Hubungan Keragaman Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat Pertumbuhan pada Ayam Lokal.
HUBUNGAN KERAGAMAN GEN IGF2 DAN GHR
TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN
PADA AYAM LOKAL
RIA PUTRI RAHMADANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Hubungan Keragaman
Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat Pertumbuhan pada Ayam Lokal adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2015
Ria Putri Rahmadani
NIM D151140496
RINGKASAN
RIA PUTRI RAHMADANI. Hubungan Keragaman Gen IGF2 dan GHR terhadap
Sifat Pertumbuhan pada Ayam Lokal. Dibimbing oleh CECE SUMANTRI, SRI
DARWATI dan NIKEN ULUPI.
Ayam lokal merupakan salah satu ternak lokal yang berpotensi untuk
dikembangkan sebagai sumber penghasil daging di Indonesia. Ayam lokal
memiliki keunggulan mampu beradaptasi pada lingkungan tropis serta memiliki
sistem imun yang kuat namun kelemahannya yaitu laju pertumbuhan yang lambat.
Perkembangan teknologi molekuler dapat dimanfaatkan sebagai salah satu metode
seleksi berbasis MAS (Marker Assissted Selection) yang diperoleh melalui
identifikasi gen-gen utama yang mengontrol sifat pertumbuhan pada ayam seperti
gen IGF2 (Insuline-like Growth Factor 2) dan GHR (Growth Hormone Receptor).
Penelitian ini bertujuan menganalisis keragaman gen IGF2 dan GHR pada
beberapa populasi ayam lokal dan memahami hubungan keragaman gen-gen
tersebut dengan sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Penelitian terdiri dari 2 tahap yaitu analisis keragaman gen IGF2 dan GHR
pada beberapa populasi ayam serta asosiasi keragaman kedua gen terhadap sifat
pertumbuhan pada ayam kampung. Ayam yang digunakan sebagai sumber DNA
untuk analisis keragaman sebanyak 313 ekor terdiri dari 9 populasi yaitu ayam
kampung, pelung, sentul, merawang, ras pedaging, persilangan kampung dengan
ras pedaging, persilangan ras pedaging dengan kampung, persilangan pelung
dengan sentul dan persilangan sentul dengan kampung. Ayam kampung yang
digunakan untuk analisis asosiasi sebanyak 56 ekor yang dipelihara dari DOC
hingga umur 16 minggu. Genotyping dilakukan menggunakan metode PCR-RFLP
(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fargment Length Polymorphism).
Analisis data yang dilakukan yaitu frekeunsi genotipe, frekuensi alel,
heterozigositas, keseimbangan Hardy-Weinberg dan asosiasi data genotipe dengan
fenotipe menggunakan GLM (General Linear Model).
Hasil menunjukkan terdapat mutasi TC pada gen IGF2 dan mutasi GA
pada gen GHR. Gen IGF2 pada semua populasi ayam bersifat polimorfik. Gen
GHR bersifat monomorfik pada ayam pelung, sentul dan persilangan pelung
dengan sentul. Gen IGF2 pada ayam persilangan pelung dengan sentul, kampung,
dan persilangan kampung dengan ras pedaging memiliki keragaman yang tinggi
sedangkan pada gen GHR tidak ditemukan populasi dengan keragaman yang
tinggi. Tidak ditemukan asosiasi antara keragaman gen IGF2 dan GHR terhadap
sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Kata kunci: ayam lokal, gen IGF2, gen GHR, keragaman, sifat pertumbuhan
SUMMARY
RIA PUTRI RAHMADANI. Association of IGF2 and GHR Genes Polymorphism
with Growth Traits in Local Chicken. Supervised by CECE SUMANTRI, SRI
DARWATI and NIKEN ULUPI.
Local chicken is one of local genetic resources which is potential to be
developed as meat producer in Indonesia. Local chicken has some superiority
such as adapted in tropic and strong immune system but local chicken still has a
weakness which is slow growth. Moleculer technique can be used as one of
selection method based on MAS (Marker Assisted Selection) which can be
determined by identification of major genes that control growth in chicken such as
IGF2 (Insuline-like Growth Factor 2) and GHR (Growth Hormone Receptor)
genes. This study aimed to analyze the polymorphism of IGF2 and GHR genes in
some local chicken populations and the association with growth traits in kampung
chicken.
Research consisted of two steps namely analysis of IGF2 and GHR genes
polymorphimsm in some chicken populations and association of IGF2 and GHR
genes with growth traits in kampung chicken. A total of 313 head of chickens
from nine populations consisted of kampung, pelung, sentul, merawang,
commercial meat type and the crossbred of kampung-commercial meat type,
commercial meat type-kampung, pelung-sentul, and sentul-kampung chickens
were used as DNA resources for polymorphism analysis. A total of 56 head of
kampung chickens were used as matery for association analysis. Genotyping was
done by PCR-RFLP method (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fargment
Length Polymorphism). The data analysis were genotype frequency, allele
frequency, heterozigosity, Hardy-Weinberg equilibrium and association of
genotype and phenotype using GLM (General Linear Model).
Result showed there were TC mutation on IGF2 gene and GA mutation
on GHR gene. IGF2 gene in all population was polymorphic. GHR gene was
monomorphic in pelung, sentul and the crossbreed of pelung-sentul chickens.
IGF2 gene had high heterozigosity in the crossbred of pelung-sentul, kampung
and crossbred of kampung-commercial meat type whereas there was no
population with high heterozigosity on GHR gene. The association analysis
showed there was no association between IGF2 and GHR genes polymorphism
with growth traits in kampung chicken.
Key words: GHR gene, growth traits, IGF2 gene, local chicken, polymorphism
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
HUBUNGAN KERAGAMAN GEN IGF2 DAN GHR
TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN
PADA AYAM LOKAL
RIA PUTRI RAHMADANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Rita Mutia, MAgr
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya
sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih pada penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan Juli 2014 hingga Maret 2015 ini adalah ayam lokal
Indonesia dengan judul Hubungan Keragaman Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat
Pertumbuhan pada Ayam Lokal.
Penulis menyadari bahwa penulis tidak akan bisa menyelesaikan tesis ini
tanpa bantuan dari berbagai pihak. Penulis ucapkan terimakasih kepada Bapak
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc, Ibu Dr Ir Sri Darwati, MSi dan Ibu Dr Ir Niken
Ulupi, MS sebagai dosen pembimbing atas segala curahan waktu, bimbingan,
semangat dan motivasi yang selalu diberikan kepada penulis sejak penulis
menempuh pendidikan sarjana hingga menyelesaikan program magister. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Dr Ir Rita Mutia, MAgr atas kesediaannya
menjadi penguji luar komisi pada ujian sidang tesis penulis dan atas masukan
serta saran untuk perbaikan tesis ini.
Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan sebesar-besarnya kepada
mama (Sri Maharani Almh), papa (Syaiful Firmadi Alm), oma (Warnius), opa
(Murice Alm), adik-adik (Irfan dan Adit) serta seluruh keluarga atas segala doa,
kasih sayang dan semangat yang selalu diberikan kepada penulis sejak kecil
hingga saat ini. Semoga Allah senantiasa mempersatukan kita di dunia dan di
surga-Nya kelak.
Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada rekan-rekan di
Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak yaitu Pak Dadang, Kak Eryk, Kak
Shelvi, Kak Isyana, Kak Alit, Kak Furqon, Kak Pandu, Kak Roaslein, Rindang,
Mujo, Hadi, Riri dan Mustika atas persahabatannya dan bantuan yang diberikan
selama penelitian berlangsung. Terima kasih juga kepada saudari-saudari di Kos
Menjemput Hidayah yaitu Puspita, Nisa, Lita dan Dita atas persaudaraannya
selama 5 tahun ini. Terimakasih kepada teman-teman IPTP 47 khususnya sahabat
terbaik Anita, Ica, Laras, dan Ishfi atas segala persahabatan, motivasi, bantuan dan
dukungan yang selama ini diberikan. Kepada Mohamad Jafar Sidiq, terimakasih
penulis ucapkan atas semua kebaikan, kesabaran dan kasih sayang yang selama ini
diberikan sehingga penulis tidak pernah merasa sendiri.
Terimakasih kepada DIKTI yang telah memberikan beasiswa Fresh
Graduate selama penulis menempuh pendidikan magister. Kepada semua pihak
yang telah membantu yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu, terimakasih
atas segalanya. Semoga Allah memberikan kelimpahan berkah, pahala dan
balasan yang terbaik atas semua kasih sayang, dukungan, curahan waktu dan
kebaikan lainnya yang diberikan kepada penulis. Semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Juli 2015
Ria Putri Rahmadani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian Tahap I : Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Penelitian Tahap II : Asosiasi Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat
Pertumbuhan Ayam Kampung
2
2
2
5
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Genotyping Gen IGF2 dan GHR
Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Heterozigositas dan Keseimbangan Gen IGF2 dan GHR
Pertumbuhan Ayam Kampung
7
7
9
11
12
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
16
16
16
DAFTAR PUSTAKA
17
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
Komposisi nutrisi pakan ayam kampung
Frekuensi genotipe dan alel gen IGF2
Frekuensi genotipe dan alel gen GHR
Heterozigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg gen IGF2 dan
GHR
Asosiasi gen IGF2 dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Asosiasi gen GHR dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Frekuensi genotipe SNP kombinasi gen IGF2 dan GHR ayam kampung
Asosiasi gen GHR dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
6
10
10
11
13
14
15
15
DAFTAR GAMBAR
1 Visualisasi hasil PCR-RFLP gen IGF2 (a) dan GHR (b) ayam kampung
pada gel agarose 2%; M adalah marker
2 Perunutan sekuen gen IGF2 ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006092.3
3 Perunutan sekuen gen GHR ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006127.3
4 Capaian bobot badan ayam kampung selama 16 minggu
5 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen IGF2 berbeda
6 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen GHR berbeda
7
8
9
12
13
14
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Daging merupakan salah satu produk peternakan yang permintaannya
meningkat setiap tahun. Pada tahun 2012 ke 2013 terjadi peningkatan permintaan
daging dari 2 658 123 ton menjadi 2 880 340 ton atau meningkat sebesar 8.36%.
Pada tahun 2013, sebanyak 67.03% permintaan daging dipenuhi dari daging
unggas yang terdiri dari ayam ras pedaging 52%, ayam lokal 11.10%, ayam ras
petelur 2.68% dan itik 1.26% (BPS 2014). Industri ayam ras pedaging
memberikan kontribusi yang besar dalam memenuhi permintaan daging nasional,
namun industri ini memiliki kelemahan yaitu bergantung pada pasokan bibit dan
bahan baku pakan dari luar negeri sehingga tidak dapat mendukung kemandirian
pangan di Indonesia (Nataamijaya 2010). Kemandirian pangan dapat dicapai
melalui usaha-usaha pemuliaan dan pengembangan ternak lokal unggul. Ayam
lokal merupakan salah satu ternak lokal yang berpotensi untuk dikembangkan
sebagai sumber penghasil daging di Indonesia.
Ayam lokal memiliki keunggulan dibandingkan ayam ras pedaging yaitu
mampu beradaptasi pada lingkungan tropis (Zein dan Sulandari 2012) serta
memiliki sistem imun yang kuat terhadap infeksi bakteri dan virus (Ulupi et al.
2013; Ulupi et al. 2014; dan Pagala et al. 2013), namun memiliki kelemahan yaitu
laju pertumbuhan yang lambat (Nataamijaya 2010). Salah satu cara untuk
meningkatkan laju pertumbuhan ayam lokal yaitu melalui seleksi terhadap sifat
pertumbuhan. Perkembangan teknologi molekuler dapat dimanfaatkan sebagai
salah satu metode seleksi berbasis MAS (Marker Assissted Selection) yang
terbukti dapat meningkatkan respon seleksi pada keturunan (Sartika et al. 2004).
