ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dibilas dengan air laut steril sebanyak 1-2 kali untuk mencegah kontaminan. Sampel selanjutnya dihaluskan dan disebar
sebanyak 100 µl pada media Sea Water Complete agar SWC-agar lalu diinkubasi pada suhu ruang 28-31
C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh kemudian digunakan dalam uji in vitro.
Uji in vitro
Bakteri Kandidat Probiotik a.
Metode Zona Hambat
Isolat V. harveyi MR5339 Rf
R
dan bakteri kandidat probiotik berumur 24 jam diencerkan hingga memiliki tingkat kekeruhan yang sama dengan konsentrasi
biakan dalam suspensi sekitar 10
9
selml. Selanjutnya V. harveyi MR5339 Rf
R
disebar pada media SWC-agar sebanyak 50µl. Kertas cakram Whatman antibiotic assay paper
berdiameter 6 mm ditetesi suspensi bakteri kandidat probiotik sebanyak 10 µl, kemudian ditaruh di atas media SWC-agar yang telah diberi V.
harveyi MR5339 Rf
R
. Sebagai kontrol digunakan larutan garam fisiologis. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang, diameter zona bening yang dihasilkan
diukur menggunakan penggaris pada 3 posisi dari setiap kertas cakram, kemudian dirata-ratakan.
b. Metode Kultur Bersama
Isolat-isolat yang tidak menghasilkan zona hambat diuji kemampuannya melawan V. harveyi MR5339 Rf
R
dengan metode kultur bersama. Isolat–isolat tersebut ditumbuhkan pada media SWC-cair dengan kepadatan 10
2
CFUml. Pada tabung yang sama ditambahkan 10
2
CFUml V. harveyi MR5339 Rf
R
kemudian diinkubasi semalam pada inkubator bergoyang dengan suhu 28
C. Kultur selanjutnya disebar pada media SWC+Rf sehingga hanya V. harveyi MR5339 Rf
R
yang tumbuh. Apabila V. harveyi MR5339 Rf
R
pada tabung kontrol tanpa isolat bakteri kandidat probiotik tumbuh jauh lebih banyak dibandingkan dengan kultur
campuran V. harveyi MR5339 Rf
R
dicampur dengan isolat bakteri kandidat probiotik, berarti bakteri kandidat probiotik mampu menghambat pertumbuhan V.
harveyi MR5339 Rf
R
.
Uji Patogenisitas Bakteri Kandidat Probiotik
Sebelum dilakukan uji in vivo pada udang, sepuluh isolat masing-masing lima isolat dari metode zona hambat dan lima isolat dari metode kultur bersama
diuji patogenisitasnya pada udang. Satu lup dari masing-masing isolat ditumbuhkan dalam media SWC-cair secara terpisah. Kultur ditempatkan pada
inkubator bergoyang selama 10 jam pada suhu ruang. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu ruang. Pellet sel yang terbentuk kemudian
diresuspensikan dalam larutan fisiologis dan ditambahkan pada media pemeliharaan larva udang hingga mencapai konsentrasi akhir 10
6
CFUml. Larva udang dipelihara dalam toples yang diisi air laut steril 2 liter dengan kepadatan 10
ekorl dan diberi pakan Artemia 3-5 individuml. Patogenisitas bakteri kandidat probiotik diamati melalui kematian larva selama 5 hari pemeliharaan. Pada akhir
percobaan dihitung kelangsungan hidup SR larva udang dan dibandingkan dengan kontrol, yakni perlakuan tanpa penambahan bakteri kandidat probiotik.
Pembuatan Mutan Bakteri Kandidat Probiotik
Isolat-isolat yang menghasilkan kelangsungan hidup terbaik pada uji patogenisitas, sebelum uji in vivo pada larva udang diberi penanda resisten
rifampisin Rf
R
terlebih dahulu. Pemberian penanda Rf
R
pada bakteri kandidat probiotik dilakukan melalui mutasi spontan dengan menumbuhkan bakteri
tersebut pada media SWC-agar yang telah mengandung rifampisin 50 µgml SWC+Rf. Pemberian penanda Rf
R
pada bakteri probiotik dimaksudkan agar keberadaan bakteri tersebut pada larva udang dan lingkungan pemeliharaannya
dapat dimonitor.
Uji in vivo Bakteri Kandidat Probiotik
Isolat-isolat bakteri kandidat probiotik yang paling potensial dan tidak bersifat patogen diuji efektifitasnya dalam menghambat serangan V. harveyi
MR5339 Rf
R
pada larva udang. Isolat bakteri kandidat probiotik diinokulasikan ke dalam wadah pemeliharaan udang hingga mencapai konsentrasi akhir 10
6
CFUml sehari setelah larva udang dimasukkan. Setelah kokultivasi dengan larva udang
selama 6 jam, V. harveyi MR5339 Rf
R
diinokulasikan ke dalam wadah pemeliharaan udang hingga mencapai konsentrasi akhir 10
6
CFUml. Percobaan dilakukan dengan tiga ulangan termasuk kontrol kontrol positif : hanya
diinokulasi V. harveyi MR5339 Rf
R
, kontrol negatif : tanpa penambahan V. harveyi
MR5339 Rf
R
maupun bakteri kandidat probiotik. Pengamatan dilakukan selama 12 hari dan pada akhir percobaan dihitung SR larva udang, populasi
bakteri baik dari larva udang maupun dari media airnya setiap tiga hari. Selama percobaan larva udang diberi pakan Artemia sebanyak 3-5 individuml.
Identifikasi Bakteri Probiotik Terpilih
Identifikasi isolat terpilih dilakukan berdasarkan hasil sekuensing gen 16S r RNA Marchesi et al., 1998. Sekuensing gen 16S-rRNA terdiri dari tahapan
ekstraksi DNA, amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR Suwanto, 2002, gene clean
menggunakan GelPCR DNA Fragments Extraction KIT Geneaid dan sekuensing dengan mesin Sequenser.
a. Ekstraksi DNA
