42 Sebanyak 20 mg piroksikam ditimbang seksama, dimasukkan
ke dalam labu takar 100 mL dan dilarutkan dalam 15 mL metanol. Kemudian ditambah dengan PBS pH 6,4 untuk memperoleh
konsentrasi 200 µgmL. Dari larutan stok tersebut diambil 10 mL dan dipindahkan ke dalam labu takar 100 mL, lalu dilarutkan dengan
pelarut yang sama untuk memperoleh konsentrasi 20 µgmL. Dari larutan intermediet tersebut, diambil 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0;
dan 9,0 mL, dipindahkan ke dalam labu takar 10 mL dan dilarutkan dengan pelarut yang sama untuk memperoleh konsentrasi 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14, 16, 18 µgmL. Panjang gelombang maksimal ditentukan dari larutan intermediet konsentrasi 20 µgmL yang dibaca menggunakan
spektrofotometer UV pada rentang 200-400 nm. Kemudian seluruh larutan seri dianalisis pada panjang gelombang maksimal Garg
et al.
2014. 3.6.11. Uji Keseragaman Kandungan Obat dalam
Patch
Sebanyak 3
hydrocolloid matrix
piroksikam berdiameter 1 cm
dari masing-masing formula dilarutkan dalam 15 mL metanol dan 35 mL PBS pH 6,4. Kemudian absorbansi larutan diukur pada panjang
gelombang 230 nm menggunakan spektrofotometer UV. Blanko yang digunakan sebagai pembanding adalah methanol Shirsand
et al.
2012.
3.6.12. Uji Pelepasan Obat secara In Vitro
Uji pelepasan piroksikam dari sediaan dilakukan menggunakan Franz
Diffusion Cell
pada suhu 37 ± 1
o
C. Sebanyak 15 mL metanol dan 15 mL PBS pH 6,4 dimasukkan pada sel difusi sebagai kompartemen
aseptor. Membran
Millipore
0,45 mm sebelumnya direndam dalam larutan aseptor selama 1 jam, kemudian
hydrocolloid
berdiameter 1 cm dipasang pada sel difusi. Pada tiap waktu tertentu kompartemen aseptor
disampling dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 230 nm. Kadar obat ditentukan dengan plot kurva
baku piroksikam. Nilai
dissolution efficiency
dihitung sampai waktu ke-360 menit DE
360
Pudyastuti, Nugroho dan Martono, 2014. 3.6.13. Uji Stabilitas
Hydrocolloid Matrix
Piroksikam
Setiap formula
hydrocolloid matrix
piroksikam berdiameter 1
cm disimpan dalam paparan suhu 37°C dan 45°C selama 4 minggu. Analisis fisik dan analisis kandungan obat pada
hydrocolloid matrix
dilakukan setiap akhir minggu. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali Amjad
et al.
2011.
3.6.14. Uji Iritasi Kulit
Uji iritasi kulit dilakukan dengan menggunakan 3 kelinci albino dengan bobot 1,8
–2,2 kilogram.
Hydrocolloid matrix
yang tidak PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43 mengandung obat adalah yang digunakan dalam uji iritasi kulit.
Larutan etil asetat diaplikasikan pada permukaan dorsal kiri pada tikus, di mana sediaan yang akan diuji diletakkan di permukaan kanan dorsal.
Sediaan dilepas setelah 24 jam dengan bantuan alkohol. Kemudian kulit diperiksa apakah terdapat eritemaedema Shirsand
et al.,
2012.
3.6.15. Uji Aktivitas
Hydrocolloid Matrix
Piroksikam
Enam ekor tikus putih jantan umur 2-3 bulan dengan berat 150- 180 gram, dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok perlakuan
terdiri dari 3 ekor tikus diabetes dengan kadar gula darah 250 mgdL dan 3 ekor tikus tidak diabetes sebagai kelompok kontrol. Tikus
diabetes diperoleh dengan menginjeksi aloksan monohidrat secara intraperitoneal dengan dosis 150 mgkgBB. Setiap tikus diberi olesan
krim
Veet
®
pada bagian punggungnya dan didiamkan selama 5 menit. Lalu dibilas dengan kapas yang dibasahi air bersih. Tikus dibiarkan
selama 48 jam sebelum diberi luka eksisi. Kemudian tikus dianestesi dengan ketamin 0,5 mLkgBB secara intramuskular pada bagian paha.
Setelah 30 menit, kulit punggung tikus dibasahi dengan etanol 70 dan dibuat 5 luka eksisi menggunakan
biopsy punch
berdiameter 5 mm ke punggung tikus yang sudah dicukur sebelumnya hari ke-0. Kelima
luka eksisi pada 1 ekor tikus diberi perlakuan berbeda, yaitu: kontrol tanpa perlakuan,
hydrocolloid matrix
HPMC tanpa piroksikam,
hydrocolloid matrix
PVP tanpa piroksikam,
hydrocolloid matrix
HPMC piroksikam, dan
hydrocolloid matrix
PVP piroksikam.
Hydrocolloid matrix
dengan atau tanpa piroksikam berdiameter 1 cm dilekatkan pada luka eksisi dengan batuan plester
hypavix
. Penggantian sediaan dilakukan setiap 24 jam sampai luka menutup. Luka eksisi
kemudian dimonitor dan area luka dihitung. Setelah luka sembuh, tikus dieutanasia dengan injeksi ketamin dosis letal 100 mgkgBB. Kulit
punggung diambil dengan ukuran 2x2 cm dan disimpan dalam pot berisi formalin 10.
