Desain Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Populasi Penelitian Definisi Operasional Masalah Etika Ethical Clearance dan Persetujuan Setelah Rencana Pengolahan dan Analisis Data

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian

Penelitian ini merupakan studi observasional dengan metode pengumpulan data secarapotong lintang.

3.2. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Departemen Patologi Klinik FK USU RSUP H. Adam Malik Medan bekerjasama dengan Departemen Obstetri dan Ginekologi FK USURSUP H. Adam Malik Medan, mulai bulan Maret - Mei 2013.

3.3. Populasi Penelitian

Populasi terjangkau penelitian ini adalah ibu hamil trimester III yang berkunjung ke Poliklinik Ibu Hamil RSUP H. Adam Malik Medan mulai bulan Maret - Mei 2013.Penelitian dihentikan bila jumlah sampel minimal tercapai atau waktu pengambilan sampel telah mencapai tiga bulan.

3.4. Sampel Penelitian

3.4.1. Cara pengambilan sampel penelitian

Pengambilan sampel dilakukan secara konsekutif terhadap semua populasi terjangkau yang memenuhi kriteria penelitian. Universitas Sumatera Utara

3.4.2. Besar sampel

Digunakan rumus besar sampel untuk uji diagnostik dengan menggunakan rumus uji hipotesis proporsi tunggal. Besar sampel ditentukan dengan rumus: � ≥ �� 1 − � 2 �� 1 − � + � 1 −� �� � 1 − � � � 2 � − � � 2 � : besar sampel � 1 − � 2 : nilai baku normal dari table Z yang besarnya tergantung pada nilaiα yang ditentukan. Untuk α = 0,05 → Zα = 1.96. � 1 −� : nilai baku normal dari table Z yang besarnya tergantung pada nilaiβ yang ditentukan . Untuk α = β = 0,10 → Zβ= 1.282. � : proporsi anemia defisiensi besi pada ibu hamil = 0.40 4 � − � � : beda proporsi yang bermakna , ditetapkan bebas = 0.20 � � : perkiraan proporsi anemia defisiensi besi pada ibu hamil yang diteliti Menurut rumus diatas maka diperlukan sampel minimal sebanyak : 64 sampel. Universitas Sumatera Utara 3.5. Kriteria Penelitian 3.5.1. Kriteria Inklusi 1. Wanita hamil trimester III 2. Pemeriksaan fisik dalam batas normal termasuk suhu, tekanan darah, nadi dan tidak ada tanda-tanda radang 3. Bersedia mengikuti penelitian

3.5.2. Kriteria Eksklusi

1. Inflamasi CRP positif 41 2. Thalasemia 42 3. Anemia defisiensi B12 dan asam folat MCV 100 fL 14 3.6 . Identifikasi Variabel 3.6.1 Variabel Bebas 1. RET-HE

3.6.2 Variabel Terikat

- Defisiensi Besi Feritin 15 μgL 1

3.7. Definisi Operasional

No Variabel Definisi Operasional 1 Defisiensi Besi keadaan yang timbul akibat berkurangnya penyediaan besi untuk eritropoesis, karena cadangan besi kosong yang pada akhirnya mengakibatkan pembentukan Hb berkurang. Defisiensi besi menurut WHO Universitas Sumatera Utara dengan Feritin 15 μgL. 1 2 Wanita Hamil Trimester III wanita hamil dengan usia kandungan 28- 40 minggu. 43 3 RET-HE konten hemoglobin di dalam retikulosit yang memberikan gambaran berapa banyak besi yang tersedia untuk eritropoesis. 44 4 Feritin cadangan besi dalam tubuh akan disimpan dalam bentuk feritin. Konsentrasi feritin dalam serum memiliki korelasi yang kuat dengan total cadangan besi dalam tubuh. 45

