Aktinomiset Filosfer Penghasil Senyawa Bioaktif Sebagai Agens Hayati Pengendali Penyakit Blas Daun Padi

AKTINOMISET FILOSFER PENGHASIL SENYAWA BIOAKTIF
SEBAGAI AGENS HAYATI PENGENDALI PENYAKIT
BLAS DAUN PADI

WIWIEK HARSONOWATI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aktinomiset Filosfer
Penghasil Senyawa Bioaktif sebagai Agens Hayati Pengendali Penyakit Blas
Daun Padi adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016
Wiwiek Harsonowati
G351140021

RINGKASAN
WIWIEK HARSONOWATI. Aktinomiset Filosfer Penghasil Senyawa Bioaktif
sebagai Agens Hayati Pengendali Penyakit Blas Daun Padi. Dibimbing oleh ARIS
TRI WAHYUDI dan RIKA INDRI ASTUTI.
Permasalahan utama produksi padi di Indonesia antara lain penyakit yang
menyerang tanaman padi yang mengakibatkan penurunan jumlah produksi baik
kualitas maupun kuantitas. Penyakit utama pada tanaman padi salah satunya
disebabkan oleh cendawan patogen daun Pyricularia oryzae Cav. penyebab
penyakit blas. P. oryzae menyerang tanaman padi mulai dari fase vegetatif sampai
stadia pembentukan malai atau fase generatif. Serangan blas yang berat dapat
mengakibatkan penurunan produksi hingga mencapai 70%. Semakin tinggi dan
meluasnya daerah persebaran penyakit blas pada tanaman padi, mendorong
dilakukannya berbagai upaya untuk mengendalikan penyakit tersebut, salah satu
diantaranya adalah penggunaan senyawa kimia sintetik yang terkendala dari
jumlah biaya produksi, keamanan, dan tidak ramah lingkungan. Penggunaan

aktinomiset filosfer sebagai agens hayati pengendali penyakit blas daun pada padi
masih belum dilakukan. Oleh karena itu penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan aktinomiset asal filosfer sebagai agens hayati dalam mengendalikan
penyakit blas skala rumah kaca.
Sampel daun padi yang sehat diperoleh dari wilayah persawahan yang
terserang penyakit blas di Situgede, Sukabumi dan Jasinga, Jawa Barat. Sebanyak
75 isolat aktinomiset telah berhasil diisolasi dari filosfer tanaman padi. Diperoleh
38 isolat mampu menghambat pertumbuhan P. oryzae secara in vitro
menggunakan metode kultur ganda, dan 27 isolat diantaranya termasuk kelompok
aktinomiset non-patogen melalui uji hemolitik, hipersensitivitas dan patogenisitas.
Analisa sekuen gen 16S rRNA terhadap 22 isolat terpilih menunjukkan bahwa
isolat tersebut termasuk dalam genus Streptomyces (15 isolat), Micromonospora
(2 isolat), Lentzea (2 isolat), Saccharothrix (2 isolat), dan Gordonia (1 isolat).
Deteksi gen penyandi enzim yang berperan untuk biosintesis senyawa bioaktif
nonribosomal peptida sintase (NRPS) dan poliketida sintase (PKS-I)
menunjukkan bahwa 21 isolat (95.45%) memiliki gen NRPS dan 14 isolat
(63.6%) memiliki PKS-I.
Sebelas isolat aktinomiset dengan karakteristik pertumbuhan yang tidak
membentuk agregat pada media cair selanjutnya diuji in planta untuk
mengendalikan serangan penyakit blas di rumah kaca. Pengujian secara in planta

menunjukkan aplikasi aktinomiset filosfer mampu menekan penyakit blas sebesar
77 sampai 88%. Isolat JSN1.9, SKB2.14, dan SKB2.3 merupakan tiga isolat
terbaik dalam menekan gejala penyakit blas pada aplikasi di rumah kaca dan
ketiga isolat tersebut teridentifikasi sebagai Gordonia terrae, Streptomyces
griseus, dan Streptomyces albolongus. Hasil penelitian ini menunjukkan persen
penghambatan penyakit blas tertinggi di rumah kaca dibandingkan aplikasi bakteri
tanah dan rizosfer. Oleh karena itu, aktinomiset filosfer lebih berpotensi untuk
dimanfaatkan sebagai agens hayati pengendali penyakit blas daun padi.
Kata kunci: Blas, non-patogen, NRPS, PKS-I, Pyricularia oryzae

SUMMARY
WIWIEK HARSONOWATI. Phyllosphere Actinomycetes Producing Bioactive
Compounds as Biological Control Agents of Rice Fungal Leaf Blast. Supervised
by ARIS TRI WAHYUDI and RIKA INDRI ASTUTI.
The main problem of rice production in Indonesia is caused by plant
diseases which results in productivity losses every year. Fungal leaf blast, caused
by Pyricularia oryzae Cav., is a devastating disease of rice plant. This disease
infects the rice plant from vegetative stage to panicle formation stage or the
generative phase. Severe blast infection may result in production losses up to 70%.
Biological agents to control plant diseases are known for not causing health

problems (no side effects), prevent pathogens resistance and no environmental
contamination. To date, application of phyllosphere actinomycetes as biological
control of rice blast disease is still limited. Therefore, this study was aimed to
obtain rice-phyllosphere actinomycetes as biocontrol agents to reduce blast
disease in a greenhouse experiment.
Healthy rice leaf samples were obtained from rice-fields known as
endemic area of blast disease in Situgede, Jasinga and Sukabumi, West Java. A
total of 75 isolates of actinomycetes were isolated from rice plants phyllosphere.
A total of 38 out of 75 isolates were able to inhibit the growth of P. oryzae by
using dual culture method in vitro. A total of 27 isolates was observed as nonpathogenic actinomycetes group through hemolityc, hipersensitivity and
pathogenicity assays. Analysis of the 16S rRNA gene sequences of the 22 selected
isolates showed that these isolates belong to the genus Streptomyces (15 isolates),
Micromonospora (2 isolates), Lentzea (2 isolates), Saccharothrix (2 isolates), and
Gordonia (1 isolate). The potential bioactive compound-producing isolates were
successfully observed amongst selected isolates, as 21 isolates (95.45%) and 14
isolates (63.6%) were detected to have domain marker of nonribosomal peptide
synthetases (NRPS) and type-I polyketide synthase (PKS) genes, respectively, in
their corresponding genome.
Eleven isolates out of 22 isolates were selected for in planta assay to
control leaf blast disease. Three isolates JSN1.9, SKB2.14, and SKB2.3 exhibited

remarkable disease suppression for approximately 88%. These tree isolates were
identified based on 16S rRNA gene sequences as Gordonia terrae, Streptomyces
griseus and Streptomyces albolongus, respectively. To our knowledge, this result
was the highest leaf blast disease suppression activity has ever been exhibited by
actinomycetes in greenhouse experiments. Thus, these findings have escalated the
potential application of phyllosphere actinomycetes as a supreme biocontrol agent
against fungal leaf blast disease.
Keywords: Blast, non-pathogenic, NRPS, PKS-I, Pyricularia oryzae

