Sitotoksisitas Ekstrak dan Senyawa Flavonoid Daun Sukun (Artocarpus altilis) Terhadap Sel T47D Melalui Induksi Apoptosis

SITOTOKSISITAS EKSTRAK DAN SENYAWA FLAVONOID
DAUN SUKUN (Artocarpus altilis) TERHADAP SEL T47D
MELALUI INDUKSI APOPTOSIS

EUIS NURHAYATI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

ii

ABSTRAK
EUIS NURHAYATI. Sitotoksisitas Ekstrak dan Senyawa Flavonoid Daun Sukun
(Artocarpus altilis) Terhadap Sel T47D Melalui Induksi Apoptosis. Dibimbing
oleh LAKSMI AMBARSARI dan TJANDRAWATI MOZEF
Tanaman sukun (Artocarpus altilis) merupakan salah satu tanaman herbal
yang telah dilaporkan aktivitas biologisnya, meliputi sifat sitotoksik, antioksidan,
antiinflamasi, antimikrob, dan sebagai inhibitor tirosinase. Senyawa aktif yang
dimiliki daun sukun diduga dapat menghambat proliferasi sel kanker, termasuk sel
kanker payudara T47D. Penelitian ini bertujuan menentukan efek sitotoksik
ekstrak dan senyawa flavonoid daun sukun menggunakan uji microculture
tetrazolium technique (MTT) dengan parameter konsentrasi penghambatan 50%
proliferasi sel (IC50) dan menentukan efektivitas sampel dalam memacu apoptosis
sel T47D menggunakan analisis flow cytometry. Tahapan penelitian terdiri atas
kultur sel, perlakuan sampel, pengamatan morfologi sel, uji sitotoksik dengan
metode MTT, analisis induksi apoptosis, dan analisis data. Hasil penelitian dari
keempat ekstrak (etanol, heksana, etil asetat, butanol) dan senyawa turunan
flavonoid (AC-5-1, AC-3-1, siklokomunol) yang diujikan menunjukkan bahwa
sampel yang memiliki efek sitotoksik terhadap sel T47D adalah ekstrak heksana
(IC50= 61.02 µg/mL), ekstrak etil asetat (IC50= 264.67 µg/mL), senyawa AC-5-1
(IC50= 260.44 µM), senyawa AC-3-1 (IC50= 110.33 µM), dan senyawa
siklokomunol (IC50= 266.83 µM). Sampel yang memiliki efek sitotoksik paling
baik melalui mekanisme induksi apoptosis ditunjukkan oleh ekstrak etil asetat
(60.54%) dan senyawa AC-5-1 (25.47%), hasil isolasi dari ekstrak etil asetat.
Kata kunci: flavonoid, Artocarpus altilis, sel T47D, sitotoksik, apoptosis, analisis
flow cytometry.

iii

ABSTRACT
EUIS NURHAYATI. Cytotoxicity of Extracts and Flavonoid Compounds Leaves
of Breadfruit (Artocarpus altilis) to The T47D Cells Through Induction of
Apoptosis. Under the direction of LAKSMI AMBARSARI and TJANDRAWATI
MOZEF.
Breadfruit plants (Artocarpus altilis) is one of the herbal plants that has
been reported its biological activities, such as cytotoxic, antioxidant, anti
inflammatory, antimicrobial, and tirosinase enzyme inhibitors. Active compounds
from the leaves of breadfruit were investigated to inhibit the proliferation cancer
cells, including T47D breast cancer cell. This study aimed to establish cytotoxic
effect of extract and flavonoid compounds from the leaves of breadfruit using the
microculture tetrazolium technique (MTT)-assay and determine inhibit
concentration 50% proliferation cell (IC50), and to examine the effectiveness of
sample to stimulate T47D cells apoptosis by analysis flow cytometry. The methods
consisted of T47D cell culture, treatment of samples in cell culture, observation of
cell morphology, cytotoxic with MTT-assay, analysis induction of apoptosis, and
data analysis. The results from four extract (ethanol, ethyl acetate, hexane,
butanol) and flavonoid derivatives compounds (AC-5-1, AC-3-1, cyclocomunol)
have been cytotoxic activity shown by the hexane extract (IC50= 61.02 µg/mL),
ethyl acetate extract (IC50= 264.67 µg/mL), AC-5-1 compund (IC50= 260.44 µM),
AC-3-1 compound (IC50= 110.33 µM), and cyclocomunol compound (IC50=
266.83 µM). The best samples have cytotoxic activity through mechanism
induction of apoptosis were shown by ethyl acetate extract (60.54%) and AC-5-1
compound (25.47%), results isolation from ethyl acetate extract.
Keywords: flavonoid, Artocarpus altilis, T47D cell, cytotoxic, apoptosis, analysis
flow cytometry.

iv

SITOTOKSISITAS EKSTRAK DAN SENYAWA FLAVONOID
DAUN SUKUN (Artocarpus altilis) TERHADAP SEL T47D
MELALUI INDUKSI APOPTOSIS

EUIS NURHAYATI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

v

Judul Skripsi : Sitotoksisitas Ekstrak dan Senyawa Flavonoid Daun Sukun
(Artocarpus altilis) Terhadap Sel T47D Melalui Induksi
Apoptosis
Nama
: Euis Nurhayati
NRP
: G84070076

