 1 kg. Kemudian sampel yang sudah kering dihaluskan
sampai menjadi serbuk dengan menggunakan blender, selanjutnya dimasukkan
dalam wadah plastik tertutup, serbuk sebelum dipakai disimpan ditempat kering
terlindung dari cahaya.

3.4 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik
dan mikroskopik, penetapan kadar air, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol,
kadar abu total dan kadar abu tidak larut asam (Depkes, RI., 1995).
3.4.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati morfologi
simplisia daun mahkota dewa dengan cara memperhatikan warna, bentuk, dan
tekstur sampel.

20

3.4.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik terhadap serbuk simplisia daun mahkota dewa
dilakukan dengan cara menaburkan simplisia diatas gelas preparat yang telah
diteteskan dengan larutan kloralhidrat dan ditutup dengan gelas penutup kemudian
dilihat dibawah mikroskop.
3.4.3 Penetapan kadarair
Penetapan kadar air dilakukan menurut metode Azeotropi (destilasi
toluen). Alat terdiri dari labu alas bulat 500 ml, pendingin, tabung penyambung,
tabung penerima 5 ml berskala 0,05 ml, alat penampung dan pemanas listrik.
Cara Kerja :
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu
alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama
2 jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian
volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,05 ml, lalu ke
dalam labu tersebut dimasukkan 5 g serbuk simplisia yang telah ditimbang
seksama, labu dipanaskan hati-hati selama 15 menit. Pada saat toluen mendidih,
setelah itu kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar
air terdestilasi, kemudian kecepatan destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik.
Saat semua air terdestilasi, setelah itu dibilas bagian dalam pendingin dengan
toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit, kemudian tabung penerima dibiarkan
mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluen memisah sempurna, volume
air dibaca dengan ketelitian 0,05 ml. Selisih kedua volume air yang dibaca sesuai
dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air
dihitung dalam persen (WHO., 1998).

21

3.4.4 Penetapan kadarsari larut air
Sebanyak 5 g serbuk yang telah dikeringkan, dimaserasi selama 24 jam
dalam 100 ml air-kloroform (2,5 ml kloroform dalam air suling 1000 ml) dalam
labu bersumbat sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama, dibiarkan selama
18 jam, kemudian disaring. Diuapkan 20 ml filtrat sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan
pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Hitung kadar dalam persen sari yang larut
dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (Depkes,
RI.,1995).
3.4.5 Penetapan kadarsari larut etanol
Sebanyak 5 g serbuk simplisia yang telah dikeringkan dimasersi selama 24
jam dalam 100 ml etanol 96% dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali
selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring, 20
ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah
ditara dan sisanya dipanaskan pada suhu 105oC sampai bobot tetap. Kadar sari
larut dalam etanol dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara
(Depkes, RI., 1995).
3.4.6 Penetapan kadarabu total
Sebanyak 2g serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam
krus platina atau krus silikat yang telah dipijar dan ditara, kemudian diratakan.
Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pemijaran dilakukan pada suhu
600oC selama 3 jam. Kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh
bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara
(Depkes, RI., 1995).

22

3.4.7 Penetapan kadarabu tidak larut asam
Abu yang telah diperoleh dalam penetapan abu didinginkan dengan 25 ml
asam klorida encerselama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
dikumpulkan, disaring dengan kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas,
dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu
yang tidak larut asam dihitung terhadap bobot yang dikeringkan diudara (Depkes,
RI., 1995).

3.5 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia serbuk simplisia daun mahkota dewa meliputi :
pemeriksaan senyawa golongan alkaloid, flavanoid, glikosida, tanin, saponin dan
steroid/triterpenoid.
3.5.1 Pemeriksaan alkaloid
Serbuk simplisia daun mahkota dewa ditimbang sebanyak 0,5 g kemudian
ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas
penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh
dipakai untuk uji alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan
0,5 ml filtrat.
Pada masing-masing tabung reaksi:
a. Tabung 1 ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer
b. Tabung 2 ditambahkan 2 tetes pereaksi Bauchardat
c. Tabung 3 ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff
Akaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhan pada paling sedikit
dua dari tiga percobaan diatas (Depkes, RI., 1995).