MAS dapat diperoleh melalui identifikasi gen-gen utama yang mengontrol sifat
pertumbuhan pada ayam seperti gen IGF2 (Insuline-like Growth Factor 2) dan
GHR (Growth Hormone Receptor).
Gen IGF2 terletak pada kromosom 5 terdiri dari 4 exon dan 3 intron dengan
ukuran 1 936 pb dan mengkode 226 asam amino (Ensembl nomor akses:
00000006555). Keragaman gen IGF2 diketahui berasosiasi positif dengan bobot
badan dan bobot karkas umur 17 minggu pada ayam beijing you (Tang et al.
2010) serta konsentrasi plasma IGF2 pada ayam black penedesenca (Amills et al.
2003). IGF2 berfungsi sebagai promotor pertumbuhan melalui proliferasi sel dan
amplifier fisiologis dari sekresi glucose mediated insulin (Zhou et al. 1995).
Beberapa penelitian membuktikan bahwa konsentrasi plasma IGF2 dalam darah
ayam tidak dipengaruhi oleh status nutrisi (Kita et al. 1996; McMurty et al. 1998).
Gen GHR terletak pada kromosom Z terdiri dari 10 exon dan 9 intron
dengan ukuran 2 468 pb dan mengkode 608 asam amino (Ensembl nomor akses:
00000014855). Keragaman gen GHR diketahui berasosiasi positif dengan bobot
tetas, bobot umur 35-63 hari dan tebal lemak subkutan pada ayam xinghua
persilangan (Ouyang et al. 2008). Gen GHR pada ayam memiliki keunikan karena
adanya bagian exon 3 yang hilang menyebabkan perbedaan panjang mRNA yaitu
5.5, 4.3, 3.2 and 0.8 kb (Tanaka et al. 1995; Mao et al. 1997). GHR memiliki
fungsi sebagai reseptor GH, terlibat dalam regulasi pertumbuhan setelah kelahiran
2
serta reservoir GH dalam plasma darah sehingga dapat menjadi modulator atau
inhibitor bagi kerja GH (Isaksson et al. 1985).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisis keragaman gen IGF2 dan GHR pada
beberapa populasi ayam lokal dan menganalisis hubungan keragaman gen-gen
tersebut dengan sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Manfaat Penelitian
Hasil identifikasi gen IGF2 dan GHR pada beberapa populasi ayam lokal
diharapkan dapat memberikan informasi mengenai keragaman genetik ayam lokal
Indonesia. Asosiasi keragaman gen-gen tersebut dengan sifat pertumbuhan dapat
dijadikan model untuk penentuan seleksi pada ayam kampung melalui penerapan
MAS.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian terdiri dari 2 tahap yaitu identifikasi keragaman gen IGF2 dan
GHR pada 9 populasi ayam lokal dan persilangan serta asosiasi keragaman kedua
gen terhadap sifat pertumbuhan pada ayam kampung. Keragaman kedua gen
diidentifikasi menggunakan metode PCR-RFLP untuk menemukan SNP pada
masing-masing gen. Asosiasi keragaman genotipe kedua gen dianalisis terhadap
laju pertumbuhan dan bobot badan pada ayam kampung.
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian terdiri dari 2 tahap yaitu analisis keragaman gen IGF2 dan GHR
pada 9 populasi ayam serta asosiasi keragaman gen IGF2 dan GHR terhadap sifat
pertumbuhan pada ayam kampung. Analisis keragaman gen dilakukan di
Laboratorium Genetika Molekuler Ternak sedangkan pemeliharaan dan
pengukuran sifat pertumbuhan ayam kampung dilakukan di Laboratorium Lapang,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan selama 8
bulan dari Juli 2014 hingga Maret 2015.
Penelitian Tahap I : Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Penelitian tahap I dilakukan untuk mengetahui keragaman gen IGF2 dan
GHR dalam tingkat populasi. Penelitian terdiri dari pengambilan sampel darah,
3
ekstraksi DNA, PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment
Length Polymorphism), elektroforesis dan analisis data.
Sampel
Ayam yang digunakan sebagai sumber DNA sebanyak 313 ekor terdiri dari
9 populasi yaitu ayam kampung (131 ekor), pelung (23 ekor), sentul (34 ekor),
merawang (18 ekor), ras pedaging (10 ekor), persilangan kampung dengan ras
pedaging (41 ekor), persilangan ras pedaging dengan kampung (16 ekor),
persilangan pelung dengan sentul (22 ekor) dan persilangan sentul dengan
kampung (18 ekor). Ayam merupakan koleksi Laboratorium Pemuliaan dan
Gentetika Ternak IPB.
Pengambilan Sampel Darah
Bagian sayap ayam di sekitar vena axillaris dibersihkan dari bulu dan
kotoran menggunakan alkohol 70% kemudian darah diambil menggunakan spuit.
Darah yang telah diambil dimasukan ke dalam tabung ependorf 1.5 mL yang telah
diisi dengan EDTA (etilen diamin tetra asetat). Darah dihomogenkan segera agar
tidak beku. Sampel kemudian disimpan dalam refrigerator dengan suhu 4 ºC
untuk kemudian dianalisis.
Ekstraksi DNA
Metode ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan Sambrook et al. (1989).
Sebanyak 20 µL sampel darah dimasukan ke dalam tabung ependorf 1.5 mL,
kemudian ditambahkan 1 000 µL NaCl (natrium klorida) 0.2%, dihomogenkan,
didiamkan selama 5 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 8 000 rpm selama 5
menit pada suhu ruang. Bagian supernatan yang terbentuk dibuang.
Sebanyak 40 µL SDS (sodium dodesil sulfat) 10%, 10 µL proteinase 5 mg
-1
mL dan 1 x STE (sodium tris EDTA) ditambahkan sampai 400 µL kemudian
dikocok pelan dalam inkubator suhu 55 ºC selama 2 jam. Sebanyak 400 µL fenol,
400 µL CIAA (klorofom iso amil alkohol) dan 40 µL NaCl 5 M ditambahkan lalu
dikocok pada suhu ruang selama 1 jam dan disentrifugasi pada kecepatan 12 000
rpm selama 5 menit. Bagian DNA (bening) dipindahkan sebanyak 400 µL,
ditambahkan 800 µL ETOH (etanol alkohol) absolut dan 40 µL NaCl 5M lalu
dilakukan freezing over night.
Sampel yang telah didiamkan dalam freezer kemudian didiamkan pada suhu
ruang lalu disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit. Bagian
supernatan dibuang lalu ditambahkan 800 µL ETOH 70% dan disentrifugasi pada
kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit kemudian bagian supernatan dibuang
kembali. Sampel didiamkan di ruang terbuka sampai alkohol kering lalu sebanyak
100 µL TE (tris elusion) 80% ditambahkan kemudian DNA dapat disimpan dalam
freezer sampai akan digunakan.
PCR-RFLP
Primer yang digunakan yaitu primer forward 5’-GCTGGGGACCCAATAG
AACC-3’ dan reverse 5’-TCCCCAGGAGATCACAAATCG-3’ untuk gen IGF2
serta primer forward 5’-GGGAACTGAGCATGAAAGTG-3’ dan reverse 5’-CC
ATAAGAAAGCAACAGGATCG-3’ untuk gen GHR. Primer diencerkan
menggunakan TE primer sesuai komposisi yang ditentukan. Sebanyak 25 µL
4
forward dicampur degan 25 µL reverse lalu ditambahkan 50 µL DW dalam
tabung ependorf 1.5 mL kemudian disentrifugasi. Mix larutan PCR dibuat dengan
campuran primer, GoTaq® Green Master Mix (Promega) dan DW (air destilasi)
sesuai dengan perhitungan jumlah sampel yang akan diamplifikasi lalu mix
dihomogenkan dan disentrifugasi. Sampel dimasukkan ke dalam tabung 0.2 mL
sebanyak 2 µL lalu ditambahkan mix sebanyak 14 µL kemudian dimasukan ke
dalam mesin thermocycler (Eppendorf® AG 22331) dengan suhu penempelan
primer 60 ºC untuk gen IGF2 dan 62 ºC untuk gen GHR.
Larutan untuk RFLP dibuat dengan campuran DW, buffer (G dan tango) dan
enzim restriksi (Nla III dan Hin6 I) sesuai dengan perhitungan jumlah sampel
yang akan dipotong lalu dihomogenkan dan disentrifugasi. Sampel sebanyak 5 µL
dimasukan ke dalam tabung 0.5 mL lalu ditambahkan mix sebanyak 2 µL lalu
disentrifugasi dan diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 ºC.
Elektroforesis
Hasil analisis dielektroforesis dengan persentase gel agarose yang berbeda.
Sampel hasil ekstraksi dielektroforesis dengan gel agarose 1%, hasil amplifikasi
dielektroforesis dengan gel agarose 1.5% dan hasil pemotongan dielektroforesis
dengan gel agarose 2%. Gel ditunggu hingga mengeras selama 10 menit.
Sebanyak 5 µL sampel dimasukkan ke dalam sumur sel. Sumur yang
pertama diisi DNA pengukur yang berukuran 100 pb. Elektroforesis dilakukan
menggunakan tank elektroforesis (Mupid) dengan arus 100 V selama 30 menit
lalu divisualisasi menggunakan UV transilluminator (AlphaImager® EP).
Analisis Data
Analisis data keragaman gen terdiri dari frekueinsi genotipe dan alel,
heterozigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg. Setiap analisis data
selanjutnya dijelaskan sebagai berikut.
Frekuensi genotipe dan frekuensi alel
Frekuensi genotipe merupakan proporsi suatu genotipe relatif terhadap
semua genotipe dalam populasi (Noor 2010). Frekuensi genotipe dihitung
berdasarkan Nei dan Kumar (2000) dengan rumus sebagai berikut:
x =
n
N
x =
n + ∑n
N
Frekuensi alel merupakan proporsi suatu alel relatif terhadap semua alel
dalam populasi (Noor 2010). Frekuensi alel dihitung berdasarkan Nei dan
Kumar (2000) dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
xii = frekuensi genotipe ke- ii
xi
= frekuensi alel ke- i
nii = jumlah individu bergenotipe ii
5
nij
N
=
=
jumlah individu bergenotipe ij
jumlah sampel
Heterozigositas
Keragaman genetik diketahui melalui perkiraan nilai heterozigositas.
Heterozigositas pengamatan diperoleh dengan rumus sebagai berikut (Nei
dan Kumar 2000):
Ho = ∑
≠
n
N
Heterozigositas harapan (He) berdasarkan frekuensi alel
menggunakan rumus sebagai berikut (Nei dan Kumar 2000):
He =
dihitung
q
− ∑x
=
Keterangan:
Ho = heterozigositas pengamatan
nij = frekuensi alel ke- i
N
= jumlah individu bergenotipe ii
He = jumlah individu bergenotipe ij
xi² = jumlah sampel
q
= jumlah alel
Keseimbangan Hardy-Weinberg
Keseimbangan Hardy-Weinberg untuk mengetahui keseimbangan populasi.
Keseimbangan Hardy-Weinberg dapat diketahui menggunakan perhitungan
nilai chi-kuadrat (Hartl dan Clark 1997):
χ =∑
O−E
E
Keterangan:
χ 2 = chi-kuadrat
O
= jumlah genotipe pengamatan
E
= jumlah genotipe harapan
Penelitian Tahap II : Asosiasi Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat
Pertumbuhan Ayam Kampung
Penelitian tahap II dilakukan untuk mengetahui hubungan SNP yang
diperoleh terhadap beberapa sifat pertumbuhan pada ayam kampung. Penelitian
terdiri dari pemeliharaan, pengambilan data dan analisis data.