3.8. Cara Kerja

3.8.1. Pengambilan Sampel

Penelitian dilakukan di RSUP Haji Adam Malik Medan.Sampel dipilih secara konsekutif dan memenuhi kriteria inklusi.Dilakukan tindakan flebotomi pada vena mediana cubiti.Tempat punksi vena terlebih dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan alkohol 70 dan dibiarkan kering, kemudian dilakukan punksi dengan menggunakan venoject.Pengambilan darah dilakukan tanpa stasis yang berlebihan. Sejumlah 5 mL darah vena Universitas Sumatera Utara diambil dan dibagi ke dalam dua tabung :vacutainer K2EDTA 2 mL dan vacutainer gel clot activator 3 mL. 3.8.2. Pengolahan dan Pemeriksaan Sampel 3.8.2.1. Pemeriksaan Darah Lengkap Sebanyak 2 mL darah dimasukkan kedalam vacutainer K2EDTA dan dihomogenkan perlahan sebanyak 8 kali. Analisa dilakukan menggunakan automatic cell counting Sysmex XT-4000i untuk memperoleh nilai MCV dan MCH dengan pemeriksaan complete blood count CBC. Pemeriksaan CBC terdiri dari kadar hemoglobin Hb, jumlah eritrosit RBC, leukosit WBC, hematokrit HCT, nilai rata-rata eritrosit MCV, MCH, MCHC, RDW, trombosit PLT. Pemeriksaan ini harus selesai dalam waktu 1 jam setelah pengambilan sampel.

3.8.2.2. Pemeriksaan Retikulosit Hemoglobin RET-HE

Pengukuran retikulosit hemoglobin dilakukan pada chamber yang terpisah, alat ini dapat membedakan eritrosit dan retikulosit dengan memberikan pewarnaan polymethine dye fluorochrome yang dapat mengikat RNA sitoplasma pada retikulosit dan memberikan warna sehingga bisa dibedakan dengan eritrosit karena eritrosit tidak mengandung RNA kemudian retikulosit dapat dihitung.Kemudian dengan menggunakan forward scatter didapatlah ukuran rata-rata retikulosit RET-Y. Sistem ini mengukur hemoglobinisasi melalui pembacaan fluorimetric yang dikandung Universitas Sumatera Utara retikulosit dengan menggunakan formula: Ret.He = A x exp B x RET-Y dimana A = 5.8439 and B = 0.0098. 46,47,48

3.8.2.3. Pemeriksaan Feritin

Prinsip pemeriksaan adalah electrochemiluminescence immunoassay ECLIA. Feritin dalam serum akan diinkubasi dengan antibodi biotin monoklonal spesifik feritin, dan antibodi monoklonal spesifik feritin yang dilabel dengan kompleks ruthenium sehingga membentuk kompleks sandwich.Kemudian ditambahkan mikropartikel yang dilapisi streptavidin sehingga terbentuklah komplek berikatan dengan fase solid melalui interaksi biotin dengan streptavidin.Campuran reaksi diaspirasi ke dalam sel pengukur dimana mikropartikel secara magnetik akan ditangkap ke permukaan elektroda. Substansi yang tidak berikatan dibuang melalui procell. Aplikasi tegangan pada elektroda akan menginduksi emisi chemiluminescent yang diukur oleh photomultiplier.Dalam reaksi Electro Chemiluminescent ECL terjadi reaksi antara kompleks ruthenium dengan TPA trypropylamine yang distimulasi secara elektrik untuk menghasilkan emisi cahaya. Jumlah cahaya yang dihasilkan berbanding lurus dengan kadar analit dalam sampel. 45

3.8.2.4. Pemeriksaan Serum Iron SI

Prinsip pemeriksaan serum iron adalah dengan menggunakan metode GuanidineFerroZine. Fe 3+ dilepaskan dari Universitas Sumatera Utara transferin oleh guanidine hydrochloride dan kemudian direduksi oleh askorbat dan hydroxylamine menjadi Fe 2+ . Bentukion besi bivalen membentuk kompleks kelasi berwarna merah dengan ferrozine.Untuk mencegah interferensi copper, ion cupric diikat dengan thiourea. Intensitas warna akan secara langsung sebanding dengan dengan konsentrasi besi yang ditentukan dengan mengukurnya pada absorbansi 552 nm. 49