23

3.5.2 Pemeriksaan flavonoid
Sebanyak 10 g serbuk simplisia daun mahkota dewa ditambahkan 100 ml
air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Filtrat
yang diperoleh kemudian diambil 5 ml lalu ditambahkan 0,1 g serbuk Mg dan

1

ml HCL pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok, dan dibiarkan memisah. Flavonoid
positif

jika

terjadi

warna

merah,

kuning,

jingga

pada

lapisan

amil

alkohol(Farnsworth, 1966).
3.5.3 Pemeriksaan glikosida
Serbuk simplisia daun mahkota dewa ditimbang sebanyak 3 g, lalu disari
dengan 30 ml campuran etanol 95 % dengan air (7:3) dan 10 ml asam klorida 2 N,
direfluks selama 2 jam, didinginkan dan disaring. Diambil 20 ml filtrat
ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal (II) asetat 0,4 M, dikocok,
didiamkan 5 menit lalu disaring. Filtrat disari sebanyak 3 kali, tiap kali dengan 20
ml campuran isopropanol dan kloroform (2:3). Pada kumpulan sari tambahkan
natrium sulfat anhidrat, disaring dan uapkan pada suhu 500C. Sisanya dilarutkan
dalam 2 ml metanol. Larutan ini digunakan untuk percobaan berikut : 0,1 ml
larutan percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi dan diuapkan di atas penangas
air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes pereaksi Molish. Kemudian secara
perlahan-lahan ditambahkan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung,
terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas kedua cairan menunjukkan ikatan
gula (Depkes, RI., 1995).
3.5.4 Pemeriksaan tanin
Sebanyak 0,5 g sampel disari dengan 10 ml air suling, disaring lalu
filtratnya diencerkan dengan air suling sampai tidak berwarna. Diambil 2 ml

24

larutan lalu ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi besi (III) klorida. Terjadi
warna biru atau hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin (Farnsworth, 1966).
3.5.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia daun mahkota dewa dimasukkan ke dalam
tabung reaksi ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan kemudian dikocok
selama 10 detik. Jika terbentuk buih yang mantap setinggi 1-10 cm yang stabil
tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan satu tetes asam
klorida 2 N menunjukkan adanya saponin (Depkes, RI., 1995).
3.5.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia daun mahkota dewa dimaserasi dengan 20
ml eter selama 2 jam, disaring, setelah itu filtrat yang diperoleh diuapkan dengan
menggunakan cawan penguap dan pada sisanya ditambahkan 2 tetes pereaksi
Lieberman-Bourchard. Apabila terbentuk warna ungu atau merah yang berubah
menjadi biru atau hijau menunjukkan adanya steroid/triterpenoid yang terkandung
di dalam simplisia atau ekstrak (Farnsworth, 1966).

3.6 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Mahkota Dewa (EEDMD)
Pembuatan ekstrak etanol daun mahkota dewa dilakukan secara perkolasi
menggunakan etanol 96%
Cara Kerja : Sebanyak 300 g serbuk simplisia dibasahi dengan etanol 96%
dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan kedalam alat perkolator, lalu
dituang cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dan dibiarkan
selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir
dengan kecepatan perkolat diatur 1 ml/ menit, perkolat ditampung. Perkolasi

25

dihentikan bila 500 mg perkolat terakhir diuapkan tidak lagi meninggalkan sisa.
Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat rotary evaporator pada
suhu kurang lebih 60oC sampai diperoleh ekstrak kental (Ditjen POM., 1979).

3.7 Uji Aktivitas Penghambatan Degranulasi Mastosit
Uji aktivitas penghambatan degranulasi mastosit meliputi penyiapan
sediaan, penyiapan hewan percobaan dan uji degranulasi mastosit tersensitisasi
aktif.
3.7.1 Penyiapan sediaan
Penyiapan sediaan meliputi penyiapan larutan putih telur ayam 50%,
penyiapan larutan phosphate buffered saline (PBS), penyiapan larutan trypan
blue 0,4%,penyiapan larutan uji, penyiapan larutan Aminofilin konsentrasi 100
µg/ml,penyiapan larutan biru toluidindanekstrak etanol daun mahkota dewa
(EEDMD) dengan berbagai konsentrasi.
3.7.1.1Pembuatanlarutan putih telur ayam 50%
Sebanyak 5 ml putih telur ayam ditambahkan dalam 5 ml salin fisiologis,
kemudian dilakukan pengenceran dengan mengambil 5 ml larutan diatas lalu
dicukupkan volumenya hingga 10 ml dengan larutan salin fisiologis sehingga
diperoleh larutan induk, kemudian diambil 5 ml larutan induk dan dicukupkan
volumenya hingga 10 ml dengan larutan salin fisiologis sehingga diperoleh
konsentrasi 50%.
3.7.1.2 Pembuatan larutan phosphate buffered saline (PBS)
Phosphate Buffered Saline (PBS) adalah larutan penyangga yang umum
digunakan dalam penelitian. Pembuatan PBS dilakukan dengan cara : sebanyak 8

