Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN
GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
Gambar 3.1 Program PCR Primer Degenerate Non Nested
Gambar 3.2 Program PCR Primer Degenerate Nested
e. Sequencessing DNA dan Analisis Urutan Gen MC1R
Sequencessing urutan hasil amplifikasi dengan metode PCR 2 sampel, yaitu sampel ikan gurame dari primer degenerate non nested dan primer degenerate
nested dilakukan dengan reaksi 2 arah pasangan primer menggunakan mesin sequencer BigDye Applied Biosystem yang tersedia pada Macrogen, Korea
www.macrogen.com. Analisa urutan merupakan ringkasan dari seluruh metode yang sudah dilakukan untuk mengetahui basa nukleotida dan dibandingkan
kesamaannya dengan urutan lainnya.
95 ºC
95 ºC
51,2 ºC
” ’
72 ºC
72 ºC
” ”
’ 10
ºC ∞
35 siklus
95 ºC
95 ºC
52,8 ºC
” ’
72 ºC
72 ºC
” ”
’ 10
ºC ∞
35 siklus
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN
GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
f. Perancangan Primer Spesifik dari Sequence Gen MC1R
Perancangan primer spesifik dilakukan dengan penjajaran hasil sequencessing gen MC1R yang didapatkan dari GenBank www.ncbi.nih.nlm.gov, untuk
mendapatkan daerah sequence yang lestari menggunakan program DNAbaser, dan Clustal X untuk mendapatkan primer forward dan reverse, primer dirancang
dengan syarat primer standar.
g. Uji Validasi Primer Spesifik Stok DNA Genome Ikan Gurame
Osphronemus gouramy dan Stok Sampel cDNA Ikan Gurame Osphronemus gouramy
Setelah perancangan primer spesifik, uji validasi primer menggunakan amplifikasi dengan metode PCR dan elektroforesis seperti sebelumnya, kepada
stok DNA Genome ikan gurame dan stok cDNA ikan gurame Osphronemus gouramy yang telah terinfeksi Aeromonas hydrophila Strain A2 Kusumawaty,
2014 sumber belum dipublikasikan
h. Analisis Data Bioinformatika dan Karakterisasi Pohon Filogenetik
Hasil uji penelitian deksriptif data dan dokumentasi dikumpulkan. Hasil sequencesing berupa basa nukleotida sequence diurutkan dengan cara Alignment
dan Contig menggunakan aplikasi Clustal X dan diurutkan basa nukleotida sequence gen MC1R menggunakan aplikasi DNABaser. Sequence yang sudah
baik di BLAST untuk mengetahui kebenaran gen yang dimiliki dengan dan mengetahui kesamaan jenis yang dimiliki oleh jenis ikan lainnya, BLAST ini
diakses di blast.ncbi.nlm.nih.gov. Sequences jenis ikan yang ada pada hasil BLAST dibuat format FASTA dan di alignment menggunakan aplikasi Clustal X,
untuk mencari daerah homologi dan gap yang dimiliki oleh sequence untuk dianalisis. Sequence yang sudah di alignment dianalisis dengan aplikasi SMART
untuk mengetahui struktur domain dan membuat pohon filogenetik untuk mengkarakterisasi gen dan mengetahui kekerabatan serta validasi sequence gen
MC1R dengan menggunakan metode Neighbour-Joining menggunakan aplikasi MEGA v.5 Dharmayanti, 2011
Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN
GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia
| repository.upi.edu
| perpustakaan.upi.edu
F. Alur Penelitian
Gambar 3.3 Diagram Alur Penelitiam
