Selanjutnya ditambahkan 1 ml etanol 70 dingin lalu disentrifugasi lagi pada kecepatan maksimum selama 2 menit. Supernatan dibuang kembali, lalu disimpan
di suhu ruang hingga etanol menguap habis. Sebelum disimpan DNA ditambah dengan elution buffer atau aquabidest steril serta dilakukan pengecekan dengan
elektroforesis.
b. Amplifikasi gen 16S-rRNA dengan PCR
Primer yang digunakan adalah primer universal untuk domain bakteri berupa forward primer 63f 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ dan
reverse primer 1387r 5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’ Marchesi et al., 1998. Semua komponen reaksi dicampur dalam microtube dan dimasukkan
dalam mesin PCR. Tahapan PCR terdiri dari pre start 94 C, 2 menit; tahap
denaturasi 92 C, 30 detik; tahap annealing 55
C, 30 detik, tahap elongasi 72 C
selama 1 menit. Proses PCR terdiri dari 30 siklus. Selanjutnya post PCR pada suhu 75
C 20 menit dan tahap stop PCR pada suhu 4 C. Kemudian hasil PCR
disimpan pada suhu -20 C.
c. Gene clean
DNA produk PCR dimurnikan menggunakan GelPCR DNA Fragments Extraction Kit
, Geneaid. Sebanyak 300 mg agarose hasil pemotongan pada elektroforesis dimasukkan dalam eppendorf. Kemudian ditambahkan 500 µl DF
buffer dan divortex. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55-60
C selama 15 menit hingga agarose terlarut sempurna. Kemudian 800 µl sampel dimasukkan ke dalam
DF column dan disentrifugasi 13000 rpm selama 30 detik dan supernatan dibuang.
Selanjutnya ditambahkan 600 µl wash buffer yang telah ditambahkan etanol ke dalamnya, lalu disentrifugasi 13000 rpm selama 30 detik. Supernatan yang ada
dibuang lalu disentrifugasi kembali selama 3 menit pada kecepatan penuh. DF column
dipindahkan pada eppendorf baru dan ditambahkan 15-50 µl aquabidest steril pada bagian tengahnya. Selanjutnya didiamkan selama 2 menit lalu
disentrifugasi pada kecepatan penuh selama 2 menit. Kemudian DNA yang terbentuk disimpan pada suhu -20
C. Untuk pengecekan dapat dilakukan running elektroforesis
DNA hasil gene clean Lampiran 2.
Rancangan Penelitian dan Teknik Analisa
Penelitian dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap RAL, sebelas perlakuan dengan tiga ulangan pada saat uji patogenisitas dan dua belas
perlakuan dengan tiga ulangan pada uji in vivo. Parameter yang diamati dianalisa keragamannya dengan ANOVA dan untuk mengetahui pengaruh perlakuan
dilakukan uji lanjut. Variabel yang dianalisa secara statistik meliputi kelangsungan hidup larva udang baik pada uji patogenisitas maupun uji in vivo
serta laju pertumbuhannya. Sedangkan nilai zona hambat dan populasi bakteri dianalisa secara deskriptif.
Parameter yang diamati a.
Tingkat Kelangsungan Hidup Larva Udang Windu
Tingkat kelangsungan hidup larva udang windu dihitung menggunakan rumus :
SR=Nt x 100 Effendie, 1997
No Keterangan :
SR : tingkat kelangsungan hidup
Nt : jumlah udang yang hidup pada akhir pengamatan ekor
No : jumlah udang pada awal pengamatan
b. Laju Pertumbuhan Panjang dan Bobot Harian Larva Udang Windu
Pertumbuhan panjang dan bobot total diamati pada awal dan akhir penelitian. Pertumbuhan larva udang windu dihitung berdasarkan pertambahan
bobot dan panjang berdasarkan rumus berikut : ⎪⎭
⎪ ⎬
⎫ ⎪⎩
⎪ ⎨
⎧ ⎟⎟
⎠ ⎞
⎜⎜ ⎝
⎛ −
= 100
1 x Lo
Lt
t
α
dan
⎪⎭ ⎪
⎬ ⎫
⎪⎩ ⎪
⎨ ⎧
⎟⎟ ⎠
⎞ ⎜⎜
⎝ ⎛
− =
100 1 x
Wo Wt
t
α
Effendie, 1997
Keterangan : α
: Laju pertumbuhan harian udang t
: Lama waktu pemeliharaan udang hari Wt
: Bobot rata-rata akhir udang mg Wo
: Bobot rata-rata awal udang mg Lt :
Panjang rata-rata akhir udang mm
Lo : Panjang rata-rata awal udang mm
c. Populasi Bakteri
