METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Agustus 2009 – Juni 2010, di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium Umum, Departemen Agronomi
dan Hortikultura, Fakultas Pertanian – IPB, Dramaga, Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan tanaman yang digunakan adalah benih jarak pagar genotipe IP-1P. Bahan eksplan yang digunakan berupa kotiledon dan hipokotil yang telah
ditanam dalam kondisi in vitro, stek tunas dan daun tanaman jarak pagar dewasa hasil stek. Media yang digunakan adalah media MS Murashige dan Skoog
1962. Zat pengatur tumbuh meliputi 1-napthalene acetic acid NAA, indole acetic acid IAA, benzyl amino purin BAP, kinetin, dan picloram. Bahan lain
yang digunakan adalah agar–agar, gula, alkohol 96, bahan kimia komponen media MS, Betadine, aquadest dan spirtus. Bahan untuk sterilisasi tanaman
adalah deterjen, Bayclin sodium hipoklorit, agrept bakterisida, dithane fungisida, dan air steril. Alat yang digunakan diantaranya adalah peralatan
gelas, timbangan analitik, autoklaf, laminar air flow cabinet, peralatan diseksi, mikroskop stereo kamera, dan rak kultur.
Pelaksanaan Penelitian
Pelaksanaan penelitian meliputi beberapa tahap pekerjaan yang saling berkesinambungan : a sterilisasi alat–alat gelas, alat–alat tanam dan aquadest,
b pembuatan larutan stok dan media, dan c sterilisasi sumber eksplan. Percobaan pendahuluan dilakukan untuk sterilisasi, optimasi media dan
penyediaan eksplan.
a. Sterilisasi Alat dan Lingkungan Kerja
Alat tanam pinset, scalpel, cawan petri dan pipet yang sudah dicuci dibungkus dengan kertas. Botol kultur disterilkan dengan autoklaf selama 1 jam
pada suhu 121 C tekanan 17.5 – 20 psi. Pada saat tanam, scalpel, blade dan
pinset juga disterilkan dengan perendaman dalam alkohol 95 dan nyala api lampu spirtus. Permukaan tempat kerja ruang laminar air flow cabinet sebelum
digunakan disterilkan dengan menyemprot alkohol 70 dan dilap dengan kertas tissue.
b. Pembuatan Larutan Stok dan Pembuatan Media
Percobaan ini menggunakan media Murashige dan Skoog 1962. Untuk memudahkan pembuatan media dibuat larutan stok unsur–unsur penyusun
media. Larutan stok digunakan untuk mempermudah kelarutan unsur yang digunakan dan untuk mendapatkan ketelitian yang tinggi. Pembuatan larutan
stok media MS dikelompokkan dalam larutan stok makro, Ca, mikro A, mikro B, Fe, Myoinositol, vitamin dan stok zat pengatur tumbuh Lampiran 1 dan 2.
Pembuatan media dilakukan dengan cara larutan stok dipipet, larutan untuk media dasar terdiri atas larutan stok makro, Ca, mikro A, mikro B, Fe,
vitamin, dan myo-inositol. Larutan stok tersebut dimasukkan ke dalam gelas tabung dan ditambahkan gula sebanyak 30 graml, kemudian ditambahkan
aquades sampai mencapai 1 liter, lalu diaduk secara merata. Selanjutnya larutan media tersebut diukur keasamannya dengan menggunakan kertas pH. Keasaman
larutan media yang direkomendasikan sampai batas 5.8. Apabila belum mencapai pH 5.8, maka diteteskan larutan KOH, sebaliknya apabila di atas pH
5.8 diteteskan larutan HCl 0.1 N. Setelah mencapai pH 5.8, dimasukan agar phytagel dimasukkan sebanyak 2 graml, lalu diaduk secara merata. Tahap
selanjutnya adalah larutan media tersebut direbus sampai mendidih. Selanjutnya dimasukkan ke dalam botol kultur lalu ditutup dengan plastik dan diikat dengan
tali karet. Setiap botol diisi 15-20 ml larutan media. Setelah itu media disterilkan ke dalam autoklaf pada suhu 121
Sterilisasi eksplan yang berasal dari benih jarak dilakukan di luar dan di dalam laminar Lampiran 3. Tahap pertama benih jarak IP-1P Lampiran 4
dipisahkan antara kernel dan kulitnya dengan cara cangkang biji diretakkan dengan tang hingga kulitnya pecah. Kernel dicuci dengan detergen dan dibilas
dengan air mengalir sampai bersih. Setelah itu kernel disterilkan dengan Dithane C tekanan 17.5-20 psi selama 30
menit.
c. Sterilisasi Eksplan