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

AKTINOMISET FILOSFER PENGHASIL SENYAWA BIOAKTIF

SEBAGAI AGENS HAYATI PENGENDALI PENYAKIT
BLAS DAUN PADI

WIWIEK HARSONOWATI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Mikrobiologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Ir Utut Widyastuti, MSi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karuniaNya sehingga tesis ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian

yang dilaksanakan sejak bulan Agustus 2015 sampai Juni 2016 dengan judul
Aktinomiset Filosfer Penghasil Senyawa Bioaktif sebagai Agens Hayati
Pengendali Penyakit Blas Daun Padi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Aris Tri Wahyudi,
MSi selaku ketua komisi pembimbing dan Ibu Dr Rika Indri Astuti, MSi selaku
anggota komisi pembimbing, yang telah memberikan motivasi, waktu untuk
konsultasi dan diskusi serta solusi dari setiap permasalahan yang dihadapi penulis
selama melaksanakan penelitian, kemudian saran dan masukan dalam penyusunan
dan perbaikan karya ilmiah ini. Selain itu penulis ucapkan terima kasih kepada
penguji luar komisi pembimbing Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dan Ibu Prof
Anja Meryandini, MS selaku Ketua Program Studi Mikrobiologi IPB, yang telah
memberikan motivasi selama studi dan masukan pada saat ujian sidang tesis.
Terima kasih atas dana penelitian program Kerjasama Kemitraan Penelitian dan
Pengembangan Pertanian Nasional (KKP3N) dari Kementerian Pertanian
Indonesia yang diberikan kepada Prof Aris Tri Wahyudi tahun 2014-2016,
sehingga penelitian yang penulis lakukan dapat terlaksana dengan baik. Sebagian
hasil penelitian ini telah dipublikasikan di jurnal internasional Journal of General
Plant Pathology terindeks Scopus (Impact Factor 1.12) dengan judul “Leaf Blast
Disease Reduction by Rice-Phyllosphere Actinomycetes Producing Bioactive
Compounds”.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ibu Heni dan Bapak Jaka
selaku staf Laboratorium Mikrobiologi IPB, kepada Ibu Retnowati selaku staf
Laboratorium Terpadu Biologi IPB, Ibu Dr Anggiani Nasution dari Balai Besar
Padi KP Muara yang telah memberikan isolat Pyricularia oryzae dan Bapak Ir
Yadi Suryadi, Msc dari Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan
Sumber Daya Genetik Pertanian yang telah memberikan izin penggunaan
Laboratorium Mikrobiologi dan rumah kaca “Moisture chamber for blast disease”,
seluruh teman-teman di Lab. Mikrobiologi IPB dan teman-teman Pascasarjana
prodi Mikrobiologi angkatan 2014 atas dukungan, motivasi, kebersamaan dan
bantuannya selama penelitian, serta kebersamaan dari teman-teman penghuni
wisma Dwi Regina. Ucapan terima kasih sebesar-besarnya kepada Bapak
Muanam Harsono (alm.) dan Ibu Supartini serta kakak dan adik ku tercinta atas
doa, dukungan, kasih sayang dan semangat yang diberikan. Ucapan terimakasih
kepada pemerintah Jepang yang telah memberikan beasiswa Monbukagakusho
(MEXT) 2016 untuk program S3 kepada penulis, sehingga penulis termotivasi
untuk menyelesaikan penelitian dan studi program magister tepat waktu.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2016

Wiwiek Harsonowati

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vii

DAFTAR GAMBAR

vii

DAFTAR LAMPIRAN

viii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
2 TINJAUAN PUSTAKA
Penyakit Blas Daun oleh Cendawan Pyricularia oryzae

Aktinomiset Filosfer
Gen Penyandi Senyawa Bioaktif
Mekanisme Pengendalian Hayati
3 METODE
Kerangka Penelitian
Waktu dan Tempat
Bahan dan Alat
Prosedur Penelitian
Isolasi Aktinomiset Filosfer Padi
Skrining Aktivitas Antifungi terhadap P. oryzae
Uji Reaksi Hemolisis
Uji Respon Hipersensitivitas dan Patogenisitas
Isolasi DNA Genom Aktinomiset
Amplifikasi Gen 16S rRNA, Domain A dan KS
Kloning, Sekuensing dan Analisis Bioinformatika Domain A dan KS
Persiapan Aplikasi Agens Hayati terhadap Penyakit Blas di Rumah
Kaca
Rancangan Percobaan Aplikasi Agens Hayati di Rumah Kaca
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Aktinomiset Filosfer Padi

Skrining Aktivitas Antifungi dan Uji Patogenisitas
Amplifikasi Gen 16S rRNA, Domain A dan KS
Kloning dan Analisis Bioinformatika Domain A dan KS
Aplikasi Agens Hayati terhadap Penyakit Blas Daun di Rumah Kaca
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

1
1
2
2
3
3
5
6
8
9
9
10
10
10
10
10
11
11
11
11
12

DAFTAR PUSTAKA

32

RIWAYAT HIDUP

12
13
15
15
17
21
25
28
32
32
32

DAFTAR TABEL
1 Skala skor penyakit blas daun tanaman padi (IRRI 2002)
2 Skrining primer isolat aktinomiset filosfer padi non-patogen dengan
aktivitas anti-P. oryzae menggunakan metode kultur ganda pada media
PDA
3 Identifikasi molekuler isolat aktinomiset terpilih berdasarkan sekuen
gen 16S rRNA menggunakan program BLASTN dan deteksi gen NRPS
dan PKS-I dengan PCR
4 Analisa bioinformatika sekuen asam amino gen penyandi domain A
(NRPS) dan domain KS (PKS-I) hasil subklon menggunakan program
BLASTX
5 Respon tanaman padi varietas Ciherang pada 21 hari setelah diinokulasi
P. oryzae

14

21

23

26
29

DAFTAR GAMBAR
1 Gejala serangan blas pada daun padi fase vegetatif dan generatif di
daerah Sukabumi, Jawa Barat
2 Siklus hidup P. oryzae penyebab penyakit blas daun (leaf blast) yang
dipengaruhi oleh faktor suhu dan kelembaban udara
3 Organisasi setiap domain pada sistem modul enzim NRPS dan PKS
4 Diagram alur penelitian
5 Koloni aktinomiset hasil isolasi dari sampel daun (tanda panah) pada
tiga jenis media isolasi
6 Morfologi koloni aktinomiset filosfer padi umur ± 10 hari pada media
ISP2
7 Koloni aktinomiset filosfer padi yang mampu menghambat
pertumbuhan P.oryzae pada media PDA
8 Aktivitas hemolitik isolat aktinomiset pada media agar darah yang
diinkubasi pada suhu ruang selama 48-72 jam
9 Respon hipersensitivitas (HR) pada daun tembakau dan gejala nekrosis
setelah inokulasi isolat aktinomiset
10 Respon patogenisitas isolat aktinomiset pada daun padi IR64
11 Elektroforesis gel agarosa 0.8% yang menunjukkan pita-pita DNA hasil
amplifikasi gen 16S rRNA dari 6 isolat aktinomiset filosfer padi dengan
ukuran amplikon 1300 pb
12 Elektroforesis fragmen DNA penyandi domain A dan KS pada gel
agarosa 0.8%
13 Pohon filogenetik gen 16S rRNA (neighbour joining tree)
menggunakan Tamura- 3 parameter model (bootstrap 1000x)
14 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain KS
(ketosintase) yang dikonstruksi menggunakan metode NeighborJoining dengan nilai bootstrap 1000 ulangan
15 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen asam amino domain A
(adenilase) yang dikonstruksi menggunakan metode Neighbor-Joining
dengan nilai bootstrap 1000 ulangan

