7
2.5.1. Ekstraksi DNA
DNA diekstraksi dari larva resipien umur 1 hari dan dari gonad resipien umur 2 bulan setelah transplantasi. Ekstraksi DNA yang dilakukan meliputi 3
tahapan yaitu cell lysis, RNase treatment, protein precipitation, dan DNA precipitation.
Pada tahap cell lysis, jaringan 5-20 mg dilisis menggunakan 200 μl Cell
Lysis Solution Gentra, Minneapolis, USA dan 1,5 μl Proteinase K 20 mgml
dalam Eppendorf 1,5 ml. Inkubasi dilakukan pada suhu 55°C selama semalam atau hingga sel terlisis sempurna.
RNase treatment dilakukan setelah sel terlisis sempurna. Setelah inkubasi sampel didiamkan hingga suhu ruang dan kemudian
ditambahkan 1,5 μl RNase 4 mgml. Larutan sampel diaduk dengan cara membolak-balik inverting
Eppendorf sebanyak 30 kali. Selanjutnya sampel diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 60 menit. Setelah inkubasi sampel didiamkan kembali hingga suhu ruang.
Tahap protein precipitation. Ke dalam tabung sampel ditambahkan 5 0 μl
Protein Precipitation Solution Gentra, Minneapolis, USA dan di-vortex kencang 30 detik untuk mencampur larutan dalam Eppendorf. Sampel kemudian diinkubasi
pada es ice bath selama 10-15 menit. Setelah itu, sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit.
Tahap DNA precipitation. Supernatan dipindahkan ke dalam Eppendorf yang telah diisi
300 μl isopropanol, sampel dibolak-balik 50 kali. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan
dibuang, kemudian ditambahkan 300 μl etanol 70 dingin stok disimpan dalam lemari es -20
o
C ke dalam Eppendorf berisi pellet DNA, sampel dibolak-balik beberapa kali untuk mencuci pellet DNA. Sampel disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pellet DNA dikeringudarakan dan ditambahkan 30 μl IEW Ion Exchange Water. Larutan
DNA disimpan dalam freezer suhu -20
o
C hingga akan digunakan. Analisis kemurnian dan kandungan DNA dilakukan melalui dua cara yaitu
secara kuantitatif
dengan spektrofotometer
GeneQuant dan
kualitatif menggunakan elektroforesis.
8
2.5.2. Amplifikasi DNA dengan PCR
Kategori