6
Sampel
Sebanyak 56 ekor DOC ayam kampung dipelihara selama 16 minggu.
Rataan bobot DOC ayam kampung yang digunakan adalah 41.58±4.07 g dengan
koefisien keragaman 9.80%.
Pemeliharaan
Pemeliharaan diawali dengan persiapan kandang yang terdiri dari sanitasi
dan fumigasi. Selanjutnya ayam pada fase starter (0-8 minggu) dipelihara dalam
kandang kelompok yang dibagi menjadi 8 koloni. Ayam pada fase grower (8-16
minggu) dipindahkan ke kandang kelompok yang dibagi menjadi 3 koloni.
Pakan dan air minum disediakan ad libitum. Pakan yang diberikan terdiri
dari campuran pakan ayam pedaging komersial (BR-21E diproduksi oleh PT.
Sinta Prima Feedmill dengan PK 20-22%) dan dedak padi (diperoleh dari salah
satu penggilingan padi di Kecamatan Semplak, Kota Bogor). Hasil analisis
kandungan gizi pakan disajikan pada Tabel 1. Ayam pada fase starter diberikan
campuran pakan komersial dan dedak padi dengan perbandingan 80:20 sedangkan
pada fase grower diberikan pakan campuran dengan perbandingan 60:40.
Tabel 1 Komposisi nutrisi pakan ayam kampung
Kandungan Gizi
Pakan Campuran
Pakan Campuran
Starter*
Grower*
Energi bruto (kkal/kg)
4 080.00
4 001.00
Protein kasar (%)
19.03
17.42
Lemak kasar (%)
5.98
6.46
Serat kasar (%)
5.19
6.61
Kalsium (%)
1.39
1.13
Fosfor (%)
0.89
0.79
* Hasil analisis Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, IPB (2015)
Pengambilan Data
Pengambilan data bobot badan ayam dilakukan setiap minggu dari DOC
hingga umur 16 minggu. Parameter pertumbuhan yang diamati yaitu pertambahan
bobot badan (PBB) fase starter, grower, bobot badan umur 12, 14 dan 16 minggu.
PBB fase starter dihitung sebagai selisih bobot badan umur 8 dengan 0 minggu
dan PBB fase grower sebagai selisih bobot badan umur 16 dengan 8 minggu.
Analisis Data
Pengaruh perbedaan genotipe gen IGF2 dan GHR terhadap sifat
pertumbuhan pada ayam kampung dianalisis dengan prosedur GLM (General
Linear Model) pada program SAS (SAS 9.1) menggunakan analisis ragam
(ANOVA) dengan model sebagai berikut:
Y = μ+G +S +Ɛ
Keterangan:
Yijk = parameter pertumbuhan
µ
= rataan umum
Gi
= pengaruh genotipe ke-i
Sj
= pengaruh jenis kelamin ke-j
Ɛijk = pengaruh acak genotipe ke-i, jenis kelamin ke-j dan ulangan ke-k
7
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Genotyping Gen IGF2 dan GHR
Bagian exon 4 dari gen IGF2 dan bagian 3’UTR dari gen GHR berhasil
diamplifikasi dan menghasilkan produk PCR masing-masing 395 pb dan 340 pb.
Ditemukan satu SNP (Single Nucleotide Polymorphism) pada masing-masing gen.
SNP pada exon 4 gen IGF2 dikenali menggunakan enzim restriksi Nla III dengan
situs pemotongan CATG|. Berdasarkan hasil genotyping ditemukan mutasi basa
timin (T) menjadi sitosin (C) pada basa ke-138. Mutasi terjadi karena adanya
kesalahan (mispairing) basa-basa nukleotida selama proses replikasi DNA
sehingga menghasilkan sekuen baru (Graur dan Li 2000). Mutasi ini merupakan
mutasi transisi yaitu perubahan basa antar basa pirimidin dan bersifat synonimus
karena tidak menyebabkan perubahan asam amino (Hartl dan Clark 1997). Kedua
basa tersebut mengkode asam amino yang sama yaitu histidin (Amills et al. 2003).
Genotipe yang ditemukan untuk gen IGF2 ada 3 yaitu TT, TC dan CC. Hasil
genotyping gen IGF2 ditampilkan pada Gambar 1a.
SNP pada 3’UTR gen GHR dikenali menggunakan enzim restriksi Hin6 I
dengan situs pemotongan G|CGC. Berdasarkan hasil genotyping ditemukan
mutasi basa guanin (G) menjadi adenin (A) pada basa ke-178. Mutasi ini
merupakan mutasi transisi yang bersifat noncoding karena terjadi di daerah
3’UTR. Mutasi yang terjadi di noncoding region seperti upstream region,
downstream region dan intron disebut sebagai noncoding polymorphism.
Noncoding polymorphism umumnya disebabkan oleh seleksi alam (Hartl dan
Clark 1997). Genotipe yang ditemukan untuk gen GHR ada 3 yaitu GG, GA dan
AA. Hasil genotyping gen GHR ditampilkan pada Gambar 1b.
Gambar 1 Visualisasi hasil PCR-RFLP gen IGF2 (a) dan GHR (b) ayam kampung
pada gel agarose 2%; M adalah marker
Hasil PCR-RFLP diverifikasi melalui perunutan dan penyejajaran hasil
sekuensing gen IGF2 dan GHR pada ayam kampung dengan sekuen dari GenBank
dengan nomor akses NC_006092.3 untuk gen IGF2 dan NC_006127.3 untuk gen
8
GHR. Hasilnya menunjukan bahwa sekuen gen IGF2 dan GHR ayam kampung
pada penelitian ini dengan ayam hutan merah (red jungle fowl) pada GenBank
memiliki homologi yang tinggi dengan skor 730 bits dan 628 bits. Skor total
mengindikasikan tingkat kesamaan antar sekuen yang dibandingkan. Semakin
tinggi skor yang diperoleh (≥200) maka semakin tinggi kesamaan sekuen tersebut
(Posada 2009). Berdasarkan hasil sekuensing terbukti bahwa fragmen yang
dianalisis merupakan fragmen gen IGF2 dan GHR serta ditemukan posisi mutasi
TC pada basa ke-138 untuk gen IGF2 dan GA pada basa ke-178 untuk gen
GHR. Hasil sekuensing gen IGF2 dan GHR ditampilkan pada Gambar 2 dan 3.
Gambar 2 Perunutan sekuen gen IGF2 ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006092.3
9
Gambar 3 Perunutan sekuen gen GHR ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006127.3
Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Keragaman gen IGF2 dianalisis berdasarkan frekuensi genotipe dan alel
yang disajikan pada Tabel 2. Pada sekuen gen IGF2, frekuensi genotipe TC pada 4
populasi yaitu ayam kampung, pelung, persilangan kampung dengan ras pedaging
dan persilangan pelung dengan sentul lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Hal ini menunjukkan bahwa genotipe TC memiliki peluang kemunculan tertinggi
pada 4 populasi tersebut. Selanjutnya frekuensi genotipe CC pada 5 populasi
10
lainnya yaitu ayam sentul, merawang, ras pedaging, persilangan ras pedaging
dengan kampung dan persilangan sentul dengan kampung lebih tinggi
dibandingkan genotipe lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa genotipe CC
memiliki peluang kemunculan tertinggi pada 5 populasi tersebut. Amills et al.
(2003) melaporkan bahwa genotipe CC pada ayam black penedesenca juga lebih
tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Frekuensi alel gen IGF2 pada semua populasi ayam berkisar antara 0.480.90 untuk alel C dan 0.10-0.52 untuk alel T sehingga gen IGF2 pada semua
populasi ayam yang dianalisis bersifat polimorfik. Suatu alel bersifat polimorfik
apabila memiliki frekuensi alel kurang dari 0.99 (Hartl dan Clark 1997). Frekuensi
alel C pada semua populasi lebih tinggi dibandingkan alel T kecuali pada ayam
persilangan pelung dengan sentul. Alel C juga ditemukan sebagai alel yang
dominan pada populasi ayam black penedesenca (Amills et al. 2003).
Tabel 2 Frekuensi genotipe dan alel gen IGF2
Jenis Ayam
N
kampung
Pelung
persilangan kampung-ras pedaging
persilangan pelung-sentul
Sentul
merawang
ras pedaging
persilangan ras pedaging- kampung
persilangan sentul-kampung
131
23
41
22
34
18
10
16
18
Frekuensi Genotipe
TT
TC
CC
0.13 (17) 0.60 (78) 0.28 (36)
0.17 (4) 0.48 (11) 0.35 (8)
0.02 (1) 0.51 (21) 0.46 (19)
0.14 (3) 0.77 (17) 0.09 (2)
0.00 (0) 0.44 (15) 0.56 (19)
0.11 (2) 0.39 (7) 0.50 (9)
0.00 (0) 0.20 (2) 0.80 (8)
0.06 (1) 0.38 (6) 0.56 (9)
0.39 (7) 0.22 (4) 0.39 (7)
Frekuensi Alel
T
C
0.43
0.57
0.41
0.59
0.28
0.72
0.52
0.48
0.22
0.78
0.31
0.69
0.10
0.90
0.25
0.75
0.50
0.50
Keragaman gen GHR juga dianalisis berdasarkan frekuensi genotipe dan
alel yang disajikan pada Tabel 3. Frekuensi genotipe AA untuk gen GHR pada
semua populasi ayam lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya, kecuali pada
ayam ras pedaging. Hal ini menunjukan bahwa genotipe AA memiliki peluang
kemunculan tertinggi pada semua populasi yang dianalisis kecuali ayam ras
pedaging. Ouyang et al. (2008) melaporkan bahwa frekuensi genotipe AA pada
ayam xinghua persilangan juga lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Tabel 3 Frekuensi genotipe dan alel gen GHR
Jenis Ayam
kampung
pelung
sentul
merawang
persilangan kampung-ras pedaging
persilangan ras pedaging-kampung
persilangan pelung-sentul
persilangan sentul-kampung
ras pedaging
N
131
23
34
18
41
16
22
18
10
Frekuensi Genotipe
GG
GA
AA
0.09 (12) 0.06 (8) 0.85 (111)
0.00 (0) 0.00 (0) 1.00 (23)
0.00 (0) 0.00 (0) 1.00 (34)
0.06 (1) 0.11 (2) 0.83 (15)
0.22 (9) 0.29 (12) 0.49 (20)
0.31 (5) 0.31 (5) 0.38 (6)
0.00 (0) 0.00 (0) 1.00 (22)
0.00 (0) 0.06 (1) 0.94 (17)
0.80 (8) 0.20 (2) 0.00 (0)
Frekuensi Alel
G
A
0.12
0.88
0.00
1.00
0.00
1.00
0.11
0.89
0.37
0.63
0.47
0.53
0.00
1.00
0.03
0.97
0.90
0.10
Frekuensi alel untuk gen GHR pada semua populasi ayam berkisar antara
0.10-1.00 untuk alel A dan 0.00-0.90 untuk alel G. Hal ini menunjukkan bahwa
gen GHR tidak bersifat polimorfik pada semua populasi. Jika frekuensi alel
11
mencapai nilai 1, maka populasi bersifat monomorfik (Hartl dan Clark 1997).
Populasi yang bersifat monomorfik yaitu ayam pelung, sentul dan persilangan
pelung dengan sentul. Alel A juga ditemukan sebagai alel yang dominan pada
populasi ayam xinghua persilangan (Ouyang et al. 2008). Sifat polimorfik ini
penting untuk dianalisis karena merupakan salah satu syarat agar suatu gen dapat
dijadikan sebagai marker genetik (Hartl dan Clark 1997).