4
5
7
9
15
16
18
19
19
20

22
22
24

27

27

16 Morfologi tanaman padi varietas Ciherang pada uji aplikasi in planta
agens hayati di rumah kaca

30

DAFTAR LAMPIRAN
1 Komposisi media pertumbuhan aktinomiset dan cendawan P. oryzae
2 Persentase penghambatan (inhibisi) pertumbuhan miselium P. oryzae
oleh isolat aktinomiset filosfer padi asal Situgede (STG), Sukabumi
(SKB) dan Jasinga (JSN)
3 Skala penilaian intensitas blas daun skala 0-9
4 Penilaian pengaruh aplikasi agens hayati terhadap penyakit blas daun di
rumah kaca berdasarkan IRRI (2002)
5 Respon tanaman padi varietas Ciherang pada uji in planta sebelum
diinokulasi P. oryzae (21 hst)
6 Kromatogram sekuen gen 16S rRNA dan hasil BLASTN tiga isolat
aktinomiset filosfer padi terbaik hasil aplikasi in planta
7 Kromatogram sekuen domain A dan KS hasil subklon dan hasil
BLASTX isolat aktinomiset filosfer padi terbaik hasil aplikasi in planta

37

39
40
41
43
44
53

1

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi (Oryza sativa L.) merupakan salah satu tanaman pangan utama di dunia
dan merupakan sumber makanan pokok bagi hampir seluruh masyarakat
Indonesia (Susanto et al. 2003). Pada tahun 2007, Indonesia merupakan negara
swasembada beras dengan kenaikan produksi padi nasional sebesar 4.96%.
Namun, perkembangan beberapa tahun terakhir produksi padi nasional cenderung
mengalami penurunan. Total produksi padi pada tahun 2014 yaitu sebesar 70.83
juta ton Gabah Kering Giling (GKG) atau mengalami penurunan sebesar 0.45 juta
ton (0.63%) dibandingkan tahun 2013 (BPS 2015). Berdasarkan data dari BPS,
produktivitas padi nasional mengalami penurunan sebanyak 1.08 juta ton (1.63%)
per tahun. Pada tahun 2012 Indonesia masih harus mengimpor beras sebanyak
1.81 juta ton untuk memenuhi kebutuhan pangan nasional. Penurunan
produktivitas beras nasional disebabkan oleh beberapa faktor beberapa
diantaranya defisiensi unsur hara, cekaman lingkungan, serangan hama dan
penyakit tanaman padi.
Permasalahan utama penurunan produksi padi di Indonesia antara lain
disebabkan oleh penyakit yang menyerang tanaman padi, seperti penyakit blas
oleh cendawan patogen Pyricularia oryzae (Prayudi 2000). Penyakit blas dikenal
sebagai penyakit demam pada padi (rice fever disease) di Cina pada awal tahun
1637, dilaporkan sebagai Imochi-byo di Jepang pada tahun 1704, dan disebut
sebagai brusone di Itali pada tahun 1828 (Shafaullah et al. 2011). Penyakit blas
dianggap sebagai penyakit paling penting karena penyebarannya yang luas dan
menyebabkan kehilangan hasil yang parah. P.oryzae dapat menyerang pada seluruh
fase pertumbuhan tanaman padi dan mampu menurunkan produksi padi dalam jumlah
besar. Cendawan ini menginfeksi tanaman padi bagian daun (leaf blast), buku (node
blast), leher malai (neck blast), bulir padi (spikelet blast) dan daun pelepah (collar
rot) (Scardaci et al. 1997). Penyakit blas pada tanaman padi bersifat kosmopolit,
yaitu menyerang tanaman padi di seluruh dunia. Akibat dari serangan cendawan
penyebab penyakit blas ini produksi padi dapat menurun secara signifikan, yaitu
sekitar 30-50% atau bahkan dapat mencapai 70% (Munoz et al. 2007). Penyakit
blas telah menurunkan hasil tanaman padi di Asia Tenggara dan Amerika Selatan
sekitar 30-50% dan mengakibatkan kerugian jutaan dolar Amerika. Di Indonesia
serangan penyakit blas dapat mencapai seluas 1.285 juta hektar atau sekitar 12%
dari luas total pertanaman padi di Indonesia. Daerah endemik penyakit blas di
Indonesia adalah Lampung, Sumatera Selatan, Jambi, Sumatera Barat, Sulawesi
Tengah, Sulawesi Tenggara, dan Jawa Barat (Sukabumi) (Direktorat Perlindungan
Tanaman Pangan 2013).
Semakin meluasnya daerah persebaran penyakit blas pada tanaman padi,
mendorong dilakukannya berbagai upaya untuk mengendalikan penyakit tersebut,
salah satu diantaranya adalah penggunaan senyawa kimia sintetik (fungisida) yang
terkendala dari jumlah biaya produksi, keamanan, dan tidak ramah lingkungan
karena pencemaran yang ditimbulkannya akibat adanya residu bahan kimia
sintetik (Khan et al. 2012). Untuk meminimalkan pemakaian fungisida sintetik,
dilakukan berbagai penelitian untuk pengendalian penyakit blas menggunakan
teknologi berbasis mikrob, salah satunya adalah dengan pemanfaatan mikrob

2

antagonis. Penggunaan mikrob filosfer sebagai agens hayati dalam pengendalian
penyakit tanaman masih belum banyak dilakukan. Pemakaian aktinomiset filosfer
sebagai agens hayati tidak menimbulkan masalah kesehatan, resistensi terhadap
patogen dan kontaminasi lingkungan. Aktinomiset filosfer merupakan
mikroorganisme kelompok bakteri Gram positif yang habitatnya di permukaan
daun dan memiliki kemampuan sintesis berbagai macam senyawa bioaktif sebagai
antibakteri dan antifungi (Hasegawa et al. 2006) yang mampu menekan kolonisasi
patogen daun secara langsung. Berbeda dengan mikrob rizosfer dan mikrob tanah,
perbedaan habitat dengan patogen daun mengakibatkan aplikasi mikrob tersebut
menjadi kurang efektif untuk pengendalian penyakit blas. Dengan demikian,
aktinomiset filosfer memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai agens hayati
dalam pengendalian penyakit blas pada daun tanaman padi. Namun informasi
terkait penggunaan mikrob antagonis yaitu aktinomiset filosfer sebagai agens
hayati pengendali penyakit blas pada padi masih sangat terbatas. Oleh karena itu,
informasi terkait eksplorasi aktinomiset filosfer yang menghasilkan senyawa
bioaktif sangat penting dilakukan untuk mendapatkan aktinomiset potensial
sebagai agens hayati pengendali penyakit blas yang disebabkan oleh P. oryzae.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan memperoleh isolat aktinomiset filosfer padi yang
berpotensi sebagai agens hayati pengendali penyakit blas daun, mengidentifikasi
isolat aktinomiset berdasarkan sekuens gen 16S rRNA, serta menganalisa gen
yang berperan dalam biosintesis senyawa antifungi. Selanjutnya mengaplikasikan
isolat aktinomiset filosfer terpilih di rumah kaca untuk mengendalikan penyakit
blas daun pada padi.