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Laksmi Ambarsari, M.S
Ketua

Tjandrawati, M.Es.Sc.DU
Anggota

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus:

vi

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya tulis yang berjudul
“Sitotoksisitas Ekstrak dan Senyawa Flavonoid Daun Sukun (Artocarpus altilis)
Terhadap Sel T47D Melalui Induksi Apoptosis”. Karya tulis ini merupakan hasil
kerjasama penulis dengan LIPI-Bandung yang dilaksanakan dalam kurun waktu
bulan Oktober sampai November 2011 di Laboratorium Bioassay Pusat Penelitian
Kimia, LIPI-Bandung.
Karya tulis ini terwujud atas doa, bantuan, dukungan, bimbingan dan saran
dari berbagai pihak baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh sebab itu,
penulis menyampaikan terima kasih kepada Dr. Laksmi Ambarsari, M.S selaku
pembimbing skripsi dari Departemen Biokimia, Tjandrawati Mozef M.Es.Sc.DU
selaku pembimbing penelitian yang telah membimbing penulis selama lima bulan.
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada peneliti di Laboratorium
Bioassay Pusat Penelitian Kimia, LIPI-Bandung, Chandra Risdian, S.Si, Sri
Handayani, S.Si dan Ratih Asmara Ningrum, M.Si dari Pascasarjana Farmasi ITB
atas pinjaman inkubatornya. Penulis tidak lupa mengucapkan terima kasih kepada
kedua orang tua dan keluarga yang tak pernah lelah mendukung, menasehati,
memberikan semangat dan motivasi, serta mendoakan penulis sehingga dapat
menyelesaikan karya tulis ini dengan baik. Penulis juga mengucapkan terima
kasih kepada para sahabat; Endah, Yoshita, Sitha, dan Ayu atas dukungannya,
teman satu laboratorium di LIPI Bandung; Milannissa dan Nyi Mas R Anica G
(Icha), teman kostan Zulfa, serta semua pihak yang mendukung penyusunan karya
tulis ini.
Penulis menyadari bahwa karya tulis ini belum sempurna. Oleh karena itu,
penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari berbagai
pihak terhadap karya tulis ini. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat
bermanfaat bagi berbagai pihak.

Bogor, Maret 2012

Euis Nurhayati

vii

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bandung, Jawa Barat, 12 Maret 1989 dari pasangan
Enan Ruchimat dan Iim Saripah. Bungsu dari dua bersaudara ini menempuh
pendidikan formal di SD Negeri ASMI 7 Bandung (1994-2000), SLTP Pasundan
1 Bandung (2000-2003), SMAN 22 Bandung (2003-2006). Penulis mengikuti
program Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada tahun 2007 untuk
melanjutkan pendidikan di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Organisasi mahasiswa yang pernah diikuti oleh penulis yaitu Himpunan
Profesi Departemen Biokimia, Community Research and Education of
Biochemistry Student (CREBs) pada tahun 2008-2009 sebagai staf divisi PSDM.
Penulis juga aktif dalam organisasi mahasiswa daerah, Paguyuban Mahasiswa
Bandung (Pamaung) pada tahun 2007-2010. Selain aktif berorganisasi, penulis
juga tergabung pada beberapa kepanitian di Institut Pertanian Bogor, di antaranya
masa pengenalan departemen Biokimia (2009), Seminar Keselamatan dan
Kesehatan Kerja (2009), Seminar Kanker (2009), IPB Art Contest 2009.
Ketertarikan penulis terhadap karya tulis mengantarkan penulis untuk
menorehkan prestasi selama menempuh pendidikan di Institut Pertanian Bogor.
Prestasi yang diperoleh penulis, yaitu Peraih Hibah Dikti Program Kreativitas
Mahasiswa Bidang Gagasan Tertulis 2010 dengan judul “Bioetanol Nipah (Nypa
fruticans) Sebagai Bahan Bakar Murah Masa Depan”. Penulis pernah
mendapatkan pengalaman bekerja di laboratorium Pusat Riset Obat dan Makanan
(PROM) BPOM RI di Jakarta dalam memenuhi mata kuliah praktek lapang
selama dua bulan dan membuat laporan yang berjudul “Deteksi Mikroba Patogen
Salmonella enterica serotype Typhimurium dengan Metode Real-Time PCR”.

viii

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .................................................................................................. ix
DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix
DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix
PENDAHULUAN .................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 2
Flavonoid ......................................................................................................... 2
Sukun (Artocarpus altilis)................................................................................ 2
Kanker Payudara .............................................................................................. 3
Apoptosis ......................................................................................................... 4
Kultur Sel ......................................................................................................... 4
Sitotoksik ......................................................................................................... 5
Analisis Flow cytometry .................................................................................. 6
BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 7
Alat dan Bahan ................................................................................................. 7
Metode ............................................................................................................. 7
HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 8
Uji Sitotoksik ................................................................................................... 8
Morfologi Sel Setelah Perlakuan ................................................................... 11
Analisis Induksi Apoptosis ............................................................................ 13
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 15
Simpulan ........................................................................................................ 15
Saran .............................................................................................................. 15
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 15
LAMPIRAN .......................................................................................................... 18

ix

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Hasil uji sitotoksik ekstrak daun sukun .............................................................. 9
2 Hasil uji sitotoksik senyawa daun sukun ......................................................... 10
3 Distribusi sel T47D pada fase siklus sel .......................................................... 14

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1

Struktur flavonooid .......................................................................................... 2

2

Tanaman Sukun (Artocarpus altilis) ................................................................. 2

3

Struktur senyawa flavonooid daun sukun ......................................................... 3

4

Sel T47D ........................................................................................................... 4

5

Mekanisme apoptosis ........................................................................................ 5

6

Perubahan MTT menjadi formazan ................................................................. 5

7

Proses kerja flow cytometry ............................................................................... 6

8

Analisis populasi sel dengan flow cytometry ................................................... 7

9

Hasil uji sel sitotoksik dengan metode MTT .................................................... 9