3.8.2.5. Pemeriksaan Unsaturated Iron Binding Capacity UIBC

Prinsip pemeriksaannya adalah dengan menggunakan metode FerroZine.Sejumlah ion Fe 2+ dimasukkan ke dalam serum pada pH alkali. Ion Fe 2+ akan berikatan dengan transferin yang ada di dalam serum. Ion Fe 2+ yang bebas akan diukur dengan menggunakan reaksi ferrozine. Intensitas warna akan secara langsung sebanding dengan dengan konsentrasi kapasitas ikatan besi yang tidak tersaturasi, yang ditentukan dengan melakukan pengukuran pada absorbansi 552 nm. 50

3.8.2.6. Pemeriksaan Total Iron Binding Capacity TIBC

Total iron binding capacityakan diperoleh berdasarkan penjumlahan dari serum iron dan unsaturated iron binding capacity UIBC. TIBC merupakan pengukuran untuk konsentrasi besi maksimum yang dapat diikat oleh transferin. 50 Universitas Sumatera Utara

3.8.3. Pemantapan Kualitas

Pemantapan mutu dilakukan dilakukan untuk menjamin dan mendapatkan hasil pemeriksaan yang baik. Sebelum diakukan pemeriksan terlebih dahulu dilakukan kalibrasi alat. 3.8.3.1 Kalibrasi Pemeriksaan Laboratorium a. Kalibrasi pemeriksaan feritin dilakukan dengan menggunakan The Elecsys Ferritin Assay dengan Calibrator Lot 165522. Kalibrasi dilakukan setiap pemakaian reagen baru. Tabel 3.1. Hasil kalibrasi Feritin kalibrator ngmL Absorbansi CAL 1 9.73 2464 CAL 2 305 58940 b. Kalibrasi pemeriksaan Serum Iron dilakukan dengan menggunakan Calibrator for Automated Systems CFASdengan Lot 680632 Tabel 3.2. Hasil kalibrasi Serum Iron kalibrator µgdL Absorbansi CFAS 196 704 c. Kalibrasi pemeriksaan UIBC dilakukan dengan menggunakan Calibrator for Automated Systems CFASdengan Lot 680632 Tabel 3.3. Hasil kalibrasi UIBC kalibrator µgdL Absorbansi CFAS 126 3561 Universitas Sumatera Utara