Manfaat Penelitian
Penyakit pada tanaman padi yang disebabkan oleh mikroorganisme patogen
terus mengalami perkembangan dan resistensi, untuk itu diperlukan eksplorasi
strain aktinomiset jenis baru yang memiliki potensi produksi senyawa bioaktif
antifungi jenis baru. Penapisan isolat aktinomiset filosfer padi dalam penelitian ini
diharapkan mampu memperoleh isolat aktinomiset dengan potensi sebagai agens
hayati pengendali penyakit blas yang efektif, tepat sasaran dan ramah lingkungan,
serta mampu meningkatkan produksi tanaman padi. Hasil penelitian ini juga
diharapkan dapat memberikan informasi tentang efektivitas aplikasi isolat
aktinomiset filosfer untuk pengendalian penyakit blas daun pada skala rumah kaca
sebagai acuan untuk pengembangan biopestisida dengan pemakaian skala lapang.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Penyakit Blas Daun oleh Cendawan Pyricularia oryzae
Permasalahan utama produksi padi di Indonesia antara lain penyakit yang
menyerang tanaman padi yang mengakibatkan penurunan jumlah produksi baik
kualitas maupun kuantitas. Penyakit tanaman padi yang disebabkan oleh
cendawan patogen antara lain penyakit blas (Pyricularia oryzae), bercak daun
cokelat (Helminthosporium oryzae), busuk batang (Helminthosporium
sigmoideum), dan hawar pelepah daun (Rhizoctonia solani). Penyakit utama pada
tanaman padi salah satunya disebabkan oleh cendawan Pyricularia oryzae Cav.
penyebab penyakit blas (Prayudi 2000). Penyakit blas dapat menyerang semua
bagian tanaman padi dari persemaian, stadia vegetatif dengan menyerang daun,
dan stadia generatif dengan menyerang leher dan cabang malai, dan bulir. Varietas
tanaman padi yang rentan dan kondisi lingkungan yang mendukung penyakit ini
dapat menyebabkan petani gagal panen atau puso.
Karakteristik P. oryzae
Cendawan P. oryzae (teleomorph: Magnaporthe oryzae) merupakan
kelompok cendawan kelas Ascomycota. Secara morfologi, cendawan P. oryzae
memiliki konidia berbentuk bulat, lonjong, tembus cahaya, dan bersekat dua (3
ruangan). Konidia P. oryzae mempunyai panjang kurang lebih 19-27 x 8-10 μm
(Ou 1985) (Gambar 1). Reproduksi seksual P. oryzae tidak ditemukan di alam
tetapi hanya ada di laboratorium yakni Magnaporthe grisea (Hebert) Harr (Agrios
2005). Cendawan P. oryzae adalah penyebab penyakit blas, yang merupakan salah
satu penyakit paling penting dan merusak pada tanaman padi (Rossman et al.
1990). Ou (1985) mengungkapkan bahwa munculnya gejala blas pada permukaan
daun padi terjadi karena tiga faktor yaitu daya menginfeksi patogen yang cukup
kuat, kerentanan tanaman dan faktor lingkungan terutama suhu dan kelembaban
yang mendukung perkembangan penyakit.
Cendawan P. oryzae menyerang tanaman padi mulai dari fase vegetatif
sampai stadia pembentukan malai atau fase generatif. Serangan blas yang berat
dapat menimbulkan puso dan atau menggagalkan panen (Santika dan Sunaryo
2008). Penyakit blas merupakan salah satu kendala utama dalam budidaya padi
karena bila terserang cendawan P. oryzae sejak dini, akan mengakibatkan
penurunan produksi hingga 70% (Ou 1985).
Gejala Penyakit Blas
Infeksi P. oryzae pada fase vegetatif menimbulkan gejala blas daun (leaf
blast) dengan ditandai adanya bintik-bintik kecil pada daun berwarna coklat
kekuningan. Semakin lama bercak menjadi besar, berbentuk seperti belah ketupat
atau gelendong (spindle-shaped) dengan bagian tengahnya berupa titik berwarna
putih atau kelabu dengan bagian tepi kecokelatan atau berwarna lebih gelap
(Gambar 1). Serangan pada fase generatif menyebabkan pangkal malai membusuk
(neck blast), berwarna kehitaman dan mudah patah (busuk leher). Leher malai
yang terserang menunjukkan gejala nekrosis berwarna coklat abu-abu, buku
batang juga dapat terserang dan menyebabkan batang patah. Bila infeksi terjadi

4

sebelum masa pengisian bulir, maka dapat terjadi kehampaan pada bulir. Batang
tanaman padi dapat terinfeksi akibat penularan dari pelepah daun, sehingga batang
membusuk dan mudah rebah. Satu daur penyakit blas dimulai ketika spora
cendawan menginfeksi dan rnenghasilkan suatu bercak pada tanaman padi dan
berakhir ketika cendawan bersporulasi dan rnenyebarkan spora baru rnelalui udara.
Apabila kondisi lingkungan menguntungkan, satu daur dapat terjadi dalam
waktu sekitar 1 minggu. Selanjutnya dari satu bercak dapat rnenghasilkan ratusan
sampai ribuan spora dalam satu malam dan dapat terus rnenghasilkan spora
selama lebih dari 20 hari. Pada kondisi kelembaban dan suhu yang mendukung,
cendawan blas dapat mengalami banyak daur penyakit dan menghasilkan
kelimpahan spora yang tinggi pada akhir musim. Tingkat inokulum yang tinggi ini
sangat berbahaya bagi tanaman padi yang rentan (Scardaci et al. 1997).

Gambar 1 Gejala serangan blas pada daun padi fase vegetatif dan generatif di
daerah Sukabumi, Jawa Barat. (a) serangan blas menyebabkan
tanaman puso, (b) gejala bercak blas berbentuk belah ketupat (tanda
panah hitam), (c) koloni P. oryzae pada media potato dextrose agar
(PDA), (d) struktur mikroskopis spora aseksual (konidia) P. oryzae
dengan skala pada bar 20 µm. (Sumber : dokumentasi pribadi)
Siklus Hidup P. oryzae
Daur penyakit blas meliputi tiga fase yaitu infeksi, kolonisasi, dan sporulasi.
Fase infeksi diawali dengan pembentukan konidia bersepta tiga yang dilepaskan
oleh konidiofor. Konidia berpindah ke permukaan daun yang tidak terinfeksi
melalui percikan air atau bantuan angin. Konidia menempel pada daun karena
adanya perekat atau getah di ujungnya. Konidia akan berkecambah pada kondisi
optimum dengan cara membentuk buluh-buluh perkecambahan yang selanjutnya
menjadi appresoria. Appresoria akan menembus kutikula daun dengan bantuan

