Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HCT 116
POTENSI SITOTOKSIK EKSTRAK BATANG BUNGA
MATAHARI (Helianthus annuus L.) TERHADAP SEL
KANKER KOLON HCT 116
NASRUDDIN
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Sitotoksik
Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus annuus L.) terhadap Sel Kanker
Kolon HCT 116 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013
Nasruddin
NIM G84090001
ABSTRAK
NASRUDDIN. Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HCT 116. Dibimbing oleh MEGA
SAFITHRI dan I MADE ARTIKA.
Kanker kolon merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan kematian
tertinggi di dunia. Penelitian pada tikus percobaan menunjukkan bahwa
kandungan hemiselulosa batang bunga matahari mempunyai aktivitas anti tumor
kolon. Penelitian ini bertujuan menganalisis senyawa fitokimia dan
mengidentifikasi potensi sitotoksik ekstrak batang bunga matahari (Helianthus
annus L.) pada sel HCT 116. Pengujian aktivitas antikanker dilakukan dengan
menggunakan ekstrak air, ekstrak etanol 30% dan ekstrak etanol 70% dengan
metode MTT assay untuk mengamati viabilitas sel HCT 116 secara kolorimetri,
berdasarkan intensitas warna. Hasil penelitian menunjukkan bahwa batang bunga
matahari mengandung alkaloid, saponin, flavonoid dan tanin. Selain itu, hasil
pengukuran menunjukkan rendemen ekstrak air sebesar 7 ± 0.082%, rendemen
ekstrak etanol 30% sebesar 6 ± 0.08%, sedangkan rendemen ekstrak etanol 70%
sebesar 13 ± 0.06%. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa ekstrak batang
bunga matahari tidak mempengaruhi perkembangan sel normal Chang. Selain itu,
hasil pengujian aktivitas antikanker terhadap sel HCT 116 menunjukkan bahwa
ekstrak air batang bunga matahari mempunyai aktivitas terbaik, dengan
konsentrasi penghambat 50% proliferasi sel HCT 116 sebesar 200 ppm .
Kata kunci: kanker kolon, sel HCT 116, MTT assay, Helianthus annuus L.
ABSTRACT
NASRUDDIN. Citotoxicity Potency of Sunflower (Helianthus annuus L.) Stalk
Extract on Cancer Colon Cell HCT 116. Supervised by MEGA SAFITHRI dan I
MADE ARTIKA.
Colon cancer is one of the disease which contributes to high death in the
world. Previous research on mice showed that the hemicelluloses containing of
stem sunflower colon anti-tumor activity. The purpose of this research was
analyzing phytochemical compounds and investigating citotoxicity potency of
sunflower (Helianthus annuus L.) stalk extract on cell HCT 116. Anti-cancer
activity test was done on water, ethanol 30% and ethanol 70% extract with MTT
assay method to investigate viability of HCT 116 cell colorimetrically, depends on
its colour intensity. The results showed that sunflower stem contained alkaloid,
saponin, flavonoid and tannin. In addition, measurement result showed that water
extract fraction was 7 ± 0.082%, ethanol 30% extract fraction was 6 ± 0.08%, then
ethanol 70% extract fraction was 13 ± 0.06%. Cytotoxicity test showed that
sunflower stem extract does not affect on normal Chang cell proliferation. Then,
anti-cancer test on cell HCT 116 showed that water extract gave the highest effect,
the concentration which can inhibit 50% HCT 116 cell proliferation is 200 ppm.
Keywords: colon cancer, HCT 116 cell, MTT assay, Helianthus annuus L.
POTENSI SITOTOKSIK EKSTRAK BATANG BUNGA
MATAHARI (Helianthus annuus L.) TERHADAP SEL
KANKER KOLON HCT 116
NASRUDDIN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi: Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HeT 116
: Nasruddin
Nama
NIM
: G84090001
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, S. Si, M . Si,
Pembimbing I
Dr I Made Artika, M. App. Sc
Pembimbing II
. Sc
Tanggal Lulus:
.0 B DEC 2D13
Judul Skripsi : Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HCT 116
Nama
: Nasruddin
NIM
: G84090001
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, S. Si, M. Si,
Pembimbing I
Dr I Made Artika, M. App. Sc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr I Made Artika, M. App. Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur atas kehadirat Allah SWT atas rahmat, hidayat, kesehatan dan
kesempatan yang diberikan-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HCT 116”.
Penelitian sebagai salah satu syarat untuk memulai penelitian dalam
memperoleh gelar sarjana di bidang biokimia. Penelitian dilaksanakan pada bulan
Maret sampai bulan Agustus di Seafast Institut Pertanian Bogor, Laboratorium
Biokimia Institut Pertanian Bogor dan Pusat Studi Stawa Primata (PSSP) Institut
Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada
Ibu Dr. Mega Safithri, S. Si, M. Si selaku pembimbing utama serta Bapak Dr. I
Made Artika, M. App. Sc selaku pembimbing kedua yang telah membantu dan
mendukung penyelesaian skripsi ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula
kepada Ibu Hj. Sitti Aminah, Bapak H. Salim AR, Saudara M. Syamsuri dan
Helmi Amarullah, Saudari Atmarita dan kerabat-kerabat biokimia 46 khususnya
Nurul Syifa, yang telah membantu, memberikan dukungan, doa dan semangat.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini sangat jauh dari kesempurnaan. Oleh
karena itu, penulis berharap kritik dan saran yang membangun untuk memperbaiki
skripsi ini.