10 Morfologi sel perlakuan normal dan kontrol positif ...................................... 11
11 Morfologi sel dengan perlakuan ekstrak ........................................................ 12
12 Morfologi sel dengan perlakuan senyawa ....................................................... 12
13 Analisis siklus sel T47D dengan flow cytometry ............................................ 13
14 Diagram rata-rata persentase induksi apoptosis .............................................. 15

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ........................................................................................... 19
2 Ekstraksi dan ekstraknasi flavonoid daun sukun ............................................. 20
3 Ekstraksi senyawa AC-3-1 ............................................................................... 21
4 Ekstraksi senyawa siklokomunol ..................................................................... 22
5 Foto uji MTT ................................................................................................... 23
6 Data hasil uji aktivitas antikanker .................................................................... 24
7 Persentase populasi sel yang terinduksi apoptosis ........................................... 29

1

PENDAHULUAN
Memasuki dasawarsa terakhir ini, masalah
kesehatan menjadi hal utama yang harus
diperhatikan masyarakat luas. Menurut World
Health Organization (WHO), lebih dari satu
juta kasus kanker terjadi setiap tahunnya dan
lebih dari setengahnya terdapat di negaranegara berkembang (Heti 2008). Di Indonesia,
kasus kanker payudara merupakan kasus
kanker tertinggi kedua yang menyerang
wanita, yaitu sebanyak 18% setelah kanker
rahim 29% (Kumala et al. 2010). Data Sistem
Informasi Rumah Sakit (SIRS) menyebutkan
bahwa dalam tiga tahun terakhir kasus kanker
payudara sebanyak 8 227 kasus atau sebanyak
17% (Tribun Jabar 2010).
Kanker terbentuk alami dari suatu sel yang
mengalami mutasi DNA. Kerusakan genetik
pada DNA akibat radiasi, radikal bebas, atau
gen penekan tumor akan mengubah kecepatan
proliferasi dan penghambatan apoptosis
(programmed cell death) (Silalahi 2006 &
Sukardiman et al. 2006). Kanker payudara,
khususnya sel T47D merupakan hasil
diferensiasi lanjut dari sel T-47 yang diisolasi
dari payudara seorang wanita penderita kanker
payudara. Pada sel T47D terdapat mutasi gen
p53 yang terjadi pada residu 194, sehingga
tidak dapat berikatan dengan sekuen pada
DNA dan mengakibatkan gen tersebut tidak
mampu untuk
menginduksi
apoptosis
(Zampieri et al. 2002). Mekanisme kerja
apoptosis melibatkan serangkaian transduksi
sinyal biokimiawi yang dapat menyebabkan
perubahan ciri morfologis, seperti pengerutan
sel, adanya fragmentasi DNA, kerusakan
membran dan terbentuknya badan apoptosis
yang nantinya akan difagositosis oleh sel
makrofag (Gewies 2003).
Penggunaan obat kemoterapi sel kanker,
yaitu doxorubicin belum memberikan hasil
optimal, karena obat tersebut bekerja tidak
hanya menyerang sel kanker, tetapi dapat
menyerang sel atau jaringan lain seperti
terjadinya kerontokan pada rambut (Kumala et
al. 2010). Oleh karena itu, kecendrungan
masyarakat untuk kembali ke alam (back to
nature) semakin tinggi dengan lebih memilih
menggunakan obat-obatan tradisional dari
tanaman.
Target
pengembangan
obat
antikanker salah satunya diarahkan pada
induksi/pemacuan apoptosis (Fisher 1994).
Kandungan aktif dari beberapa tanaman
telah banyak dipelajari untuk mengetahui
potensi dalam mencegah aktivitas kanker.
Salah satu kandungan aktif yang dimiliki oleh
suatu tanaman adalah senyawa metabolit

sekunder seperti flavonoid (Heldt 2005).
Flavonoid telah diketahui memiliki aktivitas
biologis sebagai antiinflamasi, antioksidan,
antivirus, hepatoprotektor, antikanker, dan
lain sebagainya (Middelton et al. 2009).
Uji
farmakologis
isolat
flavonoid
menunjukkan bahwa daun pepaya memiliki
aktivitas penghambatan pertumbuhan kanker
dengan IC50 104 µg/mL, serta mampu
menginduksi apoptosis terhadap sel mieloma
secara in vitro (Sukardiman 2006). Penelitian
Da‟i (2007) untuk menghambat pertumbuhan
sel T47D melalui jalur pemacuan apoptosis
dilakukan terhadap
analog kurkumin.
Kemampuan tanaman sebagai obat herbal
masih banyak lagi dan perlu dilakukan
penelitiannya lebih lanjut.
Sukun (Artocarpus altilis) adalah salah
satu tanaman „nangka-nangkaan‟ yang dikenal
baik di Indonesia. Keseluruhan bagian
tanaman sukun telah banyak dimanfaatkan
oleh masyarakat. Bagian kayu sukun biasanya
digunakan sebagai bahan bangunan, buahnya
bermanfaat dalam menyembuhkan sakit gigi,
dan bagian getahnya dapat dibuat menjadi
pakan burung. Selain kayu dan bagian lain
tanaman sukun, daunnya diketahui dapat
mengobati penyakit kulit (Heyne 1987).
Sebagian besar metabolit sekunder yang
berhasil diisolasi dari tanaman sukun telah
ditentukan aktivitas biologisnya, antara lain
memiliki sifat sitotoksik, antioksidan,
antikanker, antiinflamasi, dan sebagai
inhibitor tirosinase (Syah 2005). Antioksidan
dan antikanker dalam senyawa flavonoid
dapat membantu menginduksi apoptosis
sehingga sel yang tidak terkontrol akibat
kerusakan
genetik
dapat
ditekan
pertumbuhannya (Silalahi 2006). Lotulung et
al. (2008) menjelaskan bahwa senyawa
flavonoid daun sukun memiliki efek sitotoksik
terhadap sel kanker leukimia (P388) dengan
IC50 7 µg/mL. Penelitian daun sukun sebagai
sitotoksik terhadap sel kanker payudara
(T47D) masih sedikit, sehingga perlu adanya
serangkaian
uji
untuk
menentukan
sitotoksisitas daun sukun.
Tujuan dari penelitian ini, yaitu untuk
menentukan sitotoksisitas ekstrak dan
senyawa flavonoid daun sukun terhadap sel
T47D yang ditentukan dengan nilai IC50
menggunakan uji microculture tetrazolium
technique (MTT). Selain itu juga untuk
menentukan potensi daun sukun dalam
memacu apoptosis sel T47D menggunakan
analisis flow cytometry. Hipotesis penelitian
ini, yaitu sukun (Artocarpus altilis)
mengandung senyawa-senyawa flavonoid