Heterozigositas dan Keseimbangan Gen IGF2 dan GHR
Tingkat keragaman gen IGF2 dan gen GHR dianalisis berdasarkan nilai
heterozigositas yang disajikan pada Tabel 4. Ditemukan 3 populasi dengan
keragaman gen IGF2 yang tinggi yaitu ayam persilangan pelung dengan sentul,
kampung dan persilangan kampung dengan ras pedaging, namun tidak ditemukan
populasi yang memiliki keragaman gen GHR yang tinggi. Sutau populasi
memiliki keragaman genetik yang tinggi jika memiliki nilai heterozigositas lebih
dari 0.5 (Allendorf dan Luikart 2007). Secara keseluruhan, keragaman gen IGF2
pada semua populasi lebih tinggi dibandingkan keragaman gen GHR. Dalam
bidang pemuliaan ternak, keragaman gen berguna untuk menentukan sistem
pemuliaan yang akan dilakukan yaitu seleksi atau persilangan (Noor 2010).
Tabel 4 Heterozigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg gen IGF2 dan GHR
Gen IGF2
Gen GHR
Jenis Ayam
N
Ho
He χ2 Ho
He χ2
persilangan pelung-sentul
22 0.77 0.50 * 0.00 0.00 kampung
131 0.60 0.49 * 0.06 0.21 *
persilangan kampung-ras pedaging
41 0.51 0.40 ns 0.29 0.47 *
pelung
23 0.48 0.48 ns 0.00 0.00 sentul
34 0.44 0.34 ns 0.00 0.00 merawang
18 0.39 0.43 ns 0.11 0.20 ns
persilangan ras pedaging-kampung
16 0.38 0.38 ns 0.31 0.50 ns
persilangan sentul-kampung
18 0.22 0.50 * 0.06 0.06 ns
ras pedaging
10 0.20 0.18 ns 0.20 0.18 ns
* = berbeda nyata pada taraf 5%; ns = tidak nyata
Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) gen IGF2 pada ayam merawang dan
persilangan sentul dengan kampung lebih rendah dari nilai heterozigositas harapan
(He), begitu pula gen GHR pada ayam persilangan ras pedaging dengan kampung,
persilangan kampung dengan ras pedaging, ras pedaging, merawang dan kampung.
Nilai Ho yang lebih kecil dari He dapat dijadikan indikasi adanya inbreeding
sebagai akibat dari seleksi yang intensif (Allendorf dan Luikart 2007). Hasil
penelitian ini menunjukan bahwa populasi yang dianalisis telah mengalami seleksi
terhadap gen GHR yang lebih intensif dibandingkan gen IGF2.
Keseimbangan populasi dapat diketahui melalui analisis keseimbangan
Hardy-Weinberg yang disajikan pada Tabel 4. Hasil penelitian berdasarkan
keragaman gen IGF2, semua populasi berada dalam keadaan seimbang kecuali
persilangan pelung dengan sentul, kampung dan persilangan sentul dengan
kampung, sedangkan berdasarkan keragaman gen GHR, populasi yang tidak
12
seimbang yaitu kampung dan persilangan kampung dengan ras pedaging.
Populasi dikatakan seimbang jika frekuensi alel dan genotipenya konstan dari
generasi ke generasi, dalam perhitungan jika nilai χ2 hitung lebih kecil dari χ2
tabel (Allendorf dan Luikart 2007). Ketidakseimbangan suatu populasi dapat
disebabkan oleh faktor non random mating, seleksi, migrasi, mutasi dan genetic
drift (Noor 2010).
Pertumbuhan Ayam Kampung
Capaian bobot badan ayam kampung disajikan pada Gambar 4. Ayam pada
penelitian ini diberi pakan yang mengandung PK 19.03% untuk starter dan
17.42% untuk grower. Protein yang diberikan telah sesuai dengan kebutuhan
ayam khususnya ayam petelur tipe ringan (NRC 1994; Leeson dan Summers
2005). Kebutuhan protein ayam yaitu 18-20% untuk starter serta 15-16% untuk
grower (NRC 1994; Leeson dan Summers 2005).
Pakan yang diberikan pada ayam juga mengandung EM 2 856 kkal/kg untuk
starter dan 2 801 kkal/kg untuk grower. Energi yang diberikan sedikit lebih
rendah dibandingkan kebutuhan energi ayam khususnya ayam petelur tipe ringan
berdasarkan NRC (1994) serta Leeson dan Summers (2005). Kebutuhan energi
ayam yaitu 2 850-2 900 kkal/kg untuk starter dan 2 850-2 900 kkal/kg untuk
grower (NRC 1994; Leeson dan Summers 2005). Meskipun energi yang diberikan
sedikit lebih rendah namun capaian bobot badan ayam pada penelitian ini tetap
tergolong baik yaitu mampu mencapai bobot badan 722.61±152.74 g pada umur
12 minggu dan 1088.39±241.92 g pada umur 16 minggu. Hasil ini sejalan dengan
Sulandari et al. (2007) yang melaporkan bahwa ayam kampung yang dipelihara
secara intensif dengan pemberian pakan mengandung PK 16-17% dan EM 2 900
kkal/kg akan mampu mencapai bobot 708 g pada umur 12 minggu. Terbukti
bahwa pakan yang diberikan pada penelitian ini sudah cukup baik dan
menghasilkan capaian bobot badan ayam yang baik pula.
Gambar 4 Capaian bobot badan ayam kampung selama 16 minggu
13
Asosiasi Keragaman Gen IGF2 dengan Pertumbuhan Ayam
Capaian bobot badan ayam kampung berdasarkan perbedaan genotipe gen
IGF2 disajikan pada Gambar 5. Grafik menunjukkan bahwa ketiga genotipe yaitu
TT, TC dan CC memiliki capaian bobot badan yang sama. Selanjutnya dilakukan
analisis statistik untuk mengetahui hubungan antara ketiga genotipe dengan sifat
pertumbuhan pada ayam kampung yang disajikan pada Tabel 5.
Gambar 5 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen IGF2 berbeda.
TC, CC.
TT,
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa ketiga genotipe yaitu TT, TC
dan CC tidak berasosiasi dengan PBB fase starter, PBB fase grower serta bobot
badan umur 12, 14 dan 16 minggu pada ayam kampung. Hasil ini berbeda dengan
Tang et al. (2010) yang melaporkan bahwa genotipe CC memberikan performa
terbaik untuk bobot badan umur 17 minggu pada ayam beijing you.
Tabel 5 Asosiasi gen IGF2 dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Genotipe Gen IGF2
Parameter
TT (9)
TC (34)
CC (13)
PBB 0-8 mg (g/8 mg)
445.32 ± 31.75
425.16 ± 16.18
434.77 ± 26.20
PBB 8-16 mg (g/8 mg)
536.82 ± 50.55
524.26 ± 25.77
494.49 ± 41.71
BB 12 mg (g)
742.34 ± 47.72
718.34 ± 24.33
740.17 ± 39.38
BB 14 mg (g)
808.94 ± 60.36
833.23 ± 30.78
827.96 ± 49.80
BB 16 mg (g)
1 116.74 ± 71.81 1 099.12 ± 36.62 1 078.73 ± 59.26
Tidak adanya asosiasi antara SNP yang ditemukan pada gen IGF2 dengan
sifat pertumbuhan ayam kampung dapat disebakan oleh jenis mutasi yang terjadi.
Mutasi yang terjadi pada gen IGF2 yang dianalisis merupakan mutasi basa timin
(T) menjadi sitosin (C). Amills et al. (2003) yang melakukan penelitian pada
ayam black penedesenca melaporkan bahwa mutasi tersebut merupakan mutasi
synonimus yang mengkode asam amino yang sama yaitu histidin sehingga tidak
14
memberikan pengaruh terhadap performa ayam. Fenomena ini juga dapat terjadi
pada ayam kampung, namun hal ini harus diverifikasi lebih lanjut melalui
sekuensing whole gene dari gen IGF2 ayam kampung.
Asosiasi Keragaman Gen GHR
Capaian bobot badan ayam kampung berdasarkan perbedaan genotipe gen
GHR disajikan pada Gambar 6. Grafik menunjukkan bahwa genotipe GA
memiliki capaian bobot badan yang lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Selanjutnya dilakukan analisis statistik untuk mengetahui hubungan antara ketiga
genotipe dengan sifat pertumbuhan pada ayam kampung yang disajikan pada
Tabel 6.
Gambar 6 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen GHR berbeda.
GA, GG.
AA,
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa ketiga genotipe yaitu GG, GA
dan AA tidak berasosiasi dengan PBB fase starter, PBB fase grower serta bobot
badan umur 12, 14 dan 16 minggu pada ayam kampung. Hasil ini berbeda dengan
Ouyang et al. (2008) yang melaporkan bahwa genotipe GA memberikan performa
terbaik untuk bobot badan umur 35-63 hari dan tebal lemak subkutan pada ayam
xinghua persilangan.
Tabel 6 Asosiasi gen GHR dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Genotipe Gen GHR
Parameter
GG (5)
GA (3)
AA (48)
PBB 0-8 mg (g/8 mg)
426.00 ± 43.97
371.06 ± 55.68
435.01 ± 13.52
PBB 8-16 mg (g/8 mg)
590.63 ± 69.00
620.50 ± 87.38
505.62 ± 21.21
BB 12 mg (g)
732.40 ± 66.20
641.43 ± 83.83
732.44 ± 20.35
BB 14 mg (g)
868.76 ± 84.23
814.58 ± 106.67
825.16 ± 25.89
BB 16 mg (g)
1 156.69 ± 99.83 1 155.31 ± 126.42 1 087.49 ± 30.69
15
Salah satu faktor yang dapat menyebabkan perbedaan ini adalah adanya
mekanisme post-transcriptional yang berbeda pada gen GHR ayam kampung dan
ayam xinghua persilangan. SNP yang ditemukan pada gen GHR terletak di bagian
3’UTR yang memiliki peran penting dalam proses post-transcriptional. Pada
daerah 3’UTR terdapat sekuen yang berkomplementer dengan microRNA
(miRNA) seperti K box, Brd box dan GY box (Lai 2002). miRNA mempengaruhi
post-transcriptional ekspresi gen melalui pengaturan proses translasi dan stabilitas
mRNA. Pada mamalia, miRNA diprediksi mengontrol lebih dari 30% proteincoding gene. Melalui mekanisme pairing dengan mRNA, miRNA dapat
mempengaruhi translational repression dan degradasi mRNA (Filipowicz et al.
2008).
Asosiasi SNP Kombinasi
Frekuensi genotipe SNP kombinasi gen IGF2 dan GHR disajikan pada
Tabel 7. Hasil menunjukkan bahwa kombinasi TCAA memiliki frekuensi yang
tertinggi dibandingkan kombinasi lainnya. Hal ini memiliki arti bahwa kombinasi
TCAA memiliki peluang kemunculan tertinggi pada populasi ayam kampung.
Tabel 7 Frekuensi genotipe SNP kombinasi gen IGF2 dan GHR ayam kampung
Genotipe Gen IGF2
Genotipe Gen
GHR
TT
TC
CC
GG
0.02 (1)*
0.07 (4)
0.00 (0)*
GA
0.02 (1)*
0.04 (2)
0.00 (0)*
AA
0.13 (7)
0.50 (28)
0.23 (13)
* tidak diikutkan dalam analisis statistik untuk asosiasi karena n
TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN
PADA AYAM LOKAL
RIA PUTRI RAHMADANI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Hubungan Keragaman
Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat Pertumbuhan pada Ayam Lokal adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2015
Ria Putri Rahmadani
NIM D151140496
RINGKASAN
RIA PUTRI RAHMADANI. Hubungan Keragaman Gen IGF2 dan GHR terhadap
Sifat Pertumbuhan pada Ayam Lokal. Dibimbing oleh CECE SUMANTRI, SRI
DARWATI dan NIKEN ULUPI.