Bogor, Juli 2013
Nasruddin
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
BAHAN DAN METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Analisis Data
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
5
5
10
12
Simpulan
12
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
14
RIWAYAT HIDUP
20
DAFTAR TABEL
1 Rendemen ekstrak batang bunga matahari (%)
2 Hasil uji fitokimia
5
5
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
Morfologi sel Chang
Morfologi sel HCT 116
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak air terhadap sel Chang
Hasil uji aktivitas antikanker ekstrak air terhadap sel HCT 116
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanol 30% terhadap sel Chang
Hasil uji aktivitas antikanker ekstrak etanol 30% terhadap sel HCT 116
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanol 70% terhadap sel Chang
Hasil uji aktivitas antikanker ekstrak etanol 70% terhadap sel HCT 116
6
6
7
7
8
8
9
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Tahapan penelitian
2 Korelasi antara konsentrasi dan daya inhibisi ekstrak pada uji
sitotoksisitas terhadap sel Chang
3 Hasil uji fitokimia
4 Inhibisi ekstrak batang bunga matahari terhadap sel HCT 116
5 Persen inhibisi ekstrak pada uji sitotoksisitas terhadap sel Chang
6 Persen inhibisi ekstrak pada uji antiknaker terhadap sel HCT 116
14
15
16
17
18
19
PENDAHULUAN
Kanker merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan kematian
tertinggi di dunia. Menurut WHO dan IARC (International Agency for Research
on Cancer) (2013) yang dikemukakan pada World Cancer Day 2013 (tanggal 4
Februari) menjelaskan bahwa jumlah kematian penduduk dunia yang disebabkan
oleh kanker mencapai 7.6 juta jiwa, 70% penderita mengalami kematian,
sedangkan 30% penderita lainnya dapat disembuhkan. Jumlah ini diperkirakan
mengalami peningkatan hingga mencapai 13.1 juta jiwa pada tahun 2030 (WHO
2013).
Salah satu jenis kanker yang sering diderita oleh penduduk dunia adalah
kanker kolon (WHO 2013). Kanker kolon merupakan kanker yang berkembang
pada salah satu organ pencernaan, yaitu usus (Rominiyi et al. 2011). Kanker kolon
juga berperan dalam perkembangan kanker kolorektal, yaitu kanker yang
menyerang kolon dan rektum (Nemoto et al. 2009). Kematian penduduk dunia
yang disebabkan oleh kanker kolorektal mencapai 608 ribu jiwa (WHO 2013).
Biasanya, pengobatan dilakukan dengan menggabungkan beberapa
perlakuan seperti kemoterapi, operasi, radioterapi, imunoterapi dan terapi
fotodinamik (Adamson et al. 2005). Namun, resiko munculnya efek samping yang
berbahaya terjadi apabila perlakuan-perlakuan dalam terapi kanker mempengaruhi
metabolisme sel normal (Uzuner et al. 2012). Selain itu, peluang timbulnya
resistensi obat kanker menjadi salah satu hal penting yang perlu diperhatikan,
sebagai akibat dari efflux pump dan peningkatan jalur anti-apoptosis terhadap
obat-obatan yang digunakan dalam terapi kanker (Creixell & Peppas 2012). Oleh
sebab itu, pemanfaatan obat-obatan herbal dapat dijadikan sebagai salah satu
pengobatan alternatif yang menimbulkan efek samping minimal, penghambatan
efflux pump dan penghambatan jalur anti-apoptosis dengan dosis yang relatif
sedikit (Debbie et al. 2012).
Salah satu tanaman herbal yang dapat digunakan dalam pengobatan adalah
bunga matahari. Pemanfaatan bunga matahari selama ini lebih cenderung pada
bagian bunga atau biji, sedangkan batang bunga matahari jarang dimanfaatkan
dalam pengobatan. Oleh karena itu, identifikasi metabolit sekunder batang bunga
matahari serta potensinya sebagai antikanker perlu dilakukan untuk
mengoptimalkan pemanfaatannya. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
kandungan hemiselulosa batang bunga matahari berperan sebagai anti tumor
kolon pada tikus percobaan (Barlow et al. 2012). Namun, penelitian tentang
potensi batang bunga matahari sebagai antikanker terhadap sel HCT 116 belum
pernah dilakukan.
Penelitian ini bertujuan menganalisis senyawa fitokimia dan
mengidentifikasi potensi sitotoksik ekstrak batang bunga matahari (Helianthus
annus L.) terhadap sel Chang dan aktivitas antikanker pada sel HCT 116. Sel
Chang merupakan sel hati normal, digunakan sebagai indikator keamanan obat
karena sel hati melaksanakan lebih banyak proses metabolisme dibandingkan sel
pada organ lain. Selanjutnya, sel HCT 116 merupakan sel kolon yang terinduksi
kanker, sehingga dapat digunakan dalam pengujian aktivitas antikanker kolon
ekstrak batang bunga matahari.
2
Hasil penelitian tentang potensi ekstrak batang bunga matahari sebagai
antikanker kolon dapat memberikan penjelasan ilmiah tentang kemungkinan
adanya aktivitas antikanker pada batang bunga matahari. Penelitian ini diharapkan
mampu membuktikan bahwa ekstrak air, ekstrak etanol 30% dan ekstrak etanol
70% batang bunga matahari berperan sebagai antikanker. Selain itu, hasil uji
sitotoksisitasnya diharapkan memberi informasi bahwa ekstrak batang bunga
matahari dapat digunakan secara efisien (dengan dosis yang kecil).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Maret sampai bulan Agustus 2013.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor,
Labotarorium Seafast Institut Pertanian Bogor dan Balai Pusat Studi Satwa
Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada tahapan ekstraksi adalah batang bunga
matahari (Helianthus annuus L.), air, etanol 30% dan etanol 70%. Bahan yang
digunakan pada uji fitokimia, yaitu kertas saring Whatmann No.1, kloroform,
amoniak, H2SO4, etanol 30%, etanol 70 %, akuades, pereaksi Mayer’s, pereaksi
Wagner, etanol 95 %, logam Mg, FeCl3, dan anhidrida asetat. Bahan yang
digunakan pada uji sitotoksik dan antikanker, yaitu: sel Chang (pada uji
sitotoksik), sel kanker kolon HCT 116 (uji antikanker), Fetal Bovine Serum
(FBS), Media Rosewall Park Memorial Institute (RPMI) 1640, kanamisin, 3-(4-,5
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT), larutan SDS 10%,
HCl, kristal formazan, alkohol 70%,
Alat-alat yang digunakan pada tahapan ekstraksi adalah neraca analitik dan
alat pengilingan dan rotavapor. Alat yang digunakan pada tahapan uji fitokimia
adalah penangas air. Alat yang digunakan dalam pengujian sitotoksisitas dan
antikanker, yaitu: microplate 50 nm, perangkat sumur kultur, mikropipet, dan
microplate reader.