5

melanin yang ada pada dinding appresoria. Proses penetrasi appresoria pada
kondisi optimum berlangsung 8-10 jam. Hifa yang terus berkembang dan
menginfeksi akan menimbulkan bercak sebagai tanda sel dan jaringan mengalami
nekrosis. Pada kelembapan yang tinggi, bercak pada tanaman yang rentan
menghasilkan konidia selama 3-4 hari. Konidia ini sangat mudah tersebar dan
merupakan inokulum untuk infeksi selanjutnya (Leung dan Shi 1994).
Daur hidup P.oryzae pada tanaman padi diawali dengan proses infeksi atau
pelekatan spora (konidia) pada saat daun padi dalam keadaan basah dan pada
kondisi lingkungan yang mendukung. Perkecambahan akan terjadi setelah 3 jam
pelekatan. Bercak pertama akan muncul 5-6 hari setelah inokulasi pada suhu 2425oC. Perkembangan dari bercak kecil menjadi bercak besar akan berlangsung
cepat pada suhu 32oC selama 8 hari. Sporulasi terjadi ketika kelembaban di atas
90%, konidiofor dibentuk selama 4-6 jam dengan rata-rata pembentukan 1 konidia
selama 40 menit. Sporulasi maksimum terjadi pada 7–12 hari setelah inokulasi
dan berlanjut hingga 60 hari (Gambar 2).

Gambar 2 Siklus hidup P. oryzae penyebab penyakit blas daun (leaf blast) yang
dipengaruhi oleh faktor suhu dan kelembaban udara (modifikasi dari
Thines et al. 2004)
Aktinomiset Filosfer
Aktinomiset merupakan salah satu dari kelompok bakteri Gram positif yang
membentuk percabangan filamen dan spora dengan komposisi basa DNA G+C
(Guanine+Cytosine) yang tinggi yaitu berkisar antara 63-78%. Berdasarkan ciri
morfologi dan kandungan kimiawi dinding selnya, dibedakan menjadi dua
kelompok besar yaitu genus Streptomyces dan non-Streptomyces. Secara
morfologi, koloni aktinomiset yang tergolong genus Streptomyces dapat
membentuk miselia aerial dan secara mikroskopis memiliki rantai spora seperti

6

kait, spiral, atau heliks (Miyadoh 1997). Adanya perbedaan pembentukan miselia
dan struktur rantai spora tersebut menunjukkan karakter unik yang dimiliki oleh
Streptomyces. Aktinomiset yang tidak membentuk miselia aerial atau hanya
membentuk miselia dalam substrat tergolong ke dalam kelompok nonStreptomyces. Aktinomiset diklasifikasikan sebagai berikut (Stackebrandt et al.
1997):
Domain
: Bacteria
Filum
: Actinobacteria
Kelas
: Actinobacteria
Subkelas : Actinobacteridae
Ordo
: Actinomycetales
Aktinomiset diketahui mampu menghasilkan beragam senyawa bioaktif,
yaitu sekitar 70% dari total senyawa bioaktif yang diperoleh dari bakteri. Senyawa
bioaktif ini telah dimanfaatkan di bidang kesehatan, pertanian dan industri.
Aktinomiset mampu menghasilkan beragam metabolit sekunder dengan beragam
fungsi biologi seperti antimikrob, inhibitor enzim dan enzim pendegradasi bahan
organik. Berbagai senyawa antimikrob yang dihasilkan oleh aktiomiset, khususnya
Streptomyces spp. berupa tetrasiklin, streptomisin, eritromisin, kloramfenikol,
ivermektin, dan rifampisin (Takahashi 2004).
Salah satu agens hayati yang mempunyai kemampuan menghambat aktivitas
patogen daun yaitu mikrob filosfer (habitat di permukaan daun), termasuk
diantaranya kelompok aktinomiset. Keberadaannya dalam komunitas yang sama
dengan patogen lebih mampu menghambat pertumbuhan patogen daun melalui
kompetisi ruang, nutrisi, maupun sintesis senyawa bioaktif yang mempunyai
aktivitas anti-patogen. Kompetisi diantara mikrob tersebut memegang peranan
penting terhadap kerapatan populasi pada daun atau filosfer, serta pada terjadinya
proses infeksi dari patogen (Lindow dan Brandl 2003).
Penapisan mikrob yang potensial untuk digunakan sebagai agens hayati
pengendali patogen tanaman telah banyak dilakukan. Namun, setelah
diaplikasikan kemampuan pengendaliannya secara in planta, hanya sedikit dari
mikrob yang potensial secara in vitro berhasil diaplikasikan di lapang. Salah satu
alasan atas kegagalan ini adalah kurang tepatnya prosedur penapisan dalam
menseleksi mikrob yang cocok dalam mengendalikan penyakit yang disebabkan
oleh patogen target (Pliego et al. 2011). Sampai saat ini, potensi pengendalian
serangan penyakit blas pada tanaman padi dengan menggunakan mikrob belum
banyak dikaji, khususnya penggunaan aktinomiset filosfer yang diharapkan
merupakan terobosan baru pengendalian penyakit blas pada tanaman padi.
Gen Penyandi Senyawa Bioaktif
Senyawa bioaktif pada kelompok bakteri termasuk aktinomiset, disintesis
oleh enzim poliketida sintase (PKS) dan non-ribosomal peptida sintase (NRPS)
(Cane et al. 1998; Moffit dan Neilan 2003). Gen PKS terorganisasi secara
modular dan setiap modul memiliki informasi esensial untuk pengenalan, aktivasi
dan modifikasi dari suatu substrat menjadi senyawa polimernya. Setiap modul
dapat dibagi menjadi beberapa domain yang terlibat dalam reaksi spesifik. Jumlah
modul dan organisasi domain-domain pada kluster gen tersebut menentukan
struktur senyawa poliketida dan peptide yang disintesis (Schwarez dan Marhiel

7

2001). Peptida non-ribosomal merupakan senyawa bioaktif yang dibentuk dari
monomer asam amino yang sederhana. Peptida non-ribosomal disintesis oleh gen
NRPS yang terdiri dari multimodular dan protein multifungsional (Gambar 3).