26

gram NaCl, 0,2 gram KCL, 1,44 gram Na2HPO4, 0,24 gram KH2PO4, dilarutkan
dalam 800 ml akuabidest, kemudian dicek pH ± 7 dan dapat disesuaikan dengan
penambahan HCL atau NaOH, tambahkan akuabidest hingga 1 L(Sambrook dan
Maniatis, 1989).
3.7.1.3 Pembuatan larutan trypan blue 0,4 %
Sebanyak 200 mg serbuk trypan blue dilarutkan dalam 50 ml larutan PBS
dengan pH ± 7 dan dikocok hingga larut.
3.7.1.4Pembuatan larutan uji
Sebanyak 1 g ekstrak etanol daun mahkota dewa dilarutkan dalam 10 ml
larutan DMSO 1% sehingga didapatkan konsentrasi 100 mg/ml, kemudian
dilakukan pengenceran dengan mengambil 1 ml larutan ekstrak etanol daun
mahkota dewa konsentrasi 100 mg/ml diatas lalu ditambahkan dengan larutan
DMSO 1 % hingga 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10000 µg/ml, kemudian
diambil 1 ml larutan ekstrak etanol daun mahkota dewa konsentrasi 10000 µg/ml
diatas dan tambahkan dengan larutan DMSO 1% hingga volume 10 ml sehingga
diperoleh konsentrasi 1000 µg/ml, lalu diambil 5 ml larutan ekstrak etanol daun
mahkota dewa konsentrasi 1000 µg/ml ditambahkan dengan larutan DMSO 1 %
hingga 10 ml sehingga diperoleh konsentrasi 500 µg/ml, demikian seterusnya
sampai diperoleh konsentrasi 400 µg/ml, 300 µg/ml, 200 µg/ml dan 100 µg/ml.
3.7.1.5 Pembuatan larutan Aminofilin konsentrasi 100 µg/ml
Sebanyak 21µl Aminofilin dengan dosis 24 mg/ml dipipet dengan
menggunakan mikro pipet dan dimasukkan kedalam labu tentukur, kemudian
dilakukan pengenceran dengan penambahan larutan dimetil sulfoksida (DMSO)

27

1%

hingga

5

ml

sehingga

diperoleh

konsentrasi

100

µg/ml

(Handayani,dkk.,2008).
3.7.1.6 Pembuatan larutan biru toluidin
Sebanyak 39 ml larutan NaCl fisiologis 0,9% dicampur dengan 1 ml asam
asetat glasial, 10 ml formaldehid 37% (v/v) dan 50 ml etanol 95% (v/v), kemudian
campuran dikocok dan ditambahkan biru toluidin sebanyak 100 mg dan dikocok
lagi hingga larut (Handayani,dkk., 2008).
3.7.2 Penyiapan hewan percobaan
Hewan yang digunakan adalah mencit jantan sehat dengan berat berkisar 2030 gsebanyak 5 ekor yang dapat perlakuan yang sama. Tiap 1 ekor mencit diambil
cairan intraperitonealnya dan dibagi atas 8 kelompok:
Kelompok 1 (Normal): suspensi mastosit yang tidak diberi penambahan larutan
antigen (putih telur ayam) maupun EEDMD dan Aminofilin.
Kelompok 2 (Kontrol Positif): suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen
putih telur ayam 50% dan Aminofilin 100 µg/ml.
Kelompok 3 (Kontrol Negatif): suspensi mastosit yang diberikan larutan antigen
putih telur ayam 50% dan DMSO 1% tetapi tidak diberikan EEDMD ataupun
Aminofilin.
Kelompok 4 (Uji 1): suspensi yang diberikan larutan antigen putih telur ayam
50% dan EEDMD 100 µg/ml.
Kelompok 5 (Uji 2): suspensi yang diberikan larutan antigen putih telur ayam
50% dan EEDMD 200 µg/ml.
Kelompok 6 (Uji 3): suspensi yang diberikan larutan antigen putih telur ayam
50% dan EEDMD 300 µg/ml.