Metode Penelitian
Persiapan Sampel Batang Bunga Matahari (Tiwari 2011).
Bunga matahari yang digunakan sebagai sampel percobaan berasal dari
Lembang, Bandung. Tahapan awal persiapan sampel adalah pemotongan batang
bunga matahari secara melintang sesuai metode Tiwari et al. (2011). Selanjutnya,
potongan-potongan batang bunga matahari dikeringkan selama 3 hari
menggunakan oven pada suhu 650C. Potongan-potongan batang bunga matahari
yang kering kemudian giling hingga berukuran 100 mesh. Selanjutnya, serbuk
batang bunga matahari siap digunakan dalam tahapan ekstraksi.
3
Penentuan Kadar Air
Penetuan kadar air dilakukan dengan menyiapkan 20 gram sampel simplisia
ke dalam wadah tahan panas. Selanjutnya, pengukuran bobot wadah kosong juga
dilakukan untuk mengetahui jumlah air yang menguap selama pemanasan
dilakukan (Apriyantono et al. 2005). Pemanasan dilakukan selama 24 jam pada
suhu 1050C. Pengukuran kadar air menggunakan rumus:
Kadar air =
–
x 100%
Ekstraksi Batang Bunga Matahari
Ekstraksi serbuk batang bunga matahari dilakukan dengan metode
maserasi. Serbuk batang bunga matahari sebanyak 20 gram dilarutkan ke dalam
200 mL air, etanol 30% dan etanol 70% (1:10) selama 24 jam (Depkes RI 2000).
Ekstraksi dilakukan terhadap endapan batang bunga matahari dengan penambahan
pelarut dalam jumlah yang sama (200 mL) untuk dua hari selanjutnya.
Selanjutnya, penyaringan dilakukan untuk memisahkan filtrat dari ekstrak serbuk
batang bunga matahari.
Analisis Fitokimia
Analisis fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak batang bunga matahari
(Helianthus annuus L.) berdasarkan metode yang ditulis Tiwari et al. (2011).
Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 gram masing-masing ekstrak ditambahkan 3
mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan
dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil, kemudian ditambahkan pereaksi
Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih
oleh pereaksi Meyer dan endapan coklat oleh pereaksi Wagner.
Uji Saponin dan Flavonoid. Sebanyak 1 gram masing-masing ekstrak
dimasukan dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan
didihkan selama 5 menit, setelah itu disaring dan filtratnya digunakan untuk
pengujian. Uji saponin dilakukan dengan pengocokan 10 mL filtrat dalam tabung
reaksi tertutup selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya
saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih/busa yang stabil.
Sebanyak 10 mL filtrat yang lain ditambahkan 0.5 gram serbuk
magnesium, 2 mL alkohol karbohidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95%
dengan perbandingan 1:1 dan 20 mL amil alkohol kemudian dikocok kuat.
Terbentuknya warna merah, kuning, dan jingga pada lapisan amil alkohol
menunjukan adanya flavonoid.
Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram masing-masing ekstrak ditambahkan 2 mL
air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Lalu disaring dan filtratnya
ditambah 1 tetes FeCl3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan
menunjukkan adanya tannin.
Uji Terpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram masing-masing ekstrak
ditambah 2 mL etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan
kemudian ditambah eter 1:1. Lapisan eter ditambah pereaksi Lieberman Burchard
(3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah dan warna
hijau menunjukan adanya terpenoid dan warna hijau menunjukan adanya steroid.
4
Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT Assay menggunakan Sel Chang
Pengujian secara kolorimetri menggunakan 3-(4-,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) sesuai metode Huang et al. (2010).
Ekstrak batang matahari sebanyak 10 µL pada berbagai konsentrasi (0, 0.008,
0.016 , 0.032, 0.063, 0.125, 0.25, 0.50, dan 1 mg/mL) ditambahkan ke dalam
kultur sel Chang sehari setelah transplantasi. Sel Chang yang tidak diberi
perlakuan digunakan sebagai kontrol negatif. Pada hari ketiga ditambahkan 20 µL
reagen MTT sebanyak 5 mg/ml per sumur. Setelah 4 jam inkubasi ditambahkan
100 µL larutan 10% SDS-0.01 N HCl ke dalam tiap sumur. Selanjutnya kristal
formazan ditambahkan dalam tiap sumur, dilarutkan dengan pengadukan
menggunakan mikropipet. Kemudian, pengukuran densitas optik dilakukan
menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua
tahapan dilakukan triplo.
Uji Antikanker dengan Metode MTT Assay menggunakan Sel HCT 116
Uji aktivitas antikanker dilakukan secara in vitro pada sel kanker (sel HCT
116) menggunakan metode yang dikembangkan oleh Yang et al. (2010). Sel
kanker dibiakkan dalam media RPMI-1640, dilengkapi dengan 5% FBS (Fetal
Bovine Serume) dan kanamisin (100 µg/ml). Sel (3x103 sel per sumur) di kultur
dalam mikroplate berisi 100 µL media pertumbuhan per sumur dan diinkubasikan
pada suhu 37oC selama 24 jam dalam kelembaban air 95% dan atmosfer 5% CO2.
Pengujian secara kolorimetri menggunakan 3-(4-,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) digunakan untuk menentukan proliferasi
dan viabilitas sel. Ekstrak batang bunga matahari sebanyak 100 µL pada berbagai
konsentrasi (IC50, 1/2 IC50, 1/4 IC50, 1/8 IC50, 1/16 IC50 sel hct116) ditambahkan ke
dalam kultur sel sehari setelah transplantasi. Sel kanker yang tidak diberi
perlakuan digunakan sebagai kontrol negatif. Setelah 48 jam ditambahkan 10
µL/sumur reagen MTT konsentrasi 5 mg/ml per sumur. Setelah 4 jam inkubasi,
ditambahkan 100 µL larutan 0.01 N HCl dalam isopropanol ke dalam tiap sumur.