Gambar 3 Organisasi setiap domain pada sistem modul enzim NRPS dan PKS.
(a) Konfigurasi minimal (domain utama) modul NRPS terdiri dari
domain: C (condensation), A (adenylation), dan PCP (peptidyl carrier
protein). (b) Konfigurasi minimal modul PKS terdiri dari domain: AT
(acyl transferase), ACP (acyl carrier protein) dan KS (ketosynthase)
(modifikasi dari Kehr et al. 2011)

8

Pada kelompok aktinomiset, sistem modul enzim NRPS dan PKS disusun
oleh tiga domain utama yaitu dua domain berfungsi sebagai katalitik dan satu
domain sebagai pembawa (carrier). Domain utama pada NRPS terdiri dari
domain kondensasi (C), adenilasi (A) dengan jumlah pasang basa 700-800 pb, dan
peptidyl carrier protein (PCP), sedangkan domain utama pada PKS antara lain,
ketosintase (KS) dengan jumlah pasang basa 1200-1400 pb, acyl tranferase (AT),
dan acyl carrier protein (ACP) (Ayuso-Sacido dan Genilloud 2004). Enzim
NRPS dan PKS memiliki ukuran yang besar sekitar 200 sampai 2000 kDa sebagai
enzim mutifungsional yang memiliki modul-modul yang berperan dalam sintesis
suatu senyawa bioaktif.
Penggunaan domain KS dan A dalam studi keragaman gen PKS dan NRPS
disebabkan domain ketosintase (KS) dan domain adenilasi (A) merupakan domain
yang ada dalam tiap modul dan memperlihatkan derajat konservasi yang tinggi di
antara domain lainnya. Mikroorganisme yang berpotensi menghasilkan senyawa
bioaktif dicirikan dengan adanya gen penyandi enzim PKS dan NRPS melalui
analisis fragmen DNA penyandi domain ketosintase (KS) dan domain adenilase
(A) (Moffit dan Neilan 2003).
Beberapa produk senyawa bioaktif poliketida dan peptida non-ribosomal
yang dihasilkan oleh aktinomiset telah dimanfaatkan dalam bidang pertanian. Di
China, dua produk fungisida komersial yaitu Jinggangmycin dan MycostopTM
telah digunakan untuk mengendalikan mikrob patogen, sedangkan di Jepang,
Phytomycin dengan bahan aktifnya streptomisin telah digunakan untuk
mengendalikan mikrob patogen. Senyawa antifungi yang dihasilkan oleh isolat
aktinomiset PM5, yaitu senyawa alifatik dengan dua unit lakton dan keton
karbonil dapat menghambat pertumbuhan miselia Pyricularia oryzae dan
Rhizoctonia solani pada tanaman padi (Prabavathy et al. 2006).
Mekanisme Pengendalian Hayati
Mekanisme kerja pengendalian penyakit tanaman secara hayati yang
menggunakan mikrob dapat terjadi secara langsung maupun tidak langsung.
Pengedalian mikrob patogen tanaman secara langsung melalui aktivitas antibiosis,
kemampuan berkompetisi (nutrisi dan spasial), dan lisis sel mikrob patogen
melalui aktivitas enzim pendegradasi. Antibiosis terjadi ketika agens hayati
mengkolonisasi jaringan tanaman dan menghasilkan satu atau lebih senyawa
bioaktif yang menghambat pertumbuhan bahkan membunuh patogen. Beberapa
jenis aktinomiset telah dilaporkan sebagai agens hayati dengan aktivitas antibiosis
terhadap patogen tanaman, yaitu Streptomyces spp. yang mampu mengendalikan
serangan Rhizoctonia solani pada pembibitan tomat (Cao et al. 2004).
Pengendalian patogen tanaman oleh agens hayati dapat terjadi secara tidak
langsung melalui induksi pertahanan tanaman (induced systemic resistance) dan
produksi senyawa pemacu pertumbuhan tanaman (Berg dan Hallman 2006).
Kondisi tersebut dapat meningkatkan kesehatan dan pertahanan tanaman sehingga
secara tidak langsung dapat menekan serangan patogen. Penapisan mikrob sebagai
agens hayati pengendali suatu jenis penyakit telah banyak dilakukan. Pendekatan
yang umum dilakukan ialah melalui penapisan in vitro dilanjutkan dengan pengujian
efektivitas mikrob terpilih secara in planta. Sampai saat ini, kajian peran biologi
aktinomiset filosfer pada tanaman padi belum banyak dilakukan.

9

Penelitian ini bertujuan mengkaji potensi aktinomiset filosfer dalam
mengendalikan penyakit blas daun yang disebabkan P. oryzae pada tanaman padi
melalui uji efektivitas pengendalian blas in planta. Hasil yang diperoleh diharapkan
dapat dikembangkan untuk mengendalikan blas pada tanaman padi, sehingga
produksinya meningkat melalui aplikasi teknologi yang ramah lingkungan.

3 METODE
Kerangka Penelitian
Kerangka penelitian meliputi isolasi aktinomiset filosfer padi kemudian
dilanjutkan dengan uji aktivitas antifungi isolat aktinomiset terhadap P. oryzae
secara in vitro. Isolat terpilih diuji reaksi hemolitik, hipersensitivitas tembakau
dan uji patogenisitas terhadap padi. Isolat terpilih diidentifikasi berdasarkan gen
16S rRNA, dan deteksi gen penyandi senyawa bioaktif antifungi NRPS dan PKS.
Tahap terakhir adalah uji aplikasi agens hayati dalam menekan penyakit blas daun
di rumah kaca (Gambar 4).
Isolasi aktinomiset asal filosfer padi

Pemurnian isolat

Uji potensi antagonistik isolat aktinomiset terhadap
P. oryzae (uji in vitro)

Uji: hemolisis, respon hipersensitivitas (HR) dan patogenisitas

Karakteristik morfologi dan molekuler berdasarkan gen 16S
rRNA, NRPS dan PKS-I

Uji in planta agens hayati terhadap penyakit blas di rumah kaca

Isolat aktinomiset filosfer padi dengan potensi sebagai agensia pengendali
penyakit blas daun
Gambar 4 Diagram alur penelitian

10

Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2015 sampai Juni 2016
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Uji aplikasi in
planta dilaksanakan di Rumah Kaca Balai Besar Bioteknologi dan Sumberdaya
Genetika Pertanian (BB-Biogen), Bogor.

Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah isolat patogen P. oryzae ras 173 yang
diperoleh dari Balai Besar Padi, Unit Kebun Percobaan Muara, Bogor. Benih padi
varietas Ciherang, bakteri E.coli DH5α, enzim restriksi EcoRI. Media isolasi
aktinomiset yaitu Humic-acid Vitamine agar (HV-A), Actinomycete Isolation
Agar (AIA), dan Starch Caseine Agar (SCA). Media kultivasi Potato Dextrose
Agar (PDA), International Streptomyces Project No. 2 (ISP2), media sporulasi
Oat Meal Agar (OMA), Luria Bertani (LB), Luria Bertani Agar (LA). Kit isolasi
DNA genom dan ekstraksi plasmid dari Genenaid. Alat yang digunakan adalah
Laminar Air Flow (LAF), sentrifugator, vortex, Thermal cycler, mesin
elektroforesis, inkubator bergoyang serta alat-alat yang umum digunakan dalam
percobaan mikrobiologi.
Prosedur Penelitian
Isolasi Aktinomiset Filosfer Padi
Pengambilan sampel daun dilakukan di area persawahan yang terserang
penyakit blas yaitu Sukabumi, Situgede dan Jasinga, Jawa Barat. Sampel daun
diambil dari tanaman padi varietas Ciherang. Metode isolasi aktinomiset filosfer
dilakukan dengan metode pencucian (Jacques dan Morris 1995). Sebanyak 10 g
sampel daun padi dimasukkan ke dalam oven suhu 70oC selama 15 menit untuk
pre-treatment heat shock. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam botol berisi 90
mL garam fisiologis 0.85% steril. Sampel dihomogenkan dengan digoyang 150
rpm selama 1 jam pada suhu ruang. Suspensi yang diperoleh kemudian dilakukan
pengenceran bertingkat 10-1, 10-2, hingga 10-3, kemudian 0,1 mL dari masingmasing seri pengenceran disebar ke cawan Petri masing-masing berisi 3 jenis
media isolasi yaitu media HVA (Humic-Acid Vitamin Agar), SCA (Starch Casein
Agar) dan AIA (Actinomycetes Isolation Agar) (Lampiran 1). Isolat aktinomiset
yang diperoleh dari hasil isolasi kemudian dimurnikan dan dipindahkan ke media
ISP2 (International Streptomyces Project No. 2).
Skrining Aktivitas Antifungi terhadap P. oryzae
Skrining aktivitas antagonistik isolat aktinomiset terhadap patogen
tanaman padi penyebab penyakit blas daun P. oryzae menggunakan metode dual
culture (Khare et al. 2010). Isolat aktinomiset digores pada media Potato
Dextrose Agar (PDA) dengan jarak 3 cm dari koloni P. oryzae. Koloni P. oryzae
berumur 7 hari pada media PDA, diambil menggunakan pelubang steril
berdiameter 6 mm. Pengamatan aktivitas antagonistik diamati selama 7 hari masa