3.8.3.2. Kontrol Kualitas Pemeriksaan Laboratorium

a. Kontrol kualitas darah lengkap dan RET-HE dilakukan dengan menjalankan program kontrol pada Sysmex XT-4000i. Menggunakan bahan kontrol komersial Sysmex e-Check XE assay untuk XT 4000i yang mempunyai nilai target masing-masing yang telah diketahui nilainya, yaitu rendah, normal dan tinggi. Sebelum darah kontrol dianalisa, pastikan file pemantapan kualitas telah disiapkan. Homogenkan darah kontrol dengan baik dan benar, lalu lakukan analisa.Pastikan hasil pemantapan kualitas masuk ke dalam data nilai target.Lakukan analisa darah kontrol untuk ketiga sampel kontrol. Data hasil pemeriksaan akan tersimpan secara otomatis. Dilakukan pemeriksaan setiap hari sebelum sampel diperiksa dan setelah selesai kalibrasi. 51 Tabel 3.4 Hasil Kontrol Hb, MCV dan RET-HE bulan Maret-April 2013 Hb MCV RET-HE L 1 UL 5.9 SD 0.06 UL 79.9 SD 0.66 UL 27.3 SD 0.27 T 5.7 mean 5.7 T 76.1 mean 76.4 T 24.8 mean 23.7 LL 5.5 CV 1.1 LL 72.3 CV 0.9 LL 22.3 CV 1.1 L 2 UL 12.3 SD 0.09 UL 85.9 SD 0.54 UL 27.2 SD 0.33 T 11.9 mean 11.9 T 81.8 mean 82.4 T 24.7 mean 23.7 LL 11.5 CV 0.8 LL 77.7 CV 0.7 LL 22.2 CV 1.4 L 3 UL 16.9 SD 0.13 UL 95.4 SD 0.61 UL 27.8 SD 0.6 T 16.4 mean 16.3 T 90.9 mean 91.7 T 25.3 mean 24 LL 15.9 CV 0.8 LL 86.4 CV 0.7 LL 22.8 CV 2.5 b. Kontrol kualitas untuk feritin dilakukan dengan Elecsys Tumor marker 1 dan 2. Kontrol kualitas dilakukan diawal sebelum melakukan pemeriksaan, setiap pemakaian reagent kit baru dan setelah selesai kalibrasi. Untuk kontrol feritin digunakan Elycsys Universitas Sumatera Utara PreciControl TumorMarker 1 dan Tumor marker 2. Nilai konsentrasi kontrol harus masuk dalam range yang ditetapkan untuk menjamin akurasi assay feritin. 45 Selama penelitian, kontrol kualitas pemeriksaan feritin dilakukan sebanyak 2 kali bersamaan dengan pemeriksaan sampel. Dalam 2 kali pemeriksaan sampel,nilai kontrol Feritin level 1 dan 2 tidak melewati nilai target yang diharapkan tabel 3.5. Tabel 3.5 Hasil Kontrol Feritin TM1 Lot 16588100 dan TM2 Lot 16588000 NO Tgl pemeriksaa n Jumlah Sampel TM 1 target TM 2 target Pemeriksaan Level 1 Pemeriksaan Level 2 1 29-03-2013 30 22.2 226 20.38 258.6 2 30-04-2013 38 22.2 226 20.26 254.9 c. Kontrol kualitas untuk Serum Iron dan UIBC dilakukan dengan PreciControl ClinChem Multi 1, dimana ini lazim dilakukan setiap 24 jam, setiap pemakaian reagent kit baru dan setelah selesai kalibrasi. Nilai konsentrasi kontrol harus masuk dalam batas yang ditetapkan untuk menjamin akurasi kadar Serum Irondan UIBC. 49,50 Selama penelitian, kontrol kualitas pemeriksaan Serum Iron dan UIBC dilakukan sebanyak 2 kali bersamaan dengan pemeriksaan sampel. Dalam 2 kali pemeriksaan sampel,nilai kontrol Serum Iron dan UIBC tidak melewati nilai target yang diharapkan tabel 3.6 dan 3.7. Universitas Sumatera Utara Tabel 3.6 Hasil Kontrol Serum Iron PCCC1 Lot 16663300 No Tanggal Jumlah Sampel Hasil Nilai Target 1 29-03-2013 30 116.04 104-118 2 30-04-2013 38 115.59 104-118 Tabel 3.7 Hasil Kontrol UIBC PCCC1 Lot 16663300 No Tanggal Jumlah Sampel Hasil Nilai Target 1 29-03-2013 30 197.5 182-210 2 30-04-2013 38 203.8 182-210

3.9 Masalah Etika Ethical Clearance dan Persetujuan Setelah

Penjelasan Informed Consent Penelitian dilakukan setelah mendapat persetujuan ethical clearance dari komite Penelitian Bidang Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Medan. Seluruh pasien yang bersedia ikut dalam penelitian ini memberikan informed consent secara tertulis. Dalam memberikan persetujuan tersebut pasien sebelumnya telah diberitahu akan makna, manfaat dan kemungkinan efek samping yang tidak menyenangkan yang mungkin bisa terjadi.

3.10 Rencana Pengolahan dan Analisis Data

Analisa data dilakukan menggunakan software SPSS Statistical Package for Social Sciences, Chicago, IL, USA untuk Windows. Tes baku emas untuk pemeriksaan defisiensi besi adalah pemeriksaan hemosiderin pada sum-sum tulang. Tetapi pada penelitian ini Universitas Sumatera Utara digunakan feritin sebagai pengganti pemeriksaan hemosiderin pada sum- sum tulang, oleh karena pemeriksaan hemosiderin pada sum-sum tulang tidak dapat dilakukan karena tidak ethical. Nilai positive predictive value, negative predictive value, likelihood ratio diperoleh menggunakan tabel 2x2, dengan kadar feritin Feritin 15 μgLsebagai tes baku emas WHO. 8 Untuk menilai kemampuan diagnostik RET-HE digunakan kurva receiver operating characteristic ROC sehingga diperoleh sensitivitas, spesifisitas, serta area under the curve AUC. Tes yang sempurna adalah yang memiliki sensitivitas 100 , tanpa false positive 1-spesifisitas=0, dan AUC 1.0. Universitas Sumatera Utara

3.11 Kerangka Kerja