28

Kelompok 7 (Uji 4): suspensi yang diberikan larutan antigen putih telur ayam
50% dan EEDMD 400 µg/ml.
Kelompok 8 (Uji 5): suspensi yang diberikan larutan antigen putih telur ayam
50% dan EEDMD 500 µg/ml.
3.7.2.1 Pembuatan suspensi mastosit tersensitisasi
Mencit sehat dengan berat badan 20-30 g disensitisasi oleh antigen putih
telur ayam dengan metode seperti yang dijelaskan oleh (Choudary, 2010). Mencit
disuntik secara intraperitoneal dengan 0,3 ml antigen putih telur ayam 50 %, pada
hari ke-1. Pada hari ke-3 dan hari ke-5 diulangi lagi penyuntikan antigen putih
telur ayam 50 % sebanyak 0,05 ml secara intraplantar. Pada hari ke-10 setelah
penyuntikan pertama dilakukan isolasi mastosit dari cairan intraperitonial (Yurt, et
al, 1977; Vogel, 2008), mencit dipuasakan selama 18 jam, kemudian mencit yang
telah dipuasakan langsung dikorbankan dengan cara dislokasi leher dan segera
disuntikkan dengan 10 ml larutan PBS yang telah ditambah dengan gelatin 0,1 %
dan heparin 50 µg/ml secara intraperitonial, lalu bagian perut dipijat secara
perlahan-lahan selama 10 menit, dibedah secara hati-hati dan diambil cairan
peritonial sebanyak mungkin, masukkan kedalam tabung sentrifuge dan sentrifuge
selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm, bagian supernatan dibuang dan
endapan dicuci dua kali dengan larutan PBS sama banyak, kemudian endapan
diambil dan dicukupkan volume hingga 2 ml dengan larutan PBS dan siap untuk
pengujian (Alvianti, 2012).

29

3.7.3 Pengujian Mastosit
3.7.3.1 Uji ketahanan sel (cell viability test)
Uji ketahanan sel dilakukan untuk melihat sel uji yang tetap utuh dengan
penambahan larutan uji dosis maksimal dan diinkubasi selama beberapa jam.
Pengujian ini menggunakan metode pewarnaan oleh trypan blue.
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit yang telah diisolasi dari peritonial mencit
dengan jumlah sel permililiternya 1 x 106 dimasukkan kedalam tabung reaksi.
Kemudian ditambahkan 50 µl larutan uji EEDMD 500 µg/ml dan ditepuk-tepuk
secara perlahan sampai homogen. Inkubasi pada suhu 370C selama 1 jam. Diambil
100 µl larutan tersebut kemudian ditambahkan 100 µl larutan trypan blue 0,4 %
dan ditepuk-tepuk secara perlahan sampai homogen. Teteskan larutan di atas
hemositometer dan hitung sel yang berwarna biru dibawah mikroskop 10 x 40.
Persen ketahanan sel dihitung dengan rumus sebagai berikut :
% sel yang utuh = 1,00 −

�����ℎ ��� ���� �������������� (����)
�����ℎ ����� ���

3.7.3.2 Uji degranulasi mastosit tersensitisasi aktif

� 100%

Sebanyak 5 ekor mencit yang diambil cairan intraperitonealnya mendapat
perlakuan yang sama sebagai berikut:
a.

Penghitungan jumlah mastosit tersensitisasi (kelompok normal).
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 40 µl PBS, 10 µl biru
toluidin.

b.

Penghitungan jumlah mastosit yang tidak terdegranulasi oleh DMSO 1%
(kelompok kontrol negatif ).
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl DMSO 1%, 10
antigen putih telur ayam 50% dan 10 µl biru toluidin.

30

c.

Pengujian aktivitas penghambatan degranulasi mastosit oleh Aminofilin 100
µg/ml.
Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl Aminofilin 100
µg/ml, 10 antigen putih telur ayam 50% dan 10 µl biru toluidin.

d.

Pengujian aktivitas penghambatan degranulasi mastositoleh ekstrak etanol
daun mahkota dewa (kelompok uji) dengan konsentrasi sebagai berikut :
i.

Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDMD 100
µl/ml, 10 antigen putih telur ayam 50% dan 10 µl biru toluidin.

ii.

Sebanyak 50 µl suspensimastosit ditambahkan 30 µl EEDMD 200
µl/ml, 10 antigen putih telur ayam 50% dan 10 µl biru toluidin.

iii.

Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDMD 300
µl/ml, 10 antigen putih telur ayam 50% dan 10 µl biru toluidin.

iv.

Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µPl EEDMD
400 µl/ml, 10 antigen putih telur ayam 50% dan 10 µl biru toluidin.

v.

Sebanyak 50 µl suspensi mastosit ditambahkan 30 µl EEDMD 500
µl/ml, 10 antigen putih telur ayam 50% dan 10 µl biru toluidin.

Tiap campuran yang diperoleh dari tiap kelompok ditepuk-tepuk secara
perlahan sampai campuran homogen, kemudian diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 37oC. Kemudian campuran ditetesi diatas hemositometer dan dihitung
jumlah mastosit dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 40, mastosit yang
tidak terdegranulasi akan tampak berwarna biru keunguan karena adanya pewarna
oleh larutan biru toluidin (Handayani, dkk., 2008).

31

3.7.3.3 Penghitungan persen jumlah mastosit terdegranulasi
Efek penghambatan degranulasi mastosit oleh ekstrak etanol daun mahkota
dewa ditentukan dengan menghitung jumlah mastosit yang tidak terdegranulasi
menggunakan alat hemositometer. Kemudian dari jumlah mastosit yang didapat ,
dihitung persentase degranulasi mastosit dengan cara sebagai berikut (Handayani,
dkk., 2008).
% Degranulasi =

�−�
� 100 %
�

Dimana :
P = Jumlah mastosit sebelum perlakuan
S = Jumlah mastosit setelah perlakuan

3.8 Analisis Data
Data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan program SPSS 18
untuk menentukan homogenitas dan normalitasnya dengan uji ANAVA satu arah
dan untuk mengetahui perbedaan rata-rata diantara perlakuan. Jika terdapat
perbedaan, dilanjutkan dengan menggunaknan uji Tukey HSD untuk mengetahui
variabel mana yang memiliki perbedaan. Berdasarkan nilai signifikansi (p 90,0%) setelah diinkubasi selama 1 jam
(Ibrahim, et al., 2010).
Pada uji pendahuluan digunakan dengan metode tradisional dengan
menggunakan pewarnaan trypan blue.Trypan blue adalah pewarnaan yang
tertinggal pada sel yang mati dengan warna biru yang khas ketika dilihat dibawah
mikroskop, sedangkan sel yang sehat tidak menunjukkan warna.Sel yang sehat
memiliki membran yang utuh karena tidak menyerap medium disekitarnya, tetapi
pada sel yang tidak sehat tidak mempunyai membran yang utuh dan dapat
menyerap medium disekitarnya (Louis, 2011).
Uji degranulasi sel mastosit dilakukan secara invitro, sel mastosit yang
telah tersensitisasi oleh antigen diisolasi dari hewan yang telah menunjukkan

36

reaksi anafilaksis yang sebelumnya telah diinduksi oleh antigen putih telur ayam
pada konsentrasi 50%.
Bentuk sel mastosit normal dibawah mikroskop terlihat warna ungu dan
bagian tengahnya bergranul.Sel mastosit yang telah terdegranulasi tidak terlihat
lagi karena telah hancur dan tidak mengikat lagi.Semakin banyak sel yang
terdegranulasi maka semakin sedikit sel yang terlihat.
Data yang diperoleh dari hasil pengujian degranulasi mastosit dinyatakan
dalam bentuk persen degranulasi, yaitu perbandingan jumlah sel sebelum
perlakuan dikurangi jumlah sel sesudah perlakuan. Persentase degranulasi
mastosit dihitung dengan cara sebagai berikut :

Dimana :

% ����������� =

�−�
� 100 %
�

P = jumlah sel mastosit sebelum perlakuan
S = jumlah sel mastosit setelah perlakuan
Dalam pengujian penghambatan degranulasi mastosit oleh ekstrak daun
mahkota dewa, dilakukan terlebih dahulu uji pendahuluan dengan tujuan untuk
mengetahui konsentrasi terkecil dan konsentrasi terbesar yang dapat menghambat
degranulasi. Dari hasil pendahuluan tersebut diperoleh konsentrasi terkecil 100
µg/ml dan konsentrasi terbesar adalah 500 µg/ml, Diperoleh konsentrasi
pengujian tersebut yaitu 100 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml, 400 µg/ml, 500 µg/ml.
Hasil pengujian degranulasi sel mastosit dengan variasi 5 konsentrasi dapat dilihat
pada Lampiran 4.
Untuk mengetahui kemampuan efek penghambatan degranulasi mastosit
oleh