11

inkubasi pada suhu 28oC. Persentase penghambatan pertumbuhan
diukur menggunakan persamaan :
–

P. oryzae

%

Keterangan : D1 = diameter koloni P. oryzae pada kelompok kontrol, D2 =
diameter koloni P. oryzae pada kelompok perlakuan isolat aktinomiset.
Uji Reaksi Hemolisis
Isolat aktinomiset digoreskan pada media Sheep Blood Agar (5% darah
domba dan 2.5% NaCl) dan diinkubasi selama 1-3 hari pada suhu ruang. Jika
terbentuk lisis darah (zona bening di sekitar koloni) menunjukkan adanya aktivitas
hemolitik (produksi hemolisin), yang mengindikasikan bahwa aktinomiset
tersebut diduga patogen pada manusia maupun hewan (Bernal et al. 2015).
Uji Respon Hipersensitivitas dan Patogenisitas
Isolat aktinomiset filosfer dilakukan uji respon hipersensitivitas (HR)
menggunakan tanaman tembakau (dikotil) berumur 2 bulan (Zou 2006). Masingmasing isolat aktinomiset dengan kerapatan ±108 sel/mL dalam kultur ISP2 cair
diinjeksikan ke daun tanaman tembakau menggunakan syringe steril 1 mL (tanpa
jarum). Pengamatan respon hipersensitivitas dilakukan hingga 3-5 hari setelah
injeksi. HR positif ditunjukkan dengan adanya nekrotik pada jaringan daun
tanaman di area injeksi. Percobaan dilakukan tiga kali ulangan untuk setiap isolat
aktinomiset.
Uji patogenisitas terhadap tanaman padi dilakukan menggunakan benih
padi IR64 (14 hst) sebagai model untuk tanaman padi (monokotil). Bagian ujung
daun digunting secara aseptik dan kemudian dicelupkan ke dalam suspensi isolat
uji selama ± 10 detik. Pengamatan gejala penyakit yang timbul dilakukan pada 14
hari setelah inokulasi. Uji patogenisitas negatif apabila isolat aktinomiset tidak
menimbulkan gejala penyakit (nekrotik).
Isolasi DNA Genom Aktinomiset
Isolasi DNA genom isolat aktinomiset terpilih pada penelitian ini
menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) (Geneaid, Taiwan).
Prosedur yang digunakan sesuai dengan manual yang disediakan oleh produsen,
dengan modifikasi yaitu pada tahap pre-lisis sel dan waktu inkubasi tahap lisis.
Tahap pre-lisis yaitu dengan penambahan 200 μL 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA,
dan 1% Triton X-100. Tahap akhir pre-lisis yaitu dengan penambahan 200 μL
bufer lisozim (20 mg/mL lisozim, 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X100, pH 8.0) dan glass beads, lalu tabung mikro dikocok dengan vorteks hingga
pelet terlihat lisis (±20 menit). Tahap isolasi DNA dilanjutkan dengan mengikuti
prosedur Geneaid. Kuantifikasi konsentrasi DNA hasil isolasi dengan
menggunakan alat nanodrop (Thermo Scientific, USA).
Amplifikasi Gen 16S rRNA, Domain A dan KS
DNA yang telah dikuantifikasi kemudian diamplifikasi dengan PCR T1Thermocycler (Biometra, Goettingen, DE). Komponen PCR mix untuk amplifikasi
gen 16S rRNA menggunakan total reaksi 25 µL terdiri atas 3 µL (~100 ng) DNA

12

template, 12.5 µl GoTaq Green Mastermix 2x (Promega, Madison, USA), 1.5 µL
(10 pmol) masing-masing primer 63F dan 1387R (Marchesi et al. 1998), dan 6.5
µL nuclease free water (NFW). Kondisi PCR terdiri atas pre-denaturasi (95ºC, 2
menit), denaturasi (95ºC, 30 detik), annealing (55ºC, 30 detik), elongasi (72ºC, 1
menit), dan elongasi akhir (72ºC, 7 menit).
Amplifikasi gen penyandi domain KS dan domain A dilakukan dengan
menggunakan primer degeneratif K1F (5’-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3’) dan
M6R (5’-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3’) untuk amplifikasi domain KS dan
A3F (5’-GCSTACSYSATSTACACSTCSGG-3’), A7R (5’- SASGTCVCCSGTSCGGTAS-3’) untuk amplifikasi domain A (Ayuso-Sacido dan Genilloud 2004).
PCR mix dengan total reaksi 25 µL terdiri dari 0.25 µL LA Taq polimerase
(TaKaRa, Bio Inc, US), 2.5 µL 10x LA PCR bufer II (dengan Mg2+), 4 µL dNTP
mix (masing-masing 2.5 mM), 4 µL DNA template (< 500 ng), 1.5 µL (10 pmol)
masing-masing primer F dan R, dan 11.25 µL NFW. Kondisi PCR mengikuti
metode Ayuso-Sacido dan Genilloud (2004). Amplikon fragmen DNA penyandi
gen 16S rRNA, domain KS dan domain A divisualisasi menggunakan
elektroforesis dengan gel agarosa 1% (b/v), pewarnaan molekul DNA dilakukan
menggunakan etidium bromida. Isolat yang mempunyai gen penyandi domain KS
menunjukkan terbentuknya pita DNA berukuran 1200-1400 pb dan domain A
berukuran 700-800 pb.
Kloning, Sekuensing dan Analisis Bioinformatika Domain A dan KS
Produk PCR domain A dan KS disub-klon menggunakan TA cloning kit
(Invitrogen, USA) ke dalam vektor kloning pGEMT-Easy (Promega, USA) sesuai
dengan prosedur dari produsen. Vektor pGEMT-Easy yang telah disisipi fragmen
DNA domain KS dan A kemudian ditransformasi ke dalam sel kompeten E. coli
DH5α dengan metode heat shock. Seleksi biru-putih dilakukan untuk seleksi
E.coli rekombinan. Verifikasi hasil kloning menggunakan PCR koloni dan enzim
restriksi EcoRI berdasarkan Sambrook dan Russel (2001). Visualisasi hasil
restriksi dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v).
Plasmid rekombinan yang merupakan produk hasil kloning disekuensing
untuk pembacaan sekuen DNA di perusahaan jasa sekuensing First Base Co.
Primer yang digunakan untuk sekuensing plasmid rekombinan yaitu primer
universal M13F dan M13R. Hasil sekuensing dibandingkan dengan data GenBank
yang terdapat di NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) melalui program Basic Local
Alignment Search Tool Nucleotida (BLAST-N) untuk gen 16S rRNA dan
BLAST-X untuk gen NRPS dan PKS. Untuk pensejajaran serta konstruksi pohon
filogenetik gen 16S rRNA, domain KS (PKS) dan domain A (NRPS) dilakukan
dengan software MEGA 5 (Tamura et al. 2011) berdasarkan neighbor-joining tree
(NJT) (Saitou dan Nei 1987), dan mengacu pada best model TN93+G (Tamura-3
parameter) dengan nilai bootstrap 1000x.
Persiapan Aplikasi Agens Hayati terhadap Penyakit Blas di Rumah Kaca
Isolat murni P. oryzae ditumbuhkan pada media sporulasi, yaitu media
OMA (oat meal agar) selama 10 hari, kemudian dilakukan penggosokan untuk
mencuci koloni cendawan pada permukaan OMA dengan menggunakan kuas
steril. Pencucian pertama ini dilakukan menggunakan akuades steril yang diberi
streptomisin 100 ppm untuk menghilangkan hifa aerial. Koloni yang telah digosok