2

yang memiliki bioaktivitas sebagai sitotoksik
dan
penghambatannya
diduga
dapat
menginduksi
apoptosis.
Manfaat
penelitiannya, yaitu daun sukun dapat
digunakan sebagai obat kanker payudara
secara alami.
TINJAUAN PUSTAKA
Flavonoid
Tanaman yang berpotensi sebagai obat
herbal mengandung senyawa kimia hasil dari
metabolisme tanaman itu sendiri. Senyawa
kimia hasil metabolisme primer seperti
karbohidrat, protein, dan lemak digunakan
sendiri oleh tanaman tersebut untuk
pertumbuhannya.
Senyawa
metabolit
sekunder seperti terpenoid, steroid, kumarin,
flavonoid, dan alkaloid merupakan produk
alami tanaman yang berfungsi sebagai
pelindung dari gangguan hama penyakit
(Heldt 2005).
Kerangka dasar flavonoid terdiri atas 15
atom karbon. Kerangka tersebut membentuk
dua cincin benzena (C6) yang mengikat pada
suatu rantai propana (C3) sehingga
membentuk suatu susunan C6-C3-C6. Susunan
tersebut membentuk senyawa polifenol.
Gugus hidroksil (OH) pada senyawa fenol
diketahui dapat meningkatkan sitotoksisitas
suatu senyawa (Syah 2005) (Gambar 1).
Flavonoid memiliki tiga jenis struktur yang
berbeda, yaitu flavonoid, isoflavonoid, dan
neoflavonoid. Lebih dari 4000 struktur unik
flavonoid telah teridentifikasi dari berbagai
jenis tanaman (Middelton et al. 2009).
Banyaknya jenis flavonoid disebabkan oleh
berbagai tingkat hidroksilasi, alkoksilasi, atau
glikosilasi dari struktur tersebut. Masingmasing senyawa flavonoid mempunyai
struktur dasar tertentu. Senyawa flavonoid
diklasifikasikan
berdasarkan
kerangka
karbonnya seperti khalkon, flavanon, flavon,
flavan-3-ol, dan 3-prenilflavon (Hakim 2007).
Sintesis flavonoid pada suatu tanaman berasal
dari asam amino fenilalanin dan tirosin yang
merupakan hasil dari jalur sikimat. Asam
amino tersebut akan mengubah struktur
cincinnya menjadi fenol dan masuk dalam
jalur malonat. Tahap awal jalur malonat
menggunakan p-komaril-KoA dan 3 molekul
malonil KoA membuat sintesis khalkon yang
dibutuhkan dalam jalur ini menjadi bersifat
yang
tidak
dapat
dirubah
sehingga
menghasilkan flavonoid (Heldt 2005).
Flavonoid yang merupakan senyawa
fenolik alam memiliki sifat antioksidan dan
berpotensi dalam menghambat pertumbuhan

sel kanker melalui mekanisme penghambatan
siklus sel, pemacuan apoptosis, penghambatan
angiogenesis, antiproliferatif atau kombinasi
dari beberapa mekanisme tersebut. Jenis
flavonoid, misalnya genestein dan kuersetin,
mampu menghambat aktivitas protein kinase
pada daerah pengikatan ATP. Peran dari
protein kinase sendiri, yaitu sebagai sinyal
pertumbuhan pada sel-sel kanker dan pada
jalur antiapoptosis (Meiyanto et al. 2007).

Gambar 1 Struktur flavonoid (Middelton et
al. 2009).
Sukun (Artocarpus altilis)
Sukun merupakan tanaman Plantae yang
termasuk ke dalam divisi Spermatophyta dan
subdivisi Angiospermae. Keluarga tanaman
Moraceae ini termasuk ke dalam kelas
Dicotyledonae dengan ordo Urticales, genus
Artocarpus, dan spesies Artocarpus altilis.
Sukun atau breadfruit dikenal sebagai sumber
makanan yang banyak terdapat di kawasan
tropis termasuk Indonesia dan Malaysia. Di
pulau Jawa tanaman ini dijadikan tanaman
budidaya oleh masyarakat (Heyne 1987).
Buah sukun berbentuk bulat atau bulat
panjang dengan diameter mencapai 25.4 cm
dan beratnya kurang lebih 4.54 kg dengan
ketinggian pohon 20 m. Pada Gambar 2
terlihat sebagian warna daun hijau dan coklat,
serta kulit buah berwarna hijau yang
menunjukkan tanaman sukun siap untuk
panen (Koswara 2006). Buah sukun terbentuk
dari
keseluruhan
kelopak
bunganya.
Perbungaan terjadi dalam ketiak daun, dekat
ujung ranting. Sukun tumbuh baik di daerah
basah, tetapi juga dapat tumbuh di tempat
yang sangat kering. Di musim kering,
disaat tanaman lain tidak memproduksi atau

Gambar 2 Sukun (Artocarpus altilis).