Pengukuran densitas optik dilakukan menggunakan microplate reader pada
panjang gelombang 595 nm. Semua tahapan dilakukan duplo.
Analisis Data
Rancangan percobaan pada penelitian ini adalah rancanan acak lengkap
(RAL) satu faktor dengan tiga kelompok perlakuan dan tiga kali ulangan (Mattjik
2002). Analisis data menggunakan ANOVA dengan model rancang sebagai
berikut:
Yij
= μ + αi + εij
Keterangan:
μ
= Pengaruh rataan umum
αi
= Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1,2,3,4,5
εij
= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3,4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Batang Bunga Matahari
Berdasarkan hasil penelitian, kadar air batang bunga matahari sebesar
18.58%. Hasil pengukuran rendemen menunjukkan nilai rendemen yang berbeda
pada ekstrak yang dilarutkan dengan pelarut yang berbeda yang dapat diamati
pada Tabel 1. Rendemen tertinggi terdapat pada ekstrak etanol 70% yang berbeda
nyata dengan ekstrak air dan ekstrak etanol 30%, sedangkan nilai rendemen
ekstrak air dan etanol 30% tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan.
Tabel 1 Rendemen ekstrak batang bunga matahari (%)
Jenis Ekstrak
Ekstrak air
Ekstrak etanol 30%
Ekstrak etanol 70%
Rendemen (%)
7 ± 0.082*
6 ± 0.08*
13 ± 0.06*
*n (ulangan) sebanyak tiga kali
Analisis Fitokimia
Tahapan penelitian selanjutnya adalah analisis fitokimia. Analisis
fitokimia merupakan tahapan identifikasi metabolit sekunder secara kualitatif
ekstrak batang bunga matahari dengan pelarut yang berbeda. Komponen bioaktif
yang diidentifikasi, yaitu: alkaloid, saponin, flavonoid, tanin, terpenoid dan
steroid. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak air, ekstrak etanol 30% dan
ekstrak etanol 70% tidak mengandung terpenoid dan steroid. Selain itu, ekstrak air
mengandung saponin, yang tidak terkandung pada ekstrak etanol 30% dan ekstrak
etanol 70%. Hasil uji fitokimia dapat diamati pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil uji fitokimia
Jenis Uji
Ekstrak
Air
Etanol 30%
Etanol 70%
Alkaloid*
+
+
+
Saponin*
+
-
-
Flavonoid*
+
+
+
Tanin*
+
+
+
Terpenoid*
-
-
-
Steroid*
-
-
-
*n (ulangan) sebanyak tiga kali
Uji Sitotoksisitas dan Antikanker
Uji sitoksisitas perlu dilakukan untuk mengidentifikasi tingkat toksisitas
ekstrak terhadap sel normal. Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel
6
Chang. Pengujian ini berkaitan dengan keamanan penggunaan ekstrak). Selain itu,
tahapan penting dalam penelitian tentang potensi antikanker ekstrak batang bunga
matahari adalah pengujian aktivitas antikanker, yang dilakukan terhadap sel HCT
116. Pengujian sitotoksisitas dan antikanker dilakukan dengan metode MTT assay.
Intensitas warna yang terbentuk digunakan untuk mengidentifikasi tingkat
proliferasi sel Chang dan sel HCT116. Pengamatan morfologi sel Chang dan sel
HCT116 merupakan tahapan penting untuk mengidentifikasi kondisi sel yang
diberi perlakuan ekstrak. Pengamatan dilakukan terhadap kelompok perlakuan dan
kelompok kontrol. Hasil pengamatan terhadap morfologi sel Chang dapat dilihat
pada Gambar 1, sedangkan hasil pengamatan terhadap morfologi sel HCT 116
dapat dilihat pada Gambar 2. Perbedaan morfologi sel dapat diamati dari jumlah
dan tingkat kerusakan sel. Tingkat kerusakan sel yang dialami oleh sel HCT 116
yang semakin besar pada kelompok perlakuan menunjukkan daya inhibisi
proliferasi ekstrak.
(a)
(b)
Gambar 1 Efek ekstrak terhadap sel Chang: (a) Morfologi sel Chang yang
ditambahkan ekstrak (b) Morfologi sel Chang tanpa ekstrak
(perbesaran 40 kali)
(a)
(b)
Gambar 2 Efek ekstrak terhadap sel HCT 116: (a) Morfologi sel HCT 116 tanpa
ekstrak (b) Morfologi sel HCT 116 yang ditambahkan ekstrak
(perbesaran 40 kali)
7
Inhibisi (%)
Hasil pengujian terhadap ekstrak air ditampilkan pada Gambar 3 dan
Gambar 4. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak air batang bunga matahari terhadap sel
Chang menunjukkan hubungan yang fluktuatif antara konsentrasi ekstrak dan
persen inhibisi sel Chang yang dapat diamati pada Gambar 3. Selain itu, uji
sitotoksisitas menunjukkan bahwa ekstrak air menghambat sebanyak 50% sel
Chang dengan konsentrasi yang lebih besar dari 1000 ppm. Selanjutnya,
pengujian ekstrak air batang bunga matahari terhadap sel HCT 116 (seperti yang
dapat diamati pada Gambar 4) menunjukkan bahwa persen inhibisi sel HCT 116
berkorelasi positif dengan meningkatkan konsentrasi ekstrak air. Selain itu,
kemampuan inhibisi sel HCT 116 sebanyak 50% oleh ekstrak air batang bunga
matari berlangsung pada konsentrasi sekitar 200 ppm. Hasil uji statistik
menunjukkan bahwa ekstrak air mempunyai galat yang lebih besar dari nilai α
(p
MATAHARI (Helianthus annuus L.) TERHADAP SEL
KANKER KOLON HCT 116
NASRUDDIN
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Potensi Sitotoksik
Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus annuus L.) terhadap Sel Kanker
Kolon HCT 116 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2013
Nasruddin
NIM G84090001
ABSTRAK
NASRUDDIN. Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HCT 116. Dibimbing oleh MEGA
SAFITHRI dan I MADE ARTIKA.