13

diinkubasi dalam inkubator bercahaya neon 10 volt selama 2 x 24 jam untuk
menginduksi sporulasi. Pemanenan spora dilakukan dengan penambahan akuades
steril yang mengandung 0.1% tween 80 (v/v) ke permukaan koloni P. oryzae.
Spora P. oryzae dipanen dengan cara menggosok-gosok permukaan cendawan
dengan menggunakan kuas steril. Suspensi spora kemudian disaring dan
ditampung dalam Erlenmeyer steril. Kerapatan konidia yang akan digunakan
sebagai inokulum adalah 2 x 105 konidia/mL (IRRI 2002), sesuai SOP BB Padi
(Anggiani 2012). Penghitungan kerapatan konidia dilakukan dengan
menggunakan hemasitometer Neubauer di bawah mikroskop cahaya dengan
perbesaran 400X. Infeksi spora P. oryzae ke daun tanaman padi dilakukan dengan
penyemprotan.
Formulasi yang digunakan pada aplikasi di rumah kaca yaitu kultur suspensi
agens hayati dengan konsentrasi 1 x 105 sel/mL. Suspensi dipersiapkan dengan
kultivasi 11 isolat aktinomiset terpilih pada 100 mL media ISP2 cair dengan
inkubator goyang 120 rpm, suhu ruang selama 7 hari. Aplikasi agens hayati
dilakukan dengan cara penyemprotan kultur suspensi 30 mL/pot dengan masingmasing pot berisi 5 tanaman.
Aplikasi agens hayati untuk penekanan keparahan penyakit blas pada padi
sawah menggunakan benih padi varietas Ciherang yang merupakan varietas rentan
blas. Sebanyak 20 g benih padi varietas Ciherang direndam dalam natrium
hipoklorit 2%, kemudian dikocok selama 2 menit untuk sterilisasi permukaan.
Benih dibilas dengan akuades steril selama 2 menit dengan 3 kali pengulangan
kemudian benih direndam dengan akuades steril semalam. Benih dipindahkan ke
atas kapas lembab steril dan diinkubasi 2 x 24 jam. Benih yang berkecambah
kemudian dipindahkan ke dalam ember plastik (diameter 25 cm, tinggi 25 cm)
berisi campuran tanah persawahan 3 kg dan pupuk kandang sebanyak 300 g.
Setiap ember plastik berisi 5 tanaman.
Rancangan Percobaan Aplikasi Agens Hayati di Rumah Kaca
Rancangan percobaan yang digunakan untuk uji blas daun adalah
Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan 4 ulangan. Aplikasi formula
agens hayati dengan penyemprotan 30 mL suspensi/pot dan dilakukan saat
tanaman padi umur 7 dan 14 hari setelah tanam (HST). Inokulasi spora P. oryzae
dilakukan pada tanaman padi umur 21 HST atau tanaman berdaun 4 sampai 5
helai dengan metode penyemprotan. Konsentrasi inokulum yang digunakan 2 x
105 konidia/mL. Setelah diinokulasi, tanaman diinkubasi dalam kamar lembab
selama 2 x 24 jam, selanjutnya tanaman dipindahkan ke ruang pengkabut selama
± 1-3 minggu (Munif et al. 2012). Kontrol negatif (-) untuk perlakuan tanaman
padi tanpa infeksi P. oryzae maupun agensia hayati, kontrol positif (+) untuk
perlakuan dengan infeksi spora P. oryzae tanpa agens hayati. Tanaman yang telah
diinokulasikan spora P. oryzae harus berada di ruang lembab dengan kelembaban
nisbi dipertahankan di atas 90%. Kelembaban rumah kaca dipertahankan dengan
cara mengalirkan air yang dipompa pada dinding ruang lembab. Daun yang
terserang blas diamati dengan melihat bercak cokelat yang muncul. Pengamatan
gejala dan tingkat serangan penyakit blas dilakukan setiap 3 hari sekali setelah
inokulasi P. oryzae dengan menggunakan metode Standard Evaluation System for
Rice (SES) (IRRI 2002) sesuai SOP BB Padi (Anggiani 2012). Data diambil dari
5 tanaman untuk masing-masing perlakuan dan kontrol, 4-5 daun pada setiap

14

tanaman diberi penilaian penyakit blas bedasarkan SES IRRI (2002) (Tabel 1),
kemudian intensitas blas dan penghambatan relatif (reduksi penyakit blas)
dihitung dengan menggunakan rumus:
Intensitas serangan penyakit blas daun dapat dihitung dengan persamaan :
∑
IB
n
v
N
Z

= Intensitas serangan penyakit blas (%)
= Jumlah daun tanaman yang terserang blas
= Nilai skor serangan
= Jumlah seluruh daun yang diamati
= Nilai skor serangan tertinggi

engham atan relatif

ontrol atogen
ejala erlakuan
x 100
ontrol atogen

Tingkat serangan blas dinilai menggunakan Standar Evaluation for Blast
Disease dari IRRI (2002) (Tabel 1). Pengamatan dilakukan pada jumlah daun
terserang dan besar bercak pada setiap daun terserang. Kriteria tingkat serangan
blas daun padi sebagai berikut:
Tabel 1 Skala skor penyakit blas daun tanaman padi (IRRI 2002)
Skor Sifat Gejala
Tidak ada bercak
0
T
1
T
Bercak sebesar ujung jarum dan berwarna coklat, tidak ada pusat
sporulasi
2
T
Bercak lebih besar dari ujung jarum
3
T
Bercak nekrotik, abu-abu bundar, sedikit memanjang ±1-2 mm
tepi coklat
4
MT Bercak khas blas (belah ketupat) ukuran 3 mm, luas daun
terserang