Ayam lokal merupakan salah satu ternak lokal yang berpotensi untuk
dikembangkan sebagai sumber penghasil daging di Indonesia. Ayam lokal
memiliki keunggulan mampu beradaptasi pada lingkungan tropis serta memiliki
sistem imun yang kuat namun kelemahannya yaitu laju pertumbuhan yang lambat.
Perkembangan teknologi molekuler dapat dimanfaatkan sebagai salah satu metode
seleksi berbasis MAS (Marker Assissted Selection) yang diperoleh melalui
identifikasi gen-gen utama yang mengontrol sifat pertumbuhan pada ayam seperti
gen IGF2 (Insuline-like Growth Factor 2) dan GHR (Growth Hormone Receptor).
Penelitian ini bertujuan menganalisis keragaman gen IGF2 dan GHR pada
beberapa populasi ayam lokal dan memahami hubungan keragaman gen-gen
tersebut dengan sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Penelitian terdiri dari 2 tahap yaitu analisis keragaman gen IGF2 dan GHR
pada beberapa populasi ayam serta asosiasi keragaman kedua gen terhadap sifat
pertumbuhan pada ayam kampung. Ayam yang digunakan sebagai sumber DNA
untuk analisis keragaman sebanyak 313 ekor terdiri dari 9 populasi yaitu ayam
kampung, pelung, sentul, merawang, ras pedaging, persilangan kampung dengan
ras pedaging, persilangan ras pedaging dengan kampung, persilangan pelung
dengan sentul dan persilangan sentul dengan kampung. Ayam kampung yang
digunakan untuk analisis asosiasi sebanyak 56 ekor yang dipelihara dari DOC
hingga umur 16 minggu. Genotyping dilakukan menggunakan metode PCR-RFLP
(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fargment Length Polymorphism).
Analisis data yang dilakukan yaitu frekeunsi genotipe, frekuensi alel,
heterozigositas, keseimbangan Hardy-Weinberg dan asosiasi data genotipe dengan
fenotipe menggunakan GLM (General Linear Model).
Hasil menunjukkan terdapat mutasi TC pada gen IGF2 dan mutasi GA
pada gen GHR. Gen IGF2 pada semua populasi ayam bersifat polimorfik. Gen
GHR bersifat monomorfik pada ayam pelung, sentul dan persilangan pelung
dengan sentul. Gen IGF2 pada ayam persilangan pelung dengan sentul, kampung,
dan persilangan kampung dengan ras pedaging memiliki keragaman yang tinggi
sedangkan pada gen GHR tidak ditemukan populasi dengan keragaman yang
tinggi. Tidak ditemukan asosiasi antara keragaman gen IGF2 dan GHR terhadap
sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Kata kunci: ayam lokal, gen IGF2, gen GHR, keragaman, sifat pertumbuhan
SUMMARY
RIA PUTRI RAHMADANI. Association of IGF2 and GHR Genes Polymorphism
with Growth Traits in Local Chicken. Supervised by CECE SUMANTRI, SRI
DARWATI and NIKEN ULUPI.
Local chicken is one of local genetic resources which is potential to be
developed as meat producer in Indonesia. Local chicken has some superiority
such as adapted in tropic and strong immune system but local chicken still has a
weakness which is slow growth. Moleculer technique can be used as one of
selection method based on MAS (Marker Assisted Selection) which can be
determined by identification of major genes that control growth in chicken such as
IGF2 (Insuline-like Growth Factor 2) and GHR (Growth Hormone Receptor)
genes. This study aimed to analyze the polymorphism of IGF2 and GHR genes in
some local chicken populations and the association with growth traits in kampung
chicken.
Research consisted of two steps namely analysis of IGF2 and GHR genes
polymorphimsm in some chicken populations and association of IGF2 and GHR
genes with growth traits in kampung chicken. A total of 313 head of chickens
from nine populations consisted of kampung, pelung, sentul, merawang,
commercial meat type and the crossbred of kampung-commercial meat type,
commercial meat type-kampung, pelung-sentul, and sentul-kampung chickens
were used as DNA resources for polymorphism analysis. A total of 56 head of
kampung chickens were used as matery for association analysis. Genotyping was
done by PCR-RFLP method (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fargment
Length Polymorphism). The data analysis were genotype frequency, allele
frequency, heterozigosity, Hardy-Weinberg equilibrium and association of
genotype and phenotype using GLM (General Linear Model).
Result showed there were TC mutation on IGF2 gene and GA mutation
on GHR gene. IGF2 gene in all population was polymorphic. GHR gene was
monomorphic in pelung, sentul and the crossbreed of pelung-sentul chickens.
IGF2 gene had high heterozigosity in the crossbred of pelung-sentul, kampung
and crossbred of kampung-commercial meat type whereas there was no
population with high heterozigosity on GHR gene. The association analysis
showed there was no association between IGF2 and GHR genes polymorphism
with growth traits in kampung chicken.
Key words: GHR gene, growth traits, IGF2 gene, local chicken, polymorphism
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
HUBUNGAN KERAGAMAN GEN IGF2 DAN GHR
TERHADAP SIFAT PERTUMBUHAN
PADA AYAM LOKAL
RIA PUTRI RAHMADANI
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Rita Mutia, MAgr
PRAKATA
Puji dan syukur kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya
sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih pada penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan Juli 2014 hingga Maret 2015 ini adalah ayam lokal
Indonesia dengan judul Hubungan Keragaman Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat
Pertumbuhan pada Ayam Lokal.
Penulis menyadari bahwa penulis tidak akan bisa menyelesaikan tesis ini
tanpa bantuan dari berbagai pihak. Penulis ucapkan terimakasih kepada Bapak
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc, Ibu Dr Ir Sri Darwati, MSi dan Ibu Dr Ir Niken
Ulupi, MS sebagai dosen pembimbing atas segala curahan waktu, bimbingan,
semangat dan motivasi yang selalu diberikan kepada penulis sejak penulis
menempuh pendidikan sarjana hingga menyelesaikan program magister. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Dr Ir Rita Mutia, MAgr atas kesediaannya
menjadi penguji luar komisi pada ujian sidang tesis penulis dan atas masukan
serta saran untuk perbaikan tesis ini.
Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan sebesar-besarnya kepada
mama (Sri Maharani Almh), papa (Syaiful Firmadi Alm), oma (Warnius), opa
(Murice Alm), adik-adik (Irfan dan Adit) serta seluruh keluarga atas segala doa,
kasih sayang dan semangat yang selalu diberikan kepada penulis sejak kecil
hingga saat ini. Semoga Allah senantiasa mempersatukan kita di dunia dan di
surga-Nya kelak.
Penulis juga menyampaikan terimakasih kepada rekan-rekan di
Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak yaitu Pak Dadang, Kak Eryk, Kak
Shelvi, Kak Isyana, Kak Alit, Kak Furqon, Kak Pandu, Kak Roaslein, Rindang,
Mujo, Hadi, Riri dan Mustika atas persahabatannya dan bantuan yang diberikan
selama penelitian berlangsung. Terima kasih juga kepada saudari-saudari di Kos
Menjemput Hidayah yaitu Puspita, Nisa, Lita dan Dita atas persaudaraannya
selama 5 tahun ini. Terimakasih kepada teman-teman IPTP 47 khususnya sahabat
terbaik Anita, Ica, Laras, dan Ishfi atas segala persahabatan, motivasi, bantuan dan
dukungan yang selama ini diberikan. Kepada Mohamad Jafar Sidiq, terimakasih
penulis ucapkan atas semua kebaikan, kesabaran dan kasih sayang yang selama ini
diberikan sehingga penulis tidak pernah merasa sendiri.
Terimakasih kepada DIKTI yang telah memberikan beasiswa Fresh
Graduate selama penulis menempuh pendidikan magister. Kepada semua pihak
yang telah membantu yang tidak dapat penulis sebutkan satu-persatu, terimakasih
atas segalanya. Semoga Allah memberikan kelimpahan berkah, pahala dan
balasan yang terbaik atas semua kasih sayang, dukungan, curahan waktu dan
kebaikan lainnya yang diberikan kepada penulis. Semoga karya ilmiah ini
bermanfaat.
Bogor, Juli 2015
Ria Putri Rahmadani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
2
2
2
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian Tahap I : Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Penelitian Tahap II : Asosiasi Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat
Pertumbuhan Ayam Kampung
2
2
2
5
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Genotyping Gen IGF2 dan GHR
Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Heterozigositas dan Keseimbangan Gen IGF2 dan GHR
Pertumbuhan Ayam Kampung
7
7
9
11
12
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
16
16
16
DAFTAR PUSTAKA
17
DAFTAR TABEL
1
2
3
4
5
6
7
8
Komposisi nutrisi pakan ayam kampung
Frekuensi genotipe dan alel gen IGF2
Frekuensi genotipe dan alel gen GHR
Heterozigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg gen IGF2 dan
GHR
Asosiasi gen IGF2 dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Asosiasi gen GHR dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Frekuensi genotipe SNP kombinasi gen IGF2 dan GHR ayam kampung
Asosiasi gen GHR dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
6
10
10
11
13
14
15
15
DAFTAR GAMBAR
1 Visualisasi hasil PCR-RFLP gen IGF2 (a) dan GHR (b) ayam kampung
pada gel agarose 2%; M adalah marker
2 Perunutan sekuen gen IGF2 ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006092.3
3 Perunutan sekuen gen GHR ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006127.3
4 Capaian bobot badan ayam kampung selama 16 minggu
5 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen IGF2 berbeda
6 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen GHR berbeda
7
8
9
12
13
14
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Daging merupakan salah satu produk peternakan yang permintaannya
meningkat setiap tahun. Pada tahun 2012 ke 2013 terjadi peningkatan permintaan
daging dari 2 658 123 ton menjadi 2 880 340 ton atau meningkat sebesar 8.36%.
Pada tahun 2013, sebanyak 67.03% permintaan daging dipenuhi dari daging
unggas yang terdiri dari ayam ras pedaging 52%, ayam lokal 11.10%, ayam ras
petelur 2.68% dan itik 1.26% (BPS 2014). Industri ayam ras pedaging
memberikan kontribusi yang besar dalam memenuhi permintaan daging nasional,
namun industri ini memiliki kelemahan yaitu bergantung pada pasokan bibit dan
bahan baku pakan dari luar negeri sehingga tidak dapat mendukung kemandirian
pangan di Indonesia (Nataamijaya 2010). Kemandirian pangan dapat dicapai
melalui usaha-usaha pemuliaan dan pengembangan ternak lokal unggul. Ayam
lokal merupakan salah satu ternak lokal yang berpotensi untuk dikembangkan
sebagai sumber penghasil daging di Indonesia.
Ayam lokal memiliki keunggulan dibandingkan ayam ras pedaging yaitu
mampu beradaptasi pada lingkungan tropis (Zein dan Sulandari 2012) serta
memiliki sistem imun yang kuat terhadap infeksi bakteri dan virus (Ulupi et al.
2013; Ulupi et al. 2014; dan Pagala et al. 2013), namun memiliki kelemahan yaitu
laju pertumbuhan yang lambat (Nataamijaya 2010). Salah satu cara untuk
meningkatkan laju pertumbuhan ayam lokal yaitu melalui seleksi terhadap sifat
pertumbuhan. Perkembangan teknologi molekuler dapat dimanfaatkan sebagai
salah satu metode seleksi berbasis MAS (Marker Assissted Selection) yang
terbukti dapat meningkatkan respon seleksi pada keturunan (Sartika et al. 2004).