Kanker kolon merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan kematian
tertinggi di dunia. Penelitian pada tikus percobaan menunjukkan bahwa
kandungan hemiselulosa batang bunga matahari mempunyai aktivitas anti tumor
kolon. Penelitian ini bertujuan menganalisis senyawa fitokimia dan
mengidentifikasi potensi sitotoksik ekstrak batang bunga matahari (Helianthus
annus L.) pada sel HCT 116. Pengujian aktivitas antikanker dilakukan dengan
menggunakan ekstrak air, ekstrak etanol 30% dan ekstrak etanol 70% dengan
metode MTT assay untuk mengamati viabilitas sel HCT 116 secara kolorimetri,
berdasarkan intensitas warna. Hasil penelitian menunjukkan bahwa batang bunga
matahari mengandung alkaloid, saponin, flavonoid dan tanin. Selain itu, hasil
pengukuran menunjukkan rendemen ekstrak air sebesar 7 ± 0.082%, rendemen
ekstrak etanol 30% sebesar 6 ± 0.08%, sedangkan rendemen ekstrak etanol 70%
sebesar 13 ± 0.06%. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa ekstrak batang
bunga matahari tidak mempengaruhi perkembangan sel normal Chang. Selain itu,
hasil pengujian aktivitas antikanker terhadap sel HCT 116 menunjukkan bahwa
ekstrak air batang bunga matahari mempunyai aktivitas terbaik, dengan
konsentrasi penghambat 50% proliferasi sel HCT 116 sebesar 200 ppm .
Kata kunci: kanker kolon, sel HCT 116, MTT assay, Helianthus annuus L.
ABSTRACT
NASRUDDIN. Citotoxicity Potency of Sunflower (Helianthus annuus L.) Stalk
Extract on Cancer Colon Cell HCT 116. Supervised by MEGA SAFITHRI dan I
MADE ARTIKA.
Colon cancer is one of the disease which contributes to high death in the
world. Previous research on mice showed that the hemicelluloses containing of
stem sunflower colon anti-tumor activity. The purpose of this research was
analyzing phytochemical compounds and investigating citotoxicity potency of
sunflower (Helianthus annuus L.) stalk extract on cell HCT 116. Anti-cancer
activity test was done on water, ethanol 30% and ethanol 70% extract with MTT
assay method to investigate viability of HCT 116 cell colorimetrically, depends on
its colour intensity. The results showed that sunflower stem contained alkaloid,
saponin, flavonoid and tannin. In addition, measurement result showed that water
extract fraction was 7 ± 0.082%, ethanol 30% extract fraction was 6 ± 0.08%, then
ethanol 70% extract fraction was 13 ± 0.06%. Cytotoxicity test showed that
sunflower stem extract does not affect on normal Chang cell proliferation. Then,
anti-cancer test on cell HCT 116 showed that water extract gave the highest effect,
the concentration which can inhibit 50% HCT 116 cell proliferation is 200 ppm.
Keywords: colon cancer, HCT 116 cell, MTT assay, Helianthus annuus L.
POTENSI SITOTOKSIK EKSTRAK BATANG BUNGA
MATAHARI (Helianthus annuus L.) TERHADAP SEL
KANKER KOLON HCT 116
NASRUDDIN
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi: Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HeT 116
: Nasruddin
Nama
NIM
: G84090001
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, S. Si, M . Si,
Pembimbing I
Dr I Made Artika, M. App. Sc
Pembimbing II
. Sc
Tanggal Lulus:
.0 B DEC 2D13
Judul Skripsi : Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HCT 116
Nama
: Nasruddin
NIM
: G84090001
Disetujui oleh
Dr Mega Safithri, S. Si, M. Si,
Pembimbing I
Dr I Made Artika, M. App. Sc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr I Made Artika, M. App. Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur atas kehadirat Allah SWT atas rahmat, hidayat, kesehatan dan
kesempatan yang diberikan-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi
yang berjudul “Potensi Sitotoksik Ekstrak Batang Bunga Matahari (Helianthus
annuus L.) terhadap Sel Kanker Kolon HCT 116”.
Penelitian sebagai salah satu syarat untuk memulai penelitian dalam
memperoleh gelar sarjana di bidang biokimia. Penelitian dilaksanakan pada bulan
Maret sampai bulan Agustus di Seafast Institut Pertanian Bogor, Laboratorium
Biokimia Institut Pertanian Bogor dan Pusat Studi Stawa Primata (PSSP) Institut
Pertanian Bogor.
Ucapan terima kasih yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada
Ibu Dr. Mega Safithri, S. Si, M. Si selaku pembimbing utama serta Bapak Dr. I
Made Artika, M. App. Sc selaku pembimbing kedua yang telah membantu dan
mendukung penyelesaian skripsi ini. Ucapan terima kasih penulis sampaikan pula
kepada Ibu Hj. Sitti Aminah, Bapak H. Salim AR, Saudara M. Syamsuri dan
Helmi Amarullah, Saudari Atmarita dan kerabat-kerabat biokimia 46 khususnya
Nurul Syifa, yang telah membantu, memberikan dukungan, doa dan semangat.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini sangat jauh dari kesempurnaan. Oleh
karena itu, penulis berharap kritik dan saran yang membangun untuk memperbaiki
skripsi ini.