ekstrak

daun

mahkota

dewa

37

sebagai

pembanding

dipilih

aminofilin.Pemilihan ini didasarkan kepada senyawa yang telah diketahui
mekanismenya dalam menghambat degranulasi mastosit dan mudah didapat.
Berdasarkan penelitian dilakukan oleh Handayani, dkk., (2008), efek maksimal
yang memberikan efek yaitu 100 µg/ml.
Proses penghambatan degranulasi sel mastosit secara in-vitrosecara teoritis
dapat dilakukan dengan menghambat masuknya ion Ca, seperti senyawa kromolin
atau menghambat kerja enzim fosfodiesterase sehingga kadar cAMP tinggi. Hal
ini akan mengakibatkan pendorongan granul-granul ke pinggir tidak berlangsung
sehingga sel mastosit menjadi stabil. Senyawa yang dapat mempertahankan kadar
cAMP didalam sel mastosit adalah Aminofilin dan kortikosteroid (Katzung,
2001).
Grafik persen degranulasi mastosit sebagai respon penghambatan

Jumlah Mastosit Terdegranulasi (%)

degranulasi mastosit yang tersensitisasi aktif dapat dilihat Gambar 4.1.
80
70

Antigen putih telur ayam 50 %

60

EEDMD 100 µg/ml

50
EEDMD 200 µg/ml

40

EEDMD 300 µg/ml

30
20

EEDMD 400 µg/ml

10

EEDMD 500 µg/ml

0

Aminofilin 100 µg/ml
Perlakuan

Gambar 4.1 Grafik persen degranulasi mastosit

Berdasarkan Gambar 4.1 tampak bahwa EEDMD dosis 100, 200, 300, 400
dan 500 µg/ml dan aminofilin dosis 100 µg/ml menunjukkan persen, degranulasi

38

yang lebih kecil dan jauh berbeda dengan antigen putih telur ayam 50% sebagai
kontrol negatif yang tidak diberi apapun, kemampuan Aminofilin dosis 100 µg/ml
dalam menghambat degranulasi mastosit dengan persen 32,28% lebih besar
dibandingkan EEDMD dosis 500 µg/ml dengan persen degranulasi mastosit
39,39%. Ekstrak etanol daun mahkota dewa dosis 500 µg/ml dengan persen
degranulasi mastosit 39,39% menunjukkan persen degranulasi mastosit yang lebih
kecil dibandingkan dengan EEDMD dosis 400 µg/ml (45,58%), 300 µg/ml
(51,02%), 200 µg/ml (54,59%), 100 µg/ml (56,51%). Hal ini menunjukkan bahwa
adanya hubungan antara peningkatan dosis dengan persen degranulasi mastosit
yaitu semakin besar peningkatan dosis maka mastosit yang terdegranulasi semakin
sedikit.
Analisis variasi (ANAVA) digunakan untuk melihat ada tidaknya perbedaan
dari setiap perlakuan pada tiap kelompok hewan coba dengan menggunakan
program SPSS terhadap persen gegranulasi mastosit. Hasil analisis yang didapat
pada variasi diperoleh harga (F=26,197, P= 0,000).
Analisis dilanjutkan dengan melakukan uji Post Hoc Tukey dimana untuk
mengetahui kelompok perlakuan mana yang memiliki efek yang sama atau
berbeda antara satu perlakuan dengan perlakuan yang lain dapat dilihat pada
(Lampiran. 14). Uji Post Hoc Tukey menunjukkan perbedaan yang signifikan dari
masing-masing kelompok uji dengan signifikansi p < 0,05 dalam menghambat
degranulasi mastosit.

39

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpilkan bahwa:
a. Hasil karakteristik serbuk simplisia daun mahkota dewa pada penetapan
kadar air yaitu 6,92%, penetapan kadar sari larut dalam air yaitu 25,05%,
penetapan kadar sari larut dalam etanol yaitu 54,77%, penetapan kadar abu
total yaitu 7,29%, penetapan kadar abu tidak larut dalam asam yaitu
0,32%.
b. Efek penghambatan degranulasi mastosit ekstrak etanol daun mahkota
dewa pada konsentrasi 400 µg/ml, 500 µg/ml dan Aminofilin 100 µg/ml
dapat menghambat degranulasi mastosit tersensitisasi aktif secara invitroterhadap control negatif (P