Tahap Persiapan Isolasi DNA Kromosom

Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

1. Tahap Persiapan

Tahap persiapan meliputi persiapan alat dan bahan yang akan dilakukan dalam proses penelitian. Alat-alat yang bersih dan bahan yang digunakan, dibungkus menggunakan plastik tahan panas dan disterilisasi menggunakan autoclave selama 15-20 menit pada suhu 121ºC dengan tekanan. Alat dan bahan yang digunakan terlampir pada Lampiran 1. Kegiatan penelitian di lakukan Laboratorium Mikrobiologi Departemen Pendidikan Biologi FPMIPA UPI.

2. Tahap Penelitian

a. Mengumpulkan sequence gen MC1R dari berbagai jenis ikan Infraclassis

Teleostei Primer dibuat dengan menganalisa sequence gen MC1R dari GenBank http:www.ncbi.nlm.nih.gov. Sequence gen yang dibuat primernya berasal dari gen MC1R Infraclassis Teleostei, Ordo Perciformes yang tertera pada Tabel 3.1 syarat pembuatan primer dari sequence sekerabat sebanyak minimal lima spesies. Pada penelitian ini total jumlah species yang digunakan sebanyak 11 species. Sequence DNA dikumpulkan dengan format FASTA umtuk multiple alignment pensejajaran banyak sequence dengan menggunakan aplikasi software Clustal X. Tabel 3.1 Daftar species ikan Ordo Perciformes untuk desain Primer Degenerate No. Nama Ikan Nomor GenBank Nomor GI 1 Takifugu rubripes_t24 AB437783.1 189068473 2 Takifugu chinensis_k22 AB437805.1 189068993 3 Takifugu sp_01 AB437812.1 189069007 4 Takifugu chinensis_k24 AB437807.1 189068997 5 Takifugu sp_s1 AB437808.1 189068999 6 Takifugu rubripes AY227791.1 29165373 7 Tetraodon nigroviridis AY332238.1 33867666 8 Poecilia reticulata AB563501.1 322803513 9 Xhiphophorus maculatus DQ866828.1 113206523 10 Paralichthys EU365367.1 165988231 Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu 11 Dicentrarchus FN377856.1 270377196

b. Desain Pasanngan Primer Degenerate Gen MC1R

Hasil pensejajaran kemudian dibuat pasangan primer degeneratenya dengan mengakses laman Primaclade http:primaclade.orgcgi-binprimaclade.cgi. Hasil amplikon diperkirakan 400-800 bp. Didapatkan beberapa kandidat primer yang terdapat pada Bab 4 Hasil dan Pembahasan Tabel 4.2.

c. Isolasi DNA Genome Ikan Gurame Osphronemus gouramy

1. Isolasi DNA Kromosom

Isolasi DNA genome ikan gurame dari 30 jenis ikan gurame di daerah Sukabumi dan Tasikmalaya menggunakan metode lisis CTAB 2x. Daging atau jaringan ikan gurame dengan ukuran luas 1 cm 2 yang sudah dihancurkan dimasukan ke dalam larutan 500 µl buffer lysis CTAB Buffer - CTAB + SDS10 + CTAB perbandingan 0,7:0,3:0,1, pH 8,0 pada tabung eppendorf, ditambahkan 7 µl SDS 20 dan β-mercaptoetanol, dihomogenasi sehingga larut dan merata, lalu tabung diinkubasi pada suhu 60°C selama satu jam, setelah inkubasi ditambahkan 10 µl Proteinase K 10mgml kemudian diinkubasi selama 12-15 jam pada suhu 65°C. Proses sebelumnya dilanjutkan dengan inkubasi lalu Potassium Asetat 5 M sebanyak 110 volume awal ditambahkan ke dalam tabung, dihomogenkan dan diinkubasi di dalam freezer pada suhu 20°C selama 20 menit. Tabung yang sudah diinkubasi, disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, setelah disentrifugasi terbentuk 2 lapisan, lapisan supernatan dan protein. Supernatan diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke pada tabung eppendorf yang baru, lalu ditambahkan RNAse 10mgml sebanyak 1100x volume cairan. Setelah itu, tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama satu jam. Tabung diekstraksi dengan CIAA Kloroform:Isoamil Alkohol ; 24:1 sebanyak ½ x volume total, lalu larutan dihomogenasi dengan cara dibolak-balikan minimal sebanyak 50 kali, hingga larut, dan berwarna putih susu. Proses ini dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm selama 10 menit, hingga terdapat tiga lapisan. Larutan pertama cairan berisi DNA, kedua protein dan ketiga Nilamsari Kurniasih Indrawan, 2015 ISOLASI DAN AMPLIFIKASI GEN PARSIAL MELANOCORTIN - 1 RECEPTOR MC1R PADA IKAN GURAME Osphronemus gouramy Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu kloroform. Lapisan pertama dipindahkan pada tabung eppendorf baru, lalu ditambahkan sodium asetat 3M sebanyak 110 x volume total pada tabung baru tersebut, lalu dihomogenkan. Ethanol absolute yang dingin sebanyak 2x volume total ditambahkan, kemudian dihomogenkan hingga terlihat putih awan, setelah itu diinkubasi pada suhu -20°C selama satu malam. Pada keesokan setelah proses inkubasi, akan dilanjutkan dengan sentrifugasi larutan pada 15000 rpm selama 10 menit, sehingga terdapat pelet berwarna putih yang mengandung DNA, ethanol dibuang secara hati-hati, setelah itu dibilas menggunakan alkohol 70 sebanyak 1 x volume total, lalu alkohol dibuang kembali. Pelet dikeringkan di dalam oven selama kurang lebih 15 menit, setelah kering dilarutkan ke dalam Buffer TE 10 mM Tris1mM EDTA larutan tersebut adalah larutan stok DNA simpan pada suhu -20°C. DNA genome yang sudah diisolasi dicampurkan dalam 1 tabung, masing-masing diambil 1µl menjadi 1 tabung mikrotube. DNA bulk atau Mix DNA dan akan menghasilkan konsentrasi yang sesuai diinginkan Karsinah et al., 2002. Proses ini merupakan tahapan yang dilakukan pada koleksi penelitian sebelumnya Kusumawaty, Tahun, belum dipublikasikan.

2. Pengukuran Konsentrasi DNA