Bogor, Juli 2013
Nasruddin
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
BAHAN DAN METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Analisis Data
4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Pembahasan
SIMPULAN DAN SARAN
5
5
10
12
Simpulan
12
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
14
RIWAYAT HIDUP
20
DAFTAR TABEL
1 Rendemen ekstrak batang bunga matahari (%)
2 Hasil uji fitokimia
5
5
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
Morfologi sel Chang
Morfologi sel HCT 116
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak air terhadap sel Chang
Hasil uji aktivitas antikanker ekstrak air terhadap sel HCT 116
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanol 30% terhadap sel Chang
Hasil uji aktivitas antikanker ekstrak etanol 30% terhadap sel HCT 116
Hasil uji sitotoksisitas ekstrak etanol 70% terhadap sel Chang
Hasil uji aktivitas antikanker ekstrak etanol 70% terhadap sel HCT 116
6
6
7
7
8
8
9
9
DAFTAR LAMPIRAN
1 Tahapan penelitian
2 Korelasi antara konsentrasi dan daya inhibisi ekstrak pada uji
sitotoksisitas terhadap sel Chang
3 Hasil uji fitokimia
4 Inhibisi ekstrak batang bunga matahari terhadap sel HCT 116
5 Persen inhibisi ekstrak pada uji sitotoksisitas terhadap sel Chang
6 Persen inhibisi ekstrak pada uji antiknaker terhadap sel HCT 116
14
15
16
17
18
19
PENDAHULUAN
Kanker merupakan salah satu penyakit yang menyebabkan kematian
tertinggi di dunia. Menurut WHO dan IARC (International Agency for Research
on Cancer) (2013) yang dikemukakan pada World Cancer Day 2013 (tanggal 4
Februari) menjelaskan bahwa jumlah kematian penduduk dunia yang disebabkan
oleh kanker mencapai 7.6 juta jiwa, 70% penderita mengalami kematian,
sedangkan 30% penderita lainnya dapat disembuhkan. Jumlah ini diperkirakan
mengalami peningkatan hingga mencapai 13.1 juta jiwa pada tahun 2030 (WHO
2013).
Salah satu jenis kanker yang sering diderita oleh penduduk dunia adalah
kanker kolon (WHO 2013). Kanker kolon merupakan kanker yang berkembang
pada salah satu organ pencernaan, yaitu usus (Rominiyi et al. 2011). Kanker kolon
juga berperan dalam perkembangan kanker kolorektal, yaitu kanker yang
menyerang kolon dan rektum (Nemoto et al. 2009). Kematian penduduk dunia
yang disebabkan oleh kanker kolorektal mencapai 608 ribu jiwa (WHO 2013).
Biasanya, pengobatan dilakukan dengan menggabungkan beberapa
perlakuan seperti kemoterapi, operasi, radioterapi, imunoterapi dan terapi
fotodinamik (Adamson et al. 2005). Namun, resiko munculnya efek samping yang
berbahaya terjadi apabila perlakuan-perlakuan dalam terapi kanker mempengaruhi
metabolisme sel normal (Uzuner et al. 2012). Selain itu, peluang timbulnya
resistensi obat kanker menjadi salah satu hal penting yang perlu diperhatikan,
sebagai akibat dari efflux pump dan peningkatan jalur anti-apoptosis terhadap
obat-obatan yang digunakan dalam terapi kanker (Creixell & Peppas 2012). Oleh
sebab itu, pemanfaatan obat-obatan herbal dapat dijadikan sebagai salah satu
pengobatan alternatif yang menimbulkan efek samping minimal, penghambatan
efflux pump dan penghambatan jalur anti-apoptosis dengan dosis yang relatif
sedikit (Debbie et al. 2012).
Salah satu tanaman herbal yang dapat digunakan dalam pengobatan adalah
bunga matahari. Pemanfaatan bunga matahari selama ini lebih cenderung pada
bagian bunga atau biji, sedangkan batang bunga matahari jarang dimanfaatkan
dalam pengobatan. Oleh karena itu, identifikasi metabolit sekunder batang bunga
matahari serta potensinya sebagai antikanker perlu dilakukan untuk
mengoptimalkan pemanfaatannya. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa
kandungan hemiselulosa batang bunga matahari berperan sebagai anti tumor
kolon pada tikus percobaan (Barlow et al. 2012). Namun, penelitian tentang
potensi batang bunga matahari sebagai antikanker terhadap sel HCT 116 belum
pernah dilakukan.
Penelitian ini bertujuan menganalisis senyawa fitokimia dan
mengidentifikasi potensi sitotoksik ekstrak batang bunga matahari (Helianthus
annus L.) terhadap sel Chang dan aktivitas antikanker pada sel HCT 116. Sel
Chang merupakan sel hati normal, digunakan sebagai indikator keamanan obat
karena sel hati melaksanakan lebih banyak proses metabolisme dibandingkan sel
pada organ lain. Selanjutnya, sel HCT 116 merupakan sel kolon yang terinduksi
kanker, sehingga dapat digunakan dalam pengujian aktivitas antikanker kolon
ekstrak batang bunga matahari.
2
Hasil penelitian tentang potensi ekstrak batang bunga matahari sebagai
antikanker kolon dapat memberikan penjelasan ilmiah tentang kemungkinan
adanya aktivitas antikanker pada batang bunga matahari. Penelitian ini diharapkan
mampu membuktikan bahwa ekstrak air, ekstrak etanol 30% dan ekstrak etanol
70% batang bunga matahari berperan sebagai antikanker. Selain itu, hasil uji
sitotoksisitasnya diharapkan memberi informasi bahwa ekstrak batang bunga
matahari dapat digunakan secara efisien (dengan dosis yang kecil).
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Maret sampai bulan Agustus 2013.
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Institut Pertanian Bogor,
Labotarorium Seafast Institut Pertanian Bogor dan Balai Pusat Studi Satwa
Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada tahapan ekstraksi adalah batang bunga
matahari (Helianthus annuus L.), air, etanol 30% dan etanol 70%. Bahan yang
digunakan pada uji fitokimia, yaitu kertas saring Whatmann No.1, kloroform,
amoniak, H2SO4, etanol 30%, etanol 70 %, akuades, pereaksi Mayer’s, pereaksi
Wagner, etanol 95 %, logam Mg, FeCl3, dan anhidrida asetat. Bahan yang
digunakan pada uji sitotoksik dan antikanker, yaitu: sel Chang (pada uji
sitotoksik), sel kanker kolon HCT 116 (uji antikanker), Fetal Bovine Serum
(FBS), Media Rosewall Park Memorial Institute (RPMI) 1640, kanamisin, 3-(4-,5
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT), larutan SDS 10%,
HCl, kristal formazan, alkohol 70%,
Alat-alat yang digunakan pada tahapan ekstraksi adalah neraca analitik dan
alat pengilingan dan rotavapor. Alat yang digunakan pada tahapan uji fitokimia
adalah penangas air. Alat yang digunakan dalam pengujian sitotoksisitas dan
antikanker, yaitu: microplate 50 nm, perangkat sumur kultur, mikropipet, dan
microplate reader.