3

merosot produksinya, justru sukun dapat
tumbuh dan berbuah dengan lebat. Pohon
sukun mulai berbuah setelah berumur lima
sampai tujuh tahun dan akan terus berbunga
hingga umur 50 tahun, sehingga membuktikan
bahwa tanaman sukun produktivitasnya cukup
tinggi (Koswara 2006).
Hasil analisis menunjukkan sukun
memiliki nilai gizi, antara lain kandungan
fosfor, kalsium, vitamin C, vitamin B1
(Mustafa 1998). Pada bagian daun sukun
ditemukan senyawa turunan flavonoid jenis
piranoflavon,
yaitu
siklokomunin,
siklokomunol dan sikloartokarpin (Hakim
2007). Selain itu, senyawa turunan geranil
flavonoid jenis dihidrokhalkon yang telah
berhasil diisolasi, yaitu AC-3-1 (1-[2,4dihidroksifenil]- 3-[8- hidroksi-2-metil-2-(4metil- 3-pentenil -2H-1- benzopiran-5-il]-1propanon),
AC-5-1
(2-geranil-2‟,4‟,3,4
tetrahidroksidihidrokhalkon), 2-geranil-3,4,7trihidroksiflavanon, dan sikloaltilisin (Wang
et al. 2007). Syah (2005) melaporkan bahwa
senyawa AC-5-1, AC-3-1, dan siklokomunol
memiliki efek biologis yang potensial sebagai
sitotoksik. Pada Gambar 3 terdapat gugus
hidroksil yang terikat pada struktur senyawa
AC-5-1, AC-3-1, dan siklokomunol. Gugus
hidroksil tersebut diketahui dapat membantu
dalam mekanisme penghambatan sel kanker
sebagai antioksidan (Middelton et al. 2009).
Daun tanaman sukun mengandung
beberapa zat berkhasiat seperti asam
hidrosianat, asetilkolin, tanin, riboflavin,
fenol, flavonoid, dan saponin (Mulyati 2009).
Beberapa senyawa turunan dihidrokhalkon
dan piranoflavon A. altilis tersebut hampir
memiliki kesamaan dengan A. communis,
tetapi sebagian senyawa A. communis diisolasi
berasal dari bagian bunga tanaman sukun,
bukan dari bagian daunnya (Syah 2005).
Pada masyarakat Indonesia umumnya,
sukun biasa juga digunakan sebagai obat
tradisional yang dapat mengobati berbagai
penyakit seperti sirosis hati, hipertensi, dan
diabetes melitus (Mustafa 1998). Secara

tradisional air rebusan daun sukun dilaporkan
dapat mengobati penyakit kulit, menurunkan
tekanan darah, menyembuhkan penyakit
asma, hepar, juga ginjal (Syah et al. 2006).
Kanker Payudara
Secara umum kanker didefinisikan sebagai
suatu
kondisi
sel
telah
kehilangan
pengendalian dan mekanisme normalnya,
sehingga mengalami pertumbuhan yang tidak
normal, cepat, tidak terkendali dan berusaha
menghindari kematiannya (apoptosis). Sel
kanker tidak peduli dengan keterbatasan zat
makanan, ruang dan fakta jika harus berbagi
dengan sel-sel normal yang ada disekitarnya.
Lebih jauh dari itu, sel kanker mengabaikan
perintah untuk berhenti berkembangbiak oleh
tubuh yang bersangkutan. Sel-sel kanker
dibentuk dari sel-sel normal dalam suatu
proses rumit yang disebut transformasi.
Tahapan
transformasi,
yaitu
inisiasi
(terjadinya mutagenesis), promosi (kerusakan
gen), dan perkembangan (Diananda 2008).
Kanker terjadi karena kerusakan struktur
genetik yang menyebabkan pertumbuhan sel
tidak terkontrol. Kerusakan
gen dapat
disebabkan karena radiasi, radikal bebas, atau
gen penekan tumor (Silalahi 2006). Tahapan
terjadinya kanker, yaitu: (1) induksi: adanya
perubahan pertumbuhan sel (displasia), (2)
kanker in situ: pertumbuhan kanker terbatas
pada jaringan tempat asalnya tumbuh, (3)
kanker invasif: sel kanker telah menembus
membran basal dan masuk ke jaringan atau
organ sekitar yang berdekatan, (4) metastasis:
penyebaran kanker ke jaringan atau organ lain
(Diananda 2008).
Kanker payudara merupakan salah satu
penyebab kanker tertinggi bagi wanita di
dunia. Penyebab kanker payudara dapat
diakibatkan karena interaksi rumit dari banyak
faktor genetik, hormonal, dan lingkungan.
Jenis sel kanker payudara, diantaranya adalah
sel T47D, sel MCF-7, sel MDA-MB-231, sel
MB-MDA-468, sel BT-20, dan sel BT-549

(1)
(2)
(3)
Gambar 3 Struktur senyawa flavonoid tergeranilasi atau terprenilasi: (1) AC-5-1 ; (2) AC-3-1 ; (3)
Siklokomunol (Syah 2005).