Gambar 5. Pola Perlakuan Luka pada Punggung 2 Kelompok Tikus
c b
a d
e
44
Tabel 3. Keterangan Pola Luka pada Punggung 2 Kelompok Tikus
Keterangan Tikus 1
Tikus 2 Tikus 3
Cad D Cad ND
a Kontrol
HM HPMC
Pxm HM
PVP Pxm
Basis HM
PVP Basis
HM HPMC
b
Basis HM
HPMC HM
PVP Pxm
Kontrol HM
HPMC Pxm
Basis HM
PVP
c
Basis HM
PVP Kontrol
Basis HM
HPMC HM
PVP Pxm
HM HPMC
Pxm
d
HM HPMC
Pxm Basis HM
HPMC Basis
HM PVP
Kontrol HM
PVP Pxm
e
HM PVP
Pxm Basis HM
PVP HM
HPMC Pxm
Basis HM
HPMC Kontrol
3.6.16. Uji histopatologi – pengecatan Hematoxylin-Eosin HE
Sampel berupa jaringan kulit dari perlakuan diambil, kemudian dilakukan pengecatan dengan hematoxylin-eosin, lalu dilihat dibawah
mikroskop untuk melihat perubahan histopatologisnya. a.
Trimming.
Pemotongan tipis jaringan dengan skalpel. b. Dehidrasi. Dilakukan untuk mengeluarkan air yang terkandung
dalam jaringan dengan menggunakan reagen pembersih, lalu dilakukan impregnasi penetrasi parafin ke dalam jaringan.
c.
Embedding
dan
cutting.
Jaringan yang sudah didehidrasi diletakkan di atas sebuah balok kayu
embedding
sebagai alas pemotongan jaringan dengan pisau mikrotom
cutting
. d.
Staining.
Rangkaian pewarnaannya adalah sebagai berikut: xylol I 5 menit; xylol II 5 menit; xylol III 5 menit; alkohol absolut I
5 menit; alkohol absolut II 5 menit; akuades 1 menit; Harris Hematoxylin 20 menit; akuades 1 menit;
acid
alkohol 2-3 celupan; akuades 1 menit; akuades 15 menit; eosin 2 menit;
alkohol 96 I 3 menit; alkohol 96 II 3 menit; alkohol absolut III 3 menit; alkohol absolut IV 3 menit; xylol IV 5 menit; dan
xylol V 5 menit.
e.
Mounting.
Menutup kaca objek dengan kaca penutup PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45 f. Pembacaan slide dengan mikroskop. Pengamatan histopatologi
dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya Olympus tipe BH-2, Olympus Corp., Jepang.
3.6.17. Tata Cara Analisis Hasil
Data yang akan diperoleh pada penelitian ini adalah data sifat fisik dan stabilitas
hydrocolloid marix
piroksikam
diabetic wound healing
, dan data kecepatan penyembuhan luka pada tikus. Beberapa uji
dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: a.
Persentase
moisture content
:
Moisture content
=
� �� � − � �� ℎ�� � �� ℎ��
� b. Persentase
moisture absorption
:
Moisture absorption
=
� �� ℎ��− � �� � � �� �
� c.
Nilai
dissolution efficiency
DE pada uji pelepasan obat dihitung dengan persamaan:
= ��
00
� −
� d. Kecepatan penyembuhan luka pada tikus:
Wound closure = area luka pada hari ke − − area luka pada hari ke − n
area luka pada hari ke − x
e. Data hasil tiap uji pengukuran diuji statistik menggunakan
software
R
for statistic
ver. 3.2.3 dengan penggunaan uji tertentu, yaitu:
1. Uji T-Berpasangan dilakukan pada taraf kepercayaan 95, untuk
membandingkan data
sebelum dan
sesudah dilakukannya uji stabilitas. Uji normalitas data diakukan
dengan menggunakan
Shapiro test
, sedangkan uji homogenitas data tidak dilakukan karena data hanya 1 variasi.
2. Uji ANAVA dan
Post Hoc test
dilakukan pada taraf kepercayaan 95 untuk membandingkan ada tidaknya
perbedaan pada tiap data beberapa uji Uji keseragaman bobot,
moisture content,
keseragaman kandungan, pelepasan obat, dan uji aktivitas. Uji normalitas data diakukan dengan
menggunakan
Shapiro test,
kemudian dilakukan pengujian homogenitas variansi data menggunakan
Levene’s test. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Lampiran 2.
Ethical Clearance
Penelitian
47 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
Lampiran 3.
Certificate of Analysis
Piroksikam
49
Lampiran 4.
Certificate of Analysis
PVP K-30 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Lampiran 5.
Certificate of Analysis
HPMC PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Lampiran 6. Data Sifat Fisik
Hydrocolloid Matrix
Piroksikam 1. Data Uji Sterilitas
Formula Sterilitas
Basis 1
√
Basis 2
√
Basis 3
√ PVP 1
√ PVP 2
√ PVP 3
√ √: Steril
2. Data Uji Organoleptis Formula