Metode Penelitian
Persiapan Sampel Batang Bunga Matahari (Tiwari 2011).
Bunga matahari yang digunakan sebagai sampel percobaan berasal dari
Lembang, Bandung. Tahapan awal persiapan sampel adalah pemotongan batang
bunga matahari secara melintang sesuai metode Tiwari et al. (2011). Selanjutnya,
potongan-potongan batang bunga matahari dikeringkan selama 3 hari
menggunakan oven pada suhu 650C. Potongan-potongan batang bunga matahari
yang kering kemudian giling hingga berukuran 100 mesh. Selanjutnya, serbuk
batang bunga matahari siap digunakan dalam tahapan ekstraksi.
3
Penentuan Kadar Air
Penetuan kadar air dilakukan dengan menyiapkan 20 gram sampel simplisia
ke dalam wadah tahan panas. Selanjutnya, pengukuran bobot wadah kosong juga
dilakukan untuk mengetahui jumlah air yang menguap selama pemanasan
dilakukan (Apriyantono et al. 2005). Pemanasan dilakukan selama 24 jam pada
suhu 1050C. Pengukuran kadar air menggunakan rumus:
Kadar air =
–
x 100%
Ekstraksi Batang Bunga Matahari
Ekstraksi serbuk batang bunga matahari dilakukan dengan metode
maserasi. Serbuk batang bunga matahari sebanyak 20 gram dilarutkan ke dalam
200 mL air, etanol 30% dan etanol 70% (1:10) selama 24 jam (Depkes RI 2000).
Ekstraksi dilakukan terhadap endapan batang bunga matahari dengan penambahan
pelarut dalam jumlah yang sama (200 mL) untuk dua hari selanjutnya.
Selanjutnya, penyaringan dilakukan untuk memisahkan filtrat dari ekstrak serbuk
batang bunga matahari.
Analisis Fitokimia
Analisis fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak batang bunga matahari
(Helianthus annuus L.) berdasarkan metode yang ditulis Tiwari et al. (2011).
Uji Alkaloid. Sebanyak 0.1 gram masing-masing ekstrak ditambahkan 3
mL kloroform dan 3 tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan
dengan 10 tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam diambil, kemudian ditambahkan pereaksi
Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih
oleh pereaksi Meyer dan endapan coklat oleh pereaksi Wagner.
Uji Saponin dan Flavonoid. Sebanyak 1 gram masing-masing ekstrak
dimasukan dalam gelas piala kemudian ditambahkan 100 ml air panas dan
didihkan selama 5 menit, setelah itu disaring dan filtratnya digunakan untuk
pengujian. Uji saponin dilakukan dengan pengocokan 10 mL filtrat dalam tabung
reaksi tertutup selama 10 detik kemudian dibiarkan selama 10 menit. Adanya
saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih/busa yang stabil.
Sebanyak 10 mL filtrat yang lain ditambahkan 0.5 gram serbuk
magnesium, 2 mL alkohol karbohidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95%
dengan perbandingan 1:1 dan 20 mL amil alkohol kemudian dikocok kuat.
Terbentuknya warna merah, kuning, dan jingga pada lapisan amil alkohol
menunjukan adanya flavonoid.
Uji Tanin. Sebanyak 0.1 gram masing-masing ekstrak ditambahkan 2 mL
air kemudian dididihkan selama beberapa menit. Lalu disaring dan filtratnya
ditambah 1 tetes FeCl3 1% (b/v). Warna biru tua atau hitam kehijauan
menunjukkan adanya tannin.
Uji Terpenoid dan Steroid. Sebanyak 0.1 gram masing-masing ekstrak
ditambah 2 mL etanol 30% lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya diuapkan
kemudian ditambah eter 1:1. Lapisan eter ditambah pereaksi Lieberman Burchard
(3 tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah dan warna
hijau menunjukan adanya terpenoid dan warna hijau menunjukan adanya steroid.
4
Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT Assay menggunakan Sel Chang
Pengujian secara kolorimetri menggunakan 3-(4-,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) sesuai metode Huang et al. (2010).
Ekstrak batang matahari sebanyak 10 µL pada berbagai konsentrasi (0, 0.008,
0.016 , 0.032, 0.063, 0.125, 0.25, 0.50, dan 1 mg/mL) ditambahkan ke dalam
kultur sel Chang sehari setelah transplantasi. Sel Chang yang tidak diberi
perlakuan digunakan sebagai kontrol negatif. Pada hari ketiga ditambahkan 20 µL
reagen MTT sebanyak 5 mg/ml per sumur. Setelah 4 jam inkubasi ditambahkan
100 µL larutan 10% SDS-0.01 N HCl ke dalam tiap sumur. Selanjutnya kristal
formazan ditambahkan dalam tiap sumur, dilarutkan dengan pengadukan
menggunakan mikropipet. Kemudian, pengukuran densitas optik dilakukan
menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm. Semua
tahapan dilakukan triplo.
Uji Antikanker dengan Metode MTT Assay menggunakan Sel HCT 116
Uji aktivitas antikanker dilakukan secara in vitro pada sel kanker (sel HCT
116) menggunakan metode yang dikembangkan oleh Yang et al. (2010). Sel
kanker dibiakkan dalam media RPMI-1640, dilengkapi dengan 5% FBS (Fetal
Bovine Serume) dan kanamisin (100 µg/ml). Sel (3x103 sel per sumur) di kultur
dalam mikroplate berisi 100 µL media pertumbuhan per sumur dan diinkubasikan
pada suhu 37oC selama 24 jam dalam kelembaban air 95% dan atmosfer 5% CO2.
Pengujian secara kolorimetri menggunakan 3-(4-,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT) digunakan untuk menentukan proliferasi
dan viabilitas sel. Ekstrak batang bunga matahari sebanyak 100 µL pada berbagai
konsentrasi (IC50, 1/2 IC50, 1/4 IC50, 1/8 IC50, 1/16 IC50 sel hct116) ditambahkan ke
dalam kultur sel sehari setelah transplantasi. Sel kanker yang tidak diberi
perlakuan digunakan sebagai kontrol negatif. Setelah 48 jam ditambahkan 10
µL/sumur reagen MTT konsentrasi 5 mg/ml per sumur. Setelah 4 jam inkubasi,
ditambahkan 100 µL larutan 0.01 N HCl dalam isopropanol ke dalam tiap sumur.