4

Gambar 4 Sel T47D dengan perbesaran 10x.

dapat menyebabkan kanker (Darzynkiewicz et
al. 1992).
Apoptosis
melibatkan
serangkaian
kejadian biokimiawi melalui transduksi sinyal
yang menyebabkan perubahan morfologis
bahkan kematian sel. Mekanisme apoptosis
yang dapat merubah morfologis sel tersebut,
yaitu penyusutan sel, kondensasi kromatin
fragmentasi DNA, kerusakan membran inti
dan sel pecah menjadi beberapa vesikel yang
disebut badan apoptosis (Gambar 5). Badan
apoptosis tersebut akan dikenali oleh sel
makrofag
dan
dimakan
(fagositosis).
Perubahan yang terjadi dalam sel apoptosis
memediasi pembelahan DNA menjadi
fragmen-fragmen (Gewies 2003). Perubahan
biokimia pada proses apoptosis melibatkan
dua kelompok transduksi sinyal, yaitu internal
dan eksternal. Transduksi sinyal internal
diantaranya adalah gen penekan tumor, gen
bcl-2, dan „killer caspases’. Transduksi sinyal
eksternal, salah satunya reseptor faktor
nekrosis pada tumor (Doseff 2004).
Gen penekan tumor (gen p53) adalah
faktor transkripsi yang mengaktivasi sejumlah
besar ekspresi gen yang terlibat dalam
regulasi siklus sel dan apoptosis. Gen p53
adalah gen penekan tumor pertama yang
diidentifikasi dalam sel kanker. Jejaring kerja
gen p53 secara normal berada dalam keadaan
tidak aktif. Keadaan ini akan menjadi aktif
jika sel mengalami stress atau terluka.
Kehilangan fungsi gen p53 karena mutasi
dapat
mempengaruhi
mekanisme
pembentukan apoptosis yang melibatkan gen
bcl-2 dan caspase (Syaifudin 2007).
Mekanisme gen p53 dalam menginduksi
apoptosis, yaitu gen bekerja merangsang
mitokondria dengan adanya induksi dari gen
Bax untuk mengeluarkan sitokrom c ke sitosol
membentuk caspase cascade (Gewies 2003).

Apoptosis
Apoptosis
merupakan
mekanisme
kematian sel secara alami dan terprogram.
Berbeda dengan nekrosis, yaitu kematian sel
yang merupakan penghancuran sel secara
total. Apoptosis terjadi ketika sel mengalami
kerusakan yang tidak dapat diperbaiki lagi,
misalnya terjadi kerusakan DNA akibat
radiasi ionisasi atau bahan kimia beracun, atau
bisa juga disebabkan aktivitas gen penekan
tumor dan radikal bebas. Oleh karena itu,
apoptosis bekerja untuk melenyapkan sel-sel
yang mengalami kerusakan tersebut. Selain
itu, apoptosis memiliki peranan penting untuk
menjaga keseimbangan perkembangbiakan sel
dan untuk membatasi proliferasi sel yang

Kultur Sel
Kultur
sel
merupakan
metode
pertumbuhan sel yang dikembangkan secara
in vitro dengan lingkungan yang disesuaikan
(nutrisi, pH, oksigen, osmolalitas, konsentrasi
CO2, dan suhu) seperti dalam kondisi in vivo.
Kultur sel banyak digunakan dalam berbagai
aplikasi ilmiah, seperti genetika, biologi
molekul, dan teknik kultur jaringan (Freshney
2005).
Sel yang digunakan dalam kultur berasal
dari jaringan asli yang ditransformasi dalam
laboratorium. Sel asli yang diambil dari
jaringan atau organ merupakan sel primer. Sel
primer memiliki waktu hidup yang terbatas
dan
mungkin
menunjukkan
beberapa

(Yang et al. 2010). Sel T47D merupakan
continous cell lines yang diambil dari jaringan
payudara seorang wanita berumur 54 tahun
yang terkena ductal carcinoma yang diisolasi
pada tahun 1970 (Kristyowati 2009). Sel
T47D mengekspresikan gen p53 yang
termutasi sehingga gen p53 tidak dapat
berikatan dengan DNA sekuen. Hal ini
mengakibatkan hilangnya kemampuan gen
p53 untuk regulasi siklus sel. Mutasi gen p53
ini pun mengakibatkan tidak dapat meregulasi
protein proapoptosis yang diatur oleh p53
seperti Bax dan Puma (Gewies 2003).
Pada Gambar 4 menunjukkan sel T47D
yang sedang mengalami pertumbuhan dan
perkembangannya setelah inkubasi 18 jam.
Morfologi sel yang terlihat pada gambar
seperti sel epitel dan memiliki sifat yang
bergerombol yang menandakan sel akan
bersifat kanker (Diananda 2008). Sel T47D
sering digunakan dalam penelitian kanker
secara in vitro karena mudah penanganannya,
memiliki kemampuan replikasi yang tidak
terbatas atau cepat dalam pertumbuhannya.
Selain itu memiliki homogenitas yang tinggi
dan mudah diganti dengan sel baru yang
telah dibekukan jika terjadi kontaminasi.
Metode in vitro ini merupakan alternatif
pengganti metode hewan uji. (Zampieri et al.
2002).