MAS dapat diperoleh melalui identifikasi gen-gen utama yang mengontrol sifat
pertumbuhan pada ayam seperti gen IGF2 (Insuline-like Growth Factor 2) dan
GHR (Growth Hormone Receptor).
Gen IGF2 terletak pada kromosom 5 terdiri dari 4 exon dan 3 intron dengan
ukuran 1 936 pb dan mengkode 226 asam amino (Ensembl nomor akses:
00000006555). Keragaman gen IGF2 diketahui berasosiasi positif dengan bobot
badan dan bobot karkas umur 17 minggu pada ayam beijing you (Tang et al.
2010) serta konsentrasi plasma IGF2 pada ayam black penedesenca (Amills et al.
2003). IGF2 berfungsi sebagai promotor pertumbuhan melalui proliferasi sel dan
amplifier fisiologis dari sekresi glucose mediated insulin (Zhou et al. 1995).
Beberapa penelitian membuktikan bahwa konsentrasi plasma IGF2 dalam darah
ayam tidak dipengaruhi oleh status nutrisi (Kita et al. 1996; McMurty et al. 1998).
Gen GHR terletak pada kromosom Z terdiri dari 10 exon dan 9 intron
dengan ukuran 2 468 pb dan mengkode 608 asam amino (Ensembl nomor akses:
00000014855). Keragaman gen GHR diketahui berasosiasi positif dengan bobot
tetas, bobot umur 35-63 hari dan tebal lemak subkutan pada ayam xinghua
persilangan (Ouyang et al. 2008). Gen GHR pada ayam memiliki keunikan karena
adanya bagian exon 3 yang hilang menyebabkan perbedaan panjang mRNA yaitu
5.5, 4.3, 3.2 and 0.8 kb (Tanaka et al. 1995; Mao et al. 1997). GHR memiliki
fungsi sebagai reseptor GH, terlibat dalam regulasi pertumbuhan setelah kelahiran
2
serta reservoir GH dalam plasma darah sehingga dapat menjadi modulator atau
inhibitor bagi kerja GH (Isaksson et al. 1985).
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisis keragaman gen IGF2 dan GHR pada
beberapa populasi ayam lokal dan menganalisis hubungan keragaman gen-gen
tersebut dengan sifat pertumbuhan pada ayam kampung.
Manfaat Penelitian
Hasil identifikasi gen IGF2 dan GHR pada beberapa populasi ayam lokal
diharapkan dapat memberikan informasi mengenai keragaman genetik ayam lokal
Indonesia. Asosiasi keragaman gen-gen tersebut dengan sifat pertumbuhan dapat
dijadikan model untuk penentuan seleksi pada ayam kampung melalui penerapan
MAS.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian terdiri dari 2 tahap yaitu identifikasi keragaman gen IGF2 dan
GHR pada 9 populasi ayam lokal dan persilangan serta asosiasi keragaman kedua
gen terhadap sifat pertumbuhan pada ayam kampung. Keragaman kedua gen
diidentifikasi menggunakan metode PCR-RFLP untuk menemukan SNP pada
masing-masing gen. Asosiasi keragaman genotipe kedua gen dianalisis terhadap
laju pertumbuhan dan bobot badan pada ayam kampung.
2 METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian terdiri dari 2 tahap yaitu analisis keragaman gen IGF2 dan GHR
pada 9 populasi ayam serta asosiasi keragaman gen IGF2 dan GHR terhadap sifat
pertumbuhan pada ayam kampung. Analisis keragaman gen dilakukan di
Laboratorium Genetika Molekuler Ternak sedangkan pemeliharaan dan
pengukuran sifat pertumbuhan ayam kampung dilakukan di Laboratorium Lapang,
Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan selama 8
bulan dari Juli 2014 hingga Maret 2015.
Penelitian Tahap I : Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Penelitian tahap I dilakukan untuk mengetahui keragaman gen IGF2 dan
GHR dalam tingkat populasi. Penelitian terdiri dari pengambilan sampel darah,
3
ekstraksi DNA, PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment
Length Polymorphism), elektroforesis dan analisis data.
Sampel
Ayam yang digunakan sebagai sumber DNA sebanyak 313 ekor terdiri dari
9 populasi yaitu ayam kampung (131 ekor), pelung (23 ekor), sentul (34 ekor),
merawang (18 ekor), ras pedaging (10 ekor), persilangan kampung dengan ras
pedaging (41 ekor), persilangan ras pedaging dengan kampung (16 ekor),
persilangan pelung dengan sentul (22 ekor) dan persilangan sentul dengan
kampung (18 ekor). Ayam merupakan koleksi Laboratorium Pemuliaan dan
Gentetika Ternak IPB.
Pengambilan Sampel Darah
Bagian sayap ayam di sekitar vena axillaris dibersihkan dari bulu dan
kotoran menggunakan alkohol 70% kemudian darah diambil menggunakan spuit.
Darah yang telah diambil dimasukan ke dalam tabung ependorf 1.5 mL yang telah
diisi dengan EDTA (etilen diamin tetra asetat). Darah dihomogenkan segera agar
tidak beku. Sampel kemudian disimpan dalam refrigerator dengan suhu 4 ºC
untuk kemudian dianalisis.
Ekstraksi DNA
Metode ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan Sambrook et al. (1989).
Sebanyak 20 µL sampel darah dimasukan ke dalam tabung ependorf 1.5 mL,
kemudian ditambahkan 1 000 µL NaCl (natrium klorida) 0.2%, dihomogenkan,
didiamkan selama 5 menit lalu disentrifugasi pada kecepatan 8 000 rpm selama 5
menit pada suhu ruang. Bagian supernatan yang terbentuk dibuang.
Sebanyak 40 µL SDS (sodium dodesil sulfat) 10%, 10 µL proteinase 5 mg
-1
mL dan 1 x STE (sodium tris EDTA) ditambahkan sampai 400 µL kemudian
dikocok pelan dalam inkubator suhu 55 ºC selama 2 jam. Sebanyak 400 µL fenol,
400 µL CIAA (klorofom iso amil alkohol) dan 40 µL NaCl 5 M ditambahkan lalu
dikocok pada suhu ruang selama 1 jam dan disentrifugasi pada kecepatan 12 000
rpm selama 5 menit. Bagian DNA (bening) dipindahkan sebanyak 400 µL,
ditambahkan 800 µL ETOH (etanol alkohol) absolut dan 40 µL NaCl 5M lalu
dilakukan freezing over night.
Sampel yang telah didiamkan dalam freezer kemudian didiamkan pada suhu
ruang lalu disentrifugasi pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit. Bagian
supernatan dibuang lalu ditambahkan 800 µL ETOH 70% dan disentrifugasi pada
kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit kemudian bagian supernatan dibuang
kembali. Sampel didiamkan di ruang terbuka sampai alkohol kering lalu sebanyak
100 µL TE (tris elusion) 80% ditambahkan kemudian DNA dapat disimpan dalam
freezer sampai akan digunakan.
PCR-RFLP
Primer yang digunakan yaitu primer forward 5’-GCTGGGGACCCAATAG
AACC-3’ dan reverse 5’-TCCCCAGGAGATCACAAATCG-3’ untuk gen IGF2
serta primer forward 5’-GGGAACTGAGCATGAAAGTG-3’ dan reverse 5’-CC
ATAAGAAAGCAACAGGATCG-3’ untuk gen GHR. Primer diencerkan
menggunakan TE primer sesuai komposisi yang ditentukan. Sebanyak 25 µL
4
forward dicampur degan 25 µL reverse lalu ditambahkan 50 µL DW dalam
tabung ependorf 1.5 mL kemudian disentrifugasi. Mix larutan PCR dibuat dengan
campuran primer, GoTaq® Green Master Mix (Promega) dan DW (air destilasi)
sesuai dengan perhitungan jumlah sampel yang akan diamplifikasi lalu mix
dihomogenkan dan disentrifugasi. Sampel dimasukkan ke dalam tabung 0.2 mL
sebanyak 2 µL lalu ditambahkan mix sebanyak 14 µL kemudian dimasukan ke
dalam mesin thermocycler (Eppendorf® AG 22331) dengan suhu penempelan
primer 60 ºC untuk gen IGF2 dan 62 ºC untuk gen GHR.
Larutan untuk RFLP dibuat dengan campuran DW, buffer (G dan tango) dan
enzim restriksi (Nla III dan Hin6 I) sesuai dengan perhitungan jumlah sampel
yang akan dipotong lalu dihomogenkan dan disentrifugasi. Sampel sebanyak 5 µL
dimasukan ke dalam tabung 0.5 mL lalu ditambahkan mix sebanyak 2 µL lalu
disentrifugasi dan diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 ºC.
Elektroforesis
Hasil analisis dielektroforesis dengan persentase gel agarose yang berbeda.
Sampel hasil ekstraksi dielektroforesis dengan gel agarose 1%, hasil amplifikasi
dielektroforesis dengan gel agarose 1.5% dan hasil pemotongan dielektroforesis
dengan gel agarose 2%. Gel ditunggu hingga mengeras selama 10 menit.
Sebanyak 5 µL sampel dimasukkan ke dalam sumur sel. Sumur yang
pertama diisi DNA pengukur yang berukuran 100 pb. Elektroforesis dilakukan
menggunakan tank elektroforesis (Mupid) dengan arus 100 V selama 30 menit
lalu divisualisasi menggunakan UV transilluminator (AlphaImager® EP).
Analisis Data
Analisis data keragaman gen terdiri dari frekueinsi genotipe dan alel,
heterozigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg. Setiap analisis data
selanjutnya dijelaskan sebagai berikut.
Frekuensi genotipe dan frekuensi alel
Frekuensi genotipe merupakan proporsi suatu genotipe relatif terhadap
semua genotipe dalam populasi (Noor 2010). Frekuensi genotipe dihitung
berdasarkan Nei dan Kumar (2000) dengan rumus sebagai berikut:
x =
n
N
x =
n + ∑n
N
Frekuensi alel merupakan proporsi suatu alel relatif terhadap semua alel
dalam populasi (Noor 2010). Frekuensi alel dihitung berdasarkan Nei dan
Kumar (2000) dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
xii = frekuensi genotipe ke- ii
xi
= frekuensi alel ke- i
nii = jumlah individu bergenotipe ii
5
nij
N
=
=
jumlah individu bergenotipe ij
jumlah sampel
Heterozigositas
Keragaman genetik diketahui melalui perkiraan nilai heterozigositas.
Heterozigositas pengamatan diperoleh dengan rumus sebagai berikut (Nei
dan Kumar 2000):
Ho = ∑
≠
n
N
Heterozigositas harapan (He) berdasarkan frekuensi alel
menggunakan rumus sebagai berikut (Nei dan Kumar 2000):
He =
dihitung
q
− ∑x
=
Keterangan:
Ho = heterozigositas pengamatan
nij = frekuensi alel ke- i
N
= jumlah individu bergenotipe ii
He = jumlah individu bergenotipe ij
xi² = jumlah sampel
q
= jumlah alel
Keseimbangan Hardy-Weinberg
Keseimbangan Hardy-Weinberg untuk mengetahui keseimbangan populasi.
Keseimbangan Hardy-Weinberg dapat diketahui menggunakan perhitungan
nilai chi-kuadrat (Hartl dan Clark 1997):
χ =∑
O−E
E
Keterangan:
χ 2 = chi-kuadrat
O
= jumlah genotipe pengamatan
E
= jumlah genotipe harapan
Penelitian Tahap II : Asosiasi Gen IGF2 dan GHR terhadap Sifat
Pertumbuhan Ayam Kampung
Penelitian tahap II dilakukan untuk mengetahui hubungan SNP yang
diperoleh terhadap beberapa sifat pertumbuhan pada ayam kampung. Penelitian
terdiri dari pemeliharaan, pengambilan data dan analisis data.