Pengukuran densitas optik dilakukan menggunakan microplate reader pada
panjang gelombang 595 nm. Semua tahapan dilakukan duplo.
Analisis Data
Rancangan percobaan pada penelitian ini adalah rancanan acak lengkap
(RAL) satu faktor dengan tiga kelompok perlakuan dan tiga kali ulangan (Mattjik
2002). Analisis data menggunakan ANOVA dengan model rancang sebagai
berikut:
Yij
= μ + αi + εij
Keterangan:
μ
= Pengaruh rataan umum
αi
= Pengaruh perlakuan ke-i, i = 1,2,3,4,5
εij
= Pengaruh galat perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, j = 1,2,3,4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Kadar Air dan Rendemen Ekstrak Batang Bunga Matahari
Berdasarkan hasil penelitian, kadar air batang bunga matahari sebesar
18.58%. Hasil pengukuran rendemen menunjukkan nilai rendemen yang berbeda
pada ekstrak yang dilarutkan dengan pelarut yang berbeda yang dapat diamati
pada Tabel 1. Rendemen tertinggi terdapat pada ekstrak etanol 70% yang berbeda
nyata dengan ekstrak air dan ekstrak etanol 30%, sedangkan nilai rendemen
ekstrak air dan etanol 30% tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan.
Tabel 1 Rendemen ekstrak batang bunga matahari (%)
Jenis Ekstrak
Ekstrak air
Ekstrak etanol 30%
Ekstrak etanol 70%
Rendemen (%)
7 ± 0.082*
6 ± 0.08*
13 ± 0.06*
*n (ulangan) sebanyak tiga kali
Analisis Fitokimia
Tahapan penelitian selanjutnya adalah analisis fitokimia. Analisis
fitokimia merupakan tahapan identifikasi metabolit sekunder secara kualitatif
ekstrak batang bunga matahari dengan pelarut yang berbeda. Komponen bioaktif
yang diidentifikasi, yaitu: alkaloid, saponin, flavonoid, tanin, terpenoid dan
steroid. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak air, ekstrak etanol 30% dan
ekstrak etanol 70% tidak mengandung terpenoid dan steroid. Selain itu, ekstrak air
mengandung saponin, yang tidak terkandung pada ekstrak etanol 30% dan ekstrak
etanol 70%. Hasil uji fitokimia dapat diamati pada Tabel 2.
Tabel 2 Hasil uji fitokimia
Jenis Uji
Ekstrak
Air
Etanol 30%
Etanol 70%
Alkaloid*
+
+
+
Saponin*
+
-
-
Flavonoid*
+
+
+
Tanin*
+
+
+
Terpenoid*
-
-
-
Steroid*
-
-
-
*n (ulangan) sebanyak tiga kali
Uji Sitotoksisitas dan Antikanker
Uji sitoksisitas perlu dilakukan untuk mengidentifikasi tingkat toksisitas
ekstrak terhadap sel normal. Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel
6
Chang. Pengujian ini berkaitan dengan keamanan penggunaan ekstrak). Selain itu,
tahapan penting dalam penelitian tentang potensi antikanker ekstrak batang bunga
matahari adalah pengujian aktivitas antikanker, yang dilakukan terhadap sel HCT
116. Pengujian sitotoksisitas dan antikanker dilakukan dengan metode MTT assay.
Intensitas warna yang terbentuk digunakan untuk mengidentifikasi tingkat
proliferasi sel Chang dan sel HCT116. Pengamatan morfologi sel Chang dan sel
HCT116 merupakan tahapan penting untuk mengidentifikasi kondisi sel yang
diberi perlakuan ekstrak. Pengamatan dilakukan terhadap kelompok perlakuan dan
kelompok kontrol. Hasil pengamatan terhadap morfologi sel Chang dapat dilihat
pada Gambar 1, sedangkan hasil pengamatan terhadap morfologi sel HCT 116
dapat dilihat pada Gambar 2. Perbedaan morfologi sel dapat diamati dari jumlah
dan tingkat kerusakan sel. Tingkat kerusakan sel yang dialami oleh sel HCT 116
yang semakin besar pada kelompok perlakuan menunjukkan daya inhibisi
proliferasi ekstrak.
(a)
(b)
Gambar 1 Efek ekstrak terhadap sel Chang: (a) Morfologi sel Chang yang
ditambahkan ekstrak (b) Morfologi sel Chang tanpa ekstrak
(perbesaran 40 kali)
(a)
(b)
Gambar 2 Efek ekstrak terhadap sel HCT 116: (a) Morfologi sel HCT 116 tanpa
ekstrak (b) Morfologi sel HCT 116 yang ditambahkan ekstrak
(perbesaran 40 kali)
7
Inhibisi (%)
Hasil pengujian terhadap ekstrak air ditampilkan pada Gambar 3 dan
Gambar 4. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak air batang bunga matahari terhadap sel
Chang menunjukkan hubungan yang fluktuatif antara konsentrasi ekstrak dan
persen inhibisi sel Chang yang dapat diamati pada Gambar 3. Selain itu, uji
sitotoksisitas menunjukkan bahwa ekstrak air menghambat sebanyak 50% sel
Chang dengan konsentrasi yang lebih besar dari 1000 ppm. Selanjutnya,
pengujian ekstrak air batang bunga matahari terhadap sel HCT 116 (seperti yang
dapat diamati pada Gambar 4) menunjukkan bahwa persen inhibisi sel HCT 116
berkorelasi positif dengan meningkatkan konsentrasi ekstrak air. Selain itu,
kemampuan inhibisi sel HCT 116 sebanyak 50% oleh ekstrak air batang bunga
matari berlangsung pada konsentrasi sekitar 200 ppm. Hasil uji statistik
menunjukkan bahwa ekstrak air mempunyai galat yang lebih besar dari nilai α
(p