5

Gambar 5 Mekanisme apoptosis (Gewies 2003).
karakteristik seperti penurunan protein dan
sintesis DNA. Sel yang ditransformasi
terkadang memiliki waktu hidup yang tak
terbatas disebut dengan immortal cell atau
countinous cell. Waktu hidup sel yang tidak
terbatas membuat sel akan terus-menerus
membelah, serta proses tersebut membuat sel
secara kontinyu dapat dikultur (Freshney
2005).
Sel T47D ditumbuhkan dalam media
kultur sel, yaitu Dulbecco‟s Modified Eagle‟s
Medium (DMEM) Gibco 12800-017, 10%
Fetal Bovine Serum (FBS), dan Penicillin
Streptomicin Fungizon Genthamicin (PSFG).
Fungsi media dalam pertumbuhan sel adalah
untuk menyediakan nutrisi dan energi yang
dibutuhkan
dalam
pertumbuhan
dan
proliferasi sel. Kandungan dalam media
pertumbuhan sel terdiri atas dua bagian, yaitu
media dasar dan suplemen (Freshney 2005).
Media dasar dalam kultur sel T47D adalah
DMEM yang kandungannya terdiri atas
glukosa yang tinggi, larutan garam, asam
amino esensial, vitamin, dan merah fenol
(phenol red). Media ini tidak mengandung
gen
pembunuh
dan
membutuhkan
suplementasi untuk menjadi media yang
lengkap. Larutan FBS memiliki albumin
dalam kandungannya yang berfungsi sebagai
protein pembawa untuk molekul-molekul
kecil, transferin untuk pengikat besi, serta
terdapat antiprotease untuk menghambat
enzim protease dalam menghancurkan sel.
Larutan PSFG bertindak sebagai antibiotik
dan antimikotik yang melindungi sel dari
kontaminasi bakteri dan jamur (Freshney
2005).
Kultur sel ditumbuhkan dalam inkubator
pada suhu 37°C, 5% CO2, dan 95%
kelembaban. Kondisi inkubator yang tepat
sangat dibutuhkan oleh sel agar dapat tumbuh
dengan baik. Suhu diatur sesuai kondisi suhu
fisiologis sel, kelembaban dijaga 95% dengan
tujuan untuk mencegah kelebihan evaporasi
media, serta 5% CO2 berfungsi sebagai buffer
bikarbonat, jika kepadatan sel rendah, maka
CO2 mengkompensasi kekurangannya. Kultur
sel T47D akan tumbuh membentuk satu
lapisan pada dasar flask (wadah kultur sel).

Jika kultur sel telah mencapai 95% konfluen
(kepadatan), maka sel disubkultur dengan
proses tripsinisasi. Enzim tripsin yang
digunakan berfungsi untuk melepas ikatan
antar sel dan sel dengan permukaan wadah.
Kerja enzim tripsin dapat dihentikan dengan
menambahkan media yang mengandung FBS,
karena FBS merupakan antiprotease.
Sitotoksik
Uji sitotoksik merupakan perkembangan
untuk mengidentifikasi obat sitotoksik baru
atau
deteksi
obat
dengan
aktivitas
antitumor/antikanker.
Uji
sitotoksik
digunakan untuk menentukan parameter nilai
IC50. Nilai IC50 menunjukkan nilai konsentrasi
yang menghasilkan hambatan proliferasi sel
50% dan menunjukkan potensi ketoksikan
suatu senyawa terhadap sel. Semakin besar
nilai IC50 maka senyawa tersebut semakin
tidak toksik (Arung et al. 2009).
Metode umum yang digunakan untuk uji
sitotoksik dalam pengukuran nilai IC50, yaitu
uji microculture tetrazolium technique
(MTT). Prinsip dari uji MTT, yaitu terjadinya
mekanisme perubahan warna kuning dari
garam tetrazolium yang tereduksi menjadi
kristal formazan dalam mitokondria sel hidup
(Gambar 6). Mitokondria dari sel hidup
berperan penting dalam menghasilkan
dehidrogenase. Bila dehidrogenase tidak aktif
karena efek sitotoksik, maka formazan tidak
akan terbentuk. Konsentrasi formazan dapat
ditentukan
dengan
menggunakan
spektrofotometri. Kristal formazan berwarna

MTT (kuning)

Formazan (ungu)

Gambar 6 Perubahan MTT menjadi formazan
dalam mitokondria sel hidup
(Amalia 2008).

6

ungu yang terbentuk dapat larut dengan
adanya penambahan dimetil sulfoksida
(DMSO). Absorban dibaca pada panjang
gelombang 550 nm pada spektrofotometer
atau microplate reader. Konsentrasi formazan
yang berwarna ungu berbanding lurus dengan
jumlah sel hidup (Amalia 2008).
Analisis Flow cytometry
Flow cytometry merupakan prinsip
berteknologi tinggi yang digunakan untuk
menganalisis karakteristik fisik beberapa
partikel tunggal seperti sel. Karakteristik ini
ditentukan dengan menggunakan sistem
pasangan elektronik-optik. Sifat-sifat yang
diukur diantaranya partikel yang relatif
berukuran, granular, atau kompleksitas
internal, dan memiliki intensitas flouresensi
(Becton 2000).
Sebuah flow cytometer terdiri atas tiga
sistem utama: fluida, optik, dan elektronik.
Sistem fluida membawa sel menuju laser
untuk dianalisis. Sistem optik terdiri atas laser
untuk mengeksitasi sel dalam aliran sampel
dan filter optik untuk mengarahkan sinyal
cahaya yang dihasilkan ke detektor yang
sesuai. Sistem elektronik mengubah sinyal
cahaya yang diterima oleh detektor menjadi
sinyal elektronik oleh komputer.
Partikel atau sel yang akan dianalisis
berukuran 0.2-150 mikrometer. Sel-sel dari
jaringan padat harus dipisahkan sebelum
dianalisis. Ketika partikel dalam suatu fluida
mengalir dan dilewati sinar laser, sel
menyerap energi cahaya dan mengemisikan
energi cahaya pada panjang gelombang
tertentu. Cahaya tersebut diarahkan menuju
detektor melalui serangkaian sistem filter dan
diseleksi menurut flouresensi yang terserap.
Detektor sendiri memiliki sensor yang dapat
mengubah foton cahaya menjadi sinyal
elektronik (Gambar 7) (Becton 2000).
Salah satu analisis flow cytometry adalah
pengukuran populasi sel pada suatu siklus sel.
Siklus sel merupakan alur dari suatu proses
kehidupan yang diawali pada sebuah sel. Sel