6
Sampel
Sebanyak 56 ekor DOC ayam kampung dipelihara selama 16 minggu.
Rataan bobot DOC ayam kampung yang digunakan adalah 41.58±4.07 g dengan
koefisien keragaman 9.80%.
Pemeliharaan
Pemeliharaan diawali dengan persiapan kandang yang terdiri dari sanitasi
dan fumigasi. Selanjutnya ayam pada fase starter (0-8 minggu) dipelihara dalam
kandang kelompok yang dibagi menjadi 8 koloni. Ayam pada fase grower (8-16
minggu) dipindahkan ke kandang kelompok yang dibagi menjadi 3 koloni.
Pakan dan air minum disediakan ad libitum. Pakan yang diberikan terdiri
dari campuran pakan ayam pedaging komersial (BR-21E diproduksi oleh PT.
Sinta Prima Feedmill dengan PK 20-22%) dan dedak padi (diperoleh dari salah
satu penggilingan padi di Kecamatan Semplak, Kota Bogor). Hasil analisis
kandungan gizi pakan disajikan pada Tabel 1. Ayam pada fase starter diberikan
campuran pakan komersial dan dedak padi dengan perbandingan 80:20 sedangkan
pada fase grower diberikan pakan campuran dengan perbandingan 60:40.
Tabel 1 Komposisi nutrisi pakan ayam kampung
Kandungan Gizi
Pakan Campuran
Pakan Campuran
Starter*
Grower*
Energi bruto (kkal/kg)
4 080.00
4 001.00
Protein kasar (%)
19.03
17.42
Lemak kasar (%)
5.98
6.46
Serat kasar (%)
5.19
6.61
Kalsium (%)
1.39
1.13
Fosfor (%)
0.89
0.79
* Hasil analisis Laboratorium Ilmu dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, IPB (2015)
Pengambilan Data
Pengambilan data bobot badan ayam dilakukan setiap minggu dari DOC
hingga umur 16 minggu. Parameter pertumbuhan yang diamati yaitu pertambahan
bobot badan (PBB) fase starter, grower, bobot badan umur 12, 14 dan 16 minggu.
PBB fase starter dihitung sebagai selisih bobot badan umur 8 dengan 0 minggu
dan PBB fase grower sebagai selisih bobot badan umur 16 dengan 8 minggu.
Analisis Data
Pengaruh perbedaan genotipe gen IGF2 dan GHR terhadap sifat
pertumbuhan pada ayam kampung dianalisis dengan prosedur GLM (General
Linear Model) pada program SAS (SAS 9.1) menggunakan analisis ragam
(ANOVA) dengan model sebagai berikut:
Y = μ+G +S +Ɛ
Keterangan:
Yijk = parameter pertumbuhan
µ
= rataan umum
Gi
= pengaruh genotipe ke-i
Sj
= pengaruh jenis kelamin ke-j
Ɛijk = pengaruh acak genotipe ke-i, jenis kelamin ke-j dan ulangan ke-k
7
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Genotyping Gen IGF2 dan GHR
Bagian exon 4 dari gen IGF2 dan bagian 3’UTR dari gen GHR berhasil
diamplifikasi dan menghasilkan produk PCR masing-masing 395 pb dan 340 pb.
Ditemukan satu SNP (Single Nucleotide Polymorphism) pada masing-masing gen.
SNP pada exon 4 gen IGF2 dikenali menggunakan enzim restriksi Nla III dengan
situs pemotongan CATG|. Berdasarkan hasil genotyping ditemukan mutasi basa
timin (T) menjadi sitosin (C) pada basa ke-138. Mutasi terjadi karena adanya
kesalahan (mispairing) basa-basa nukleotida selama proses replikasi DNA
sehingga menghasilkan sekuen baru (Graur dan Li 2000). Mutasi ini merupakan
mutasi transisi yaitu perubahan basa antar basa pirimidin dan bersifat synonimus
karena tidak menyebabkan perubahan asam amino (Hartl dan Clark 1997). Kedua
basa tersebut mengkode asam amino yang sama yaitu histidin (Amills et al. 2003).
Genotipe yang ditemukan untuk gen IGF2 ada 3 yaitu TT, TC dan CC. Hasil
genotyping gen IGF2 ditampilkan pada Gambar 1a.
SNP pada 3’UTR gen GHR dikenali menggunakan enzim restriksi Hin6 I
dengan situs pemotongan G|CGC. Berdasarkan hasil genotyping ditemukan
mutasi basa guanin (G) menjadi adenin (A) pada basa ke-178. Mutasi ini
merupakan mutasi transisi yang bersifat noncoding karena terjadi di daerah
3’UTR. Mutasi yang terjadi di noncoding region seperti upstream region,
downstream region dan intron disebut sebagai noncoding polymorphism.
Noncoding polymorphism umumnya disebabkan oleh seleksi alam (Hartl dan
Clark 1997). Genotipe yang ditemukan untuk gen GHR ada 3 yaitu GG, GA dan
AA. Hasil genotyping gen GHR ditampilkan pada Gambar 1b.
Gambar 1 Visualisasi hasil PCR-RFLP gen IGF2 (a) dan GHR (b) ayam kampung
pada gel agarose 2%; M adalah marker
Hasil PCR-RFLP diverifikasi melalui perunutan dan penyejajaran hasil
sekuensing gen IGF2 dan GHR pada ayam kampung dengan sekuen dari GenBank
dengan nomor akses NC_006092.3 untuk gen IGF2 dan NC_006127.3 untuk gen
8
GHR. Hasilnya menunjukan bahwa sekuen gen IGF2 dan GHR ayam kampung
pada penelitian ini dengan ayam hutan merah (red jungle fowl) pada GenBank
memiliki homologi yang tinggi dengan skor 730 bits dan 628 bits. Skor total
mengindikasikan tingkat kesamaan antar sekuen yang dibandingkan. Semakin
tinggi skor yang diperoleh (≥200) maka semakin tinggi kesamaan sekuen tersebut
(Posada 2009). Berdasarkan hasil sekuensing terbukti bahwa fragmen yang
dianalisis merupakan fragmen gen IGF2 dan GHR serta ditemukan posisi mutasi
TC pada basa ke-138 untuk gen IGF2 dan GA pada basa ke-178 untuk gen
GHR. Hasil sekuensing gen IGF2 dan GHR ditampilkan pada Gambar 2 dan 3.
Gambar 2 Perunutan sekuen gen IGF2 ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006092.3
9
Gambar 3 Perunutan sekuen gen GHR ayam kampung dengan sekuen dari
GenBank nomor akses NC_006127.3
Keragaman Gen IGF2 dan GHR
Keragaman gen IGF2 dianalisis berdasarkan frekuensi genotipe dan alel
yang disajikan pada Tabel 2. Pada sekuen gen IGF2, frekuensi genotipe TC pada 4
populasi yaitu ayam kampung, pelung, persilangan kampung dengan ras pedaging
dan persilangan pelung dengan sentul lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Hal ini menunjukkan bahwa genotipe TC memiliki peluang kemunculan tertinggi
pada 4 populasi tersebut. Selanjutnya frekuensi genotipe CC pada 5 populasi
10
lainnya yaitu ayam sentul, merawang, ras pedaging, persilangan ras pedaging
dengan kampung dan persilangan sentul dengan kampung lebih tinggi
dibandingkan genotipe lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa genotipe CC
memiliki peluang kemunculan tertinggi pada 5 populasi tersebut. Amills et al.
(2003) melaporkan bahwa genotipe CC pada ayam black penedesenca juga lebih
tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Frekuensi alel gen IGF2 pada semua populasi ayam berkisar antara 0.480.90 untuk alel C dan 0.10-0.52 untuk alel T sehingga gen IGF2 pada semua
populasi ayam yang dianalisis bersifat polimorfik. Suatu alel bersifat polimorfik
apabila memiliki frekuensi alel kurang dari 0.99 (Hartl dan Clark 1997). Frekuensi
alel C pada semua populasi lebih tinggi dibandingkan alel T kecuali pada ayam
persilangan pelung dengan sentul. Alel C juga ditemukan sebagai alel yang
dominan pada populasi ayam black penedesenca (Amills et al. 2003).
Tabel 2 Frekuensi genotipe dan alel gen IGF2
Jenis Ayam
N
kampung
Pelung
persilangan kampung-ras pedaging
persilangan pelung-sentul
Sentul
merawang
ras pedaging
persilangan ras pedaging- kampung
persilangan sentul-kampung
131
23
41
22
34
18
10
16
18
Frekuensi Genotipe
TT
TC
CC
0.13 (17) 0.60 (78) 0.28 (36)
0.17 (4) 0.48 (11) 0.35 (8)
0.02 (1) 0.51 (21) 0.46 (19)
0.14 (3) 0.77 (17) 0.09 (2)
0.00 (0) 0.44 (15) 0.56 (19)
0.11 (2) 0.39 (7) 0.50 (9)
0.00 (0) 0.20 (2) 0.80 (8)
0.06 (1) 0.38 (6) 0.56 (9)
0.39 (7) 0.22 (4) 0.39 (7)
Frekuensi Alel
T
C
0.43
0.57
0.41
0.59
0.28
0.72
0.52
0.48
0.22
0.78
0.31
0.69
0.10
0.90
0.25
0.75
0.50
0.50
Keragaman gen GHR juga dianalisis berdasarkan frekuensi genotipe dan
alel yang disajikan pada Tabel 3. Frekuensi genotipe AA untuk gen GHR pada
semua populasi ayam lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya, kecuali pada
ayam ras pedaging. Hal ini menunjukan bahwa genotipe AA memiliki peluang
kemunculan tertinggi pada semua populasi yang dianalisis kecuali ayam ras
pedaging. Ouyang et al. (2008) melaporkan bahwa frekuensi genotipe AA pada
ayam xinghua persilangan juga lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Tabel 3 Frekuensi genotipe dan alel gen GHR
Jenis Ayam
kampung
pelung
sentul
merawang
persilangan kampung-ras pedaging
persilangan ras pedaging-kampung
persilangan pelung-sentul
persilangan sentul-kampung
ras pedaging
N
131
23
34
18
41
16
22
18
10
Frekuensi Genotipe
GG
GA
AA
0.09 (12) 0.06 (8) 0.85 (111)
0.00 (0) 0.00 (0) 1.00 (23)
0.00 (0) 0.00 (0) 1.00 (34)
0.06 (1) 0.11 (2) 0.83 (15)
0.22 (9) 0.29 (12) 0.49 (20)
0.31 (5) 0.31 (5) 0.38 (6)
0.00 (0) 0.00 (0) 1.00 (22)
0.00 (0) 0.06 (1) 0.94 (17)
0.80 (8) 0.20 (2) 0.00 (0)
Frekuensi Alel
G
A
0.12
0.88
0.00
1.00
0.00
1.00
0.11
0.89
0.37
0.63
0.47
0.53
0.00
1.00
0.03
0.97
0.90
0.10
Frekuensi alel untuk gen GHR pada semua populasi ayam berkisar antara
0.10-1.00 untuk alel A dan 0.00-0.90 untuk alel G. Hal ini menunjukkan bahwa
gen GHR tidak bersifat polimorfik pada semua populasi. Jika frekuensi alel
11
mencapai nilai 1, maka populasi bersifat monomorfik (Hartl dan Clark 1997).
Populasi yang bersifat monomorfik yaitu ayam pelung, sentul dan persilangan
pelung dengan sentul. Alel A juga ditemukan sebagai alel yang dominan pada
populasi ayam xinghua persilangan (Ouyang et al. 2008). Sifat polimorfik ini
penting untuk dianalisis karena merupakan salah satu syarat agar suatu gen dapat
dijadikan sebagai marker genetik (Hartl dan Clark 1997).
Heterozigositas dan Keseimbangan Gen IGF2 dan GHR
Tingkat keragaman gen IGF2 dan gen GHR dianalisis berdasarkan nilai
heterozigositas yang disajikan pada Tabel 4. Ditemukan 3 populasi dengan
keragaman gen IGF2 yang tinggi yaitu ayam persilangan pelung dengan sentul,
kampung dan persilangan kampung dengan ras pedaging, namun tidak ditemukan
populasi yang memiliki keragaman gen GHR yang tinggi. Sutau populasi
memiliki keragaman genetik yang tinggi jika memiliki nilai heterozigositas lebih
dari 0.5 (Allendorf dan Luikart 2007). Secara keseluruhan, keragaman gen IGF2
pada semua populasi lebih tinggi dibandingkan keragaman gen GHR. Dalam
bidang pemuliaan ternak, keragaman gen berguna untuk menentukan sistem
pemuliaan yang akan dilakukan yaitu seleksi atau persilangan (Noor 2010).
Tabel 4 Heterozigositas dan keseimbangan Hardy-Weinberg gen IGF2 dan GHR
Gen IGF2
Gen GHR
Jenis Ayam
N
Ho
He χ2 Ho
He χ2
persilangan pelung-sentul
22 0.77 0.50 * 0.00 0.00 kampung
131 0.60 0.49 * 0.06 0.21 *
persilangan kampung-ras pedaging
41 0.51 0.40 ns 0.29 0.47 *
pelung
23 0.48 0.48 ns 0.00 0.00 sentul
34 0.44 0.34 ns 0.00 0.00 merawang
18 0.39 0.43 ns 0.11 0.20 ns
persilangan ras pedaging-kampung
16 0.38 0.38 ns 0.31 0.50 ns
persilangan sentul-kampung
18 0.22 0.50 * 0.06 0.06 ns
ras pedaging
10 0.20 0.18 ns 0.20 0.18 ns
* = berbeda nyata pada taraf 5%; ns = tidak nyata
Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) gen IGF2 pada ayam merawang dan
persilangan sentul dengan kampung lebih rendah dari nilai heterozigositas harapan
(He), begitu pula gen GHR pada ayam persilangan ras pedaging dengan kampung,
persilangan kampung dengan ras pedaging, ras pedaging, merawang dan kampung.
Nilai Ho yang lebih kecil dari He dapat dijadikan indikasi adanya inbreeding
sebagai akibat dari seleksi yang intensif (Allendorf dan Luikart 2007). Hasil
penelitian ini menunjukan bahwa populasi yang dianalisis telah mengalami seleksi
terhadap gen GHR yang lebih intensif dibandingkan gen IGF2.
Keseimbangan populasi dapat diketahui melalui analisis keseimbangan
Hardy-Weinberg yang disajikan pada Tabel 4. Hasil penelitian berdasarkan
keragaman gen IGF2, semua populasi berada dalam keadaan seimbang kecuali
persilangan pelung dengan sentul, kampung dan persilangan sentul dengan
kampung, sedangkan berdasarkan keragaman gen GHR, populasi yang tidak
12
seimbang yaitu kampung dan persilangan kampung dengan ras pedaging.
Populasi dikatakan seimbang jika frekuensi alel dan genotipenya konstan dari
generasi ke generasi, dalam perhitungan jika nilai χ2 hitung lebih kecil dari χ2
tabel (Allendorf dan Luikart 2007). Ketidakseimbangan suatu populasi dapat
disebabkan oleh faktor non random mating, seleksi, migrasi, mutasi dan genetic
drift (Noor 2010).
Pertumbuhan Ayam Kampung
Capaian bobot badan ayam kampung disajikan pada Gambar 4. Ayam pada
penelitian ini diberi pakan yang mengandung PK 19.03% untuk starter dan
17.42% untuk grower. Protein yang diberikan telah sesuai dengan kebutuhan
ayam khususnya ayam petelur tipe ringan (NRC 1994; Leeson dan Summers
2005). Kebutuhan protein ayam yaitu 18-20% untuk starter serta 15-16% untuk
grower (NRC 1994; Leeson dan Summers 2005).
Pakan yang diberikan pada ayam juga mengandung EM 2 856 kkal/kg untuk
starter dan 2 801 kkal/kg untuk grower. Energi yang diberikan sedikit lebih
rendah dibandingkan kebutuhan energi ayam khususnya ayam petelur tipe ringan
berdasarkan NRC (1994) serta Leeson dan Summers (2005). Kebutuhan energi
ayam yaitu 2 850-2 900 kkal/kg untuk starter dan 2 850-2 900 kkal/kg untuk
grower (NRC 1994; Leeson dan Summers 2005). Meskipun energi yang diberikan
sedikit lebih rendah namun capaian bobot badan ayam pada penelitian ini tetap
tergolong baik yaitu mampu mencapai bobot badan 722.61±152.74 g pada umur
12 minggu dan 1088.39±241.92 g pada umur 16 minggu. Hasil ini sejalan dengan
Sulandari et al. (2007) yang melaporkan bahwa ayam kampung yang dipelihara
secara intensif dengan pemberian pakan mengandung PK 16-17% dan EM 2 900
kkal/kg akan mampu mencapai bobot 708 g pada umur 12 minggu. Terbukti
bahwa pakan yang diberikan pada penelitian ini sudah cukup baik dan
menghasilkan capaian bobot badan ayam yang baik pula.
Gambar 4 Capaian bobot badan ayam kampung selama 16 minggu
13
Asosiasi Keragaman Gen IGF2 dengan Pertumbuhan Ayam
Capaian bobot badan ayam kampung berdasarkan perbedaan genotipe gen
IGF2 disajikan pada Gambar 5. Grafik menunjukkan bahwa ketiga genotipe yaitu
TT, TC dan CC memiliki capaian bobot badan yang sama. Selanjutnya dilakukan
analisis statistik untuk mengetahui hubungan antara ketiga genotipe dengan sifat
pertumbuhan pada ayam kampung yang disajikan pada Tabel 5.
Gambar 5 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen IGF2 berbeda.
TC, CC.
TT,
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa ketiga genotipe yaitu TT, TC
dan CC tidak berasosiasi dengan PBB fase starter, PBB fase grower serta bobot
badan umur 12, 14 dan 16 minggu pada ayam kampung. Hasil ini berbeda dengan
Tang et al. (2010) yang melaporkan bahwa genotipe CC memberikan performa
terbaik untuk bobot badan umur 17 minggu pada ayam beijing you.
Tabel 5 Asosiasi gen IGF2 dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Genotipe Gen IGF2
Parameter
TT (9)
TC (34)
CC (13)
PBB 0-8 mg (g/8 mg)
445.32 ± 31.75
425.16 ± 16.18
434.77 ± 26.20
PBB 8-16 mg (g/8 mg)
536.82 ± 50.55
524.26 ± 25.77
494.49 ± 41.71
BB 12 mg (g)
742.34 ± 47.72
718.34 ± 24.33
740.17 ± 39.38
BB 14 mg (g)
808.94 ± 60.36
833.23 ± 30.78
827.96 ± 49.80
BB 16 mg (g)
1 116.74 ± 71.81 1 099.12 ± 36.62 1 078.73 ± 59.26
Tidak adanya asosiasi antara SNP yang ditemukan pada gen IGF2 dengan
sifat pertumbuhan ayam kampung dapat disebakan oleh jenis mutasi yang terjadi.
Mutasi yang terjadi pada gen IGF2 yang dianalisis merupakan mutasi basa timin
(T) menjadi sitosin (C). Amills et al. (2003) yang melakukan penelitian pada
ayam black penedesenca melaporkan bahwa mutasi tersebut merupakan mutasi
synonimus yang mengkode asam amino yang sama yaitu histidin sehingga tidak
14
memberikan pengaruh terhadap performa ayam. Fenomena ini juga dapat terjadi
pada ayam kampung, namun hal ini harus diverifikasi lebih lanjut melalui
sekuensing whole gene dari gen IGF2 ayam kampung.
Asosiasi Keragaman Gen GHR
Capaian bobot badan ayam kampung berdasarkan perbedaan genotipe gen
GHR disajikan pada Gambar 6. Grafik menunjukkan bahwa genotipe GA
memiliki capaian bobot badan yang lebih tinggi dibandingkan genotipe lainnya.
Selanjutnya dilakukan analisis statistik untuk mengetahui hubungan antara ketiga
genotipe dengan sifat pertumbuhan pada ayam kampung yang disajikan pada
Tabel 6.
Gambar 6 Capaian bobot badan ayam dengan genotipe gen GHR berbeda.
GA, GG.
AA,
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa ketiga genotipe yaitu GG, GA
dan AA tidak berasosiasi dengan PBB fase starter, PBB fase grower serta bobot
badan umur 12, 14 dan 16 minggu pada ayam kampung. Hasil ini berbeda dengan
Ouyang et al. (2008) yang melaporkan bahwa genotipe GA memberikan performa
terbaik untuk bobot badan umur 35-63 hari dan tebal lemak subkutan pada ayam
xinghua persilangan.
Tabel 6 Asosiasi gen GHR dengan sifat pertumbuhan ayam kampung
Genotipe Gen GHR
Parameter
GG (5)
GA (3)
AA (48)
PBB 0-8 mg (g/8 mg)
426.00 ± 43.97
371.06 ± 55.68
435.01 ± 13.52
PBB 8-16 mg (g/8 mg)
590.63 ± 69.00
620.50 ± 87.38
505.62 ± 21.21
BB 12 mg (g)
732.40 ± 66.20
641.43 ± 83.83
732.44 ± 20.35
BB 14 mg (g)
868.76 ± 84.23
814.58 ± 106.67
825.16 ± 25.89
BB 16 mg (g)
1 156.69 ± 99.83 1 155.31 ± 126.42 1 087.49 ± 30.69
15
Salah satu faktor yang dapat menyebabkan perbedaan ini adalah adanya
mekanisme post-transcriptional yang berbeda pada gen GHR ayam kampung dan
ayam xinghua persilangan. SNP yang ditemukan pada gen GHR terletak di bagian
3’UTR yang memiliki peran penting dalam proses post-transcriptional. Pada
daerah 3’UTR terdapat sekuen yang berkomplementer dengan microRNA
(miRNA) seperti K box, Brd box dan GY box (Lai 2002). miRNA mempengaruhi
post-transcriptional ekspresi gen melalui pengaturan proses translasi dan stabilitas
mRNA. Pada mamalia, miRNA diprediksi mengontrol lebih dari 30% proteincoding gene. Melalui mekanisme pairing dengan mRNA, miRNA dapat
mempengaruhi translational repression dan degradasi mRNA (Filipowicz et al.
2008).
Asosiasi SNP Kombinasi
Frekuensi genotipe SNP kombinasi gen IGF2 dan GHR disajikan pada
Tabel 7. Hasil menunjukkan bahwa kombinasi TCAA memiliki frekuensi yang
tertinggi dibandingkan kombinasi lainnya. Hal ini memiliki arti bahwa kombinasi
TCAA memiliki peluang kemunculan tertinggi pada populasi ayam kampung.
Tabel 7 Frekuensi genotipe SNP kombinasi gen IGF2 dan GHR ayam kampung
Genotipe Gen IGF2
Genotipe Gen
GHR
TT
TC
CC
GG
0.02 (1)*
0.07 (4)
0.00 (0)*
GA
0.02 (1)*
0.04 (2)
0.00 (0)*
AA
0.13 (7)
0.50 (28)
0.23 (13)
* tidak diikutkan dalam analisis statistik untuk asosiasi karena n