Gambar 7

Proses kerja Flow cytometry
(Becton 2000).

memiliki material genetik yang memberikan
perbedaan pada setiap sel lainnya yang
dikenal dengan DNA. Fase siklus sel, yaitu
fase G1, fase S, fase G2, dan fase M. Fase G1
merupakan fase persiapan untuk sintesis
DNA. Fase S adalah fase berlangsungnya
sintesis DNA atau replikasi.
Fase
G2
merupakan
fase
perbaikan DNA atau
reorganisasi struktur DNA. Fase M
merupakan fase mitosis atau fase pembelahan
sel (Rabinovitch 1990).
Pengukuran populasi sel dari siklus sel
dengan populasi sel yang mengalami
apoptosis dapat dilakukan secara beriringan
dalam flow cytometry. Fase siklus sel akan
berproliferasi
secara
kontinuitas
dan
mengalami apoptosis secara normal pada
bagian tertentu. Namun, jika DNA mengalami
penyimpangan, maka fase dari siklus sel,
seperti apoptosis akan terganggu dan
memunginkan terbentuknya penyakit seperti
kanker. Selama apoptosis DNA nukleus
terfragmentasi, sel yang mengalami apoptosis
akan membentuk fragmen-fragmen DNA
yang lebih pendek dari sel normal
(Darzynkiewicz et al. 1992). Pengukuran
populasi sel dari analisis yang dihasilkan flow
cytometry adalah pengukuran perbandingan
kandungan DNA dalam suatu populasi sel
(Becton 2000).
Berbagai zat warna yang digunakan
memiliki afinitas tinggi untuk mengikat DNA.
Lokasi pengikatan warna pada molekul DNA
bervariasi dengan jenis zat warna yang
digunakan. Pewarna yang paling umum
adalah pewarna biru-cerah Propidium Iodida
(PI) atau Ethidium Bromida (EtBr) dan
pewarna UV-cerah Diamidino-Fenilindol
(DAPI), serta Hoechst. Propidium Iodida (PI)
adalah pewarna yang mengikat DNA dan
RNA untai ganda, sedangkan pengikatan
warna DAPI dan Hoechst terjadi pada alur
yang pendek dari heliks DNA dan pada
dasarnya tidak mengikat RNA (Rabinovitch
1990).
Hasil analisis flow cytometry ditunjukkan
dengan histogram. Histogram yang terbentuk
berasal dari pengukuran jumlah populasi sel
pada suatu kandungan DNA yang terdeteksi.
Apoptosis memiliki kandungan DNA yang
lebih sedikit dibandingkan kandungan DNA
pada siklus sel, sehingga sel yang terapoptosis
akan membentuk kurva lebih awal diikuti
dengan kurva pada setiap fase siklus sel
(Gambar 8). Prinsip flow cytomtery sebagai
penentuan kuantitas populasi sel suatu sampel
lebih efektif dan spesifik kandungan DNA
dari siklus sel yang terdeteksi (Becton 2000).

7

Gambar 8 Analisis populasi siklus sel dengan
flow cytometry (Becton 2000).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian,
yaitu mikroskop inverted, inkubator CO2,
laminar air flow cabinet, microwadah reader,
pemanas, tabung conical steril, tissue culture
flask, pH meter, wadah 96-sumur, wadah 24sumur, kamera digital, bunsen, sentrifus, pipet
mikro, eppendorf, tip, tabung ependorf, botol
kaca, dan kantong plastik. Untuk analisis sel
yang diuji menggunakan flow cytometer.
Sampel yang digunakan merupakan stok
hasil ekstraksi bertingkat dari daun sukun
yang dimiliki oleh Pusat Penelitian Kimia,
Lembaga
Penelitian
Indonesia
(LIPI)
Bandung. sampel tersebut meliputi, ekstrak
etanol, ekstrak heksana, ekstrak etil asetat,
ekstrak butanol, senyawa AC-5-1, senyawa
AC-3-1, dan senyawa siklokomunol. Kontrol
positif adalah doxorubicin. Pelarut sampel
adalah DMSO. Bahan untuk kultur sel adalah
sel T47D yang diperoleh dari stok
Laboratorium Kimia LIPI Bandung. Bahan
kimia dan media yang digunakan diantaranya
adalah trypsin-EDTA (Gibco 25200), media
DMEM Gibco 12800-017, media yang
mengandung DMEM, 10% FBS Gibco 10099141, dan PSFG Gibco 15240-062, larutan
dapar Phosphat Buffer Saline (PBS) pH 7.4,
freezing solution, etanol 70%, larutan MTT
(3(4,5dimetiltiazol-2-il)
-2,5difeniltetrazolium
bromida)
(Sigma),
Propidium Iodida (PI) (Sigma P3566),
dimetilsulfoksida (DMSO) yang berperan
dalam melarutkan senyawa polar dan senyawa
nonpolar, dan kertas saring 0.2 µm.
Metode
Metode penelitiannya terdiri atas kultur
sel, perlakuan sampel, pengamatan morfologi
sel, uji sitotoksik, analisis induksi apoptosis,
dan analisis data. (lampiran 1).

Kultur Sel
Sel kanker payudara T47D yang
digunakan merupakan koleksi Pusat Penelitian
Kimia,
LIPI
Bandung.
Kultur
sel
ditumbuhkan dalam media penumbuh
Dulbecco‟s Modified Eagle‟s Medium
(DMEM) yang mengandung 10% FBS,
antibiotik penisilin-streptomisin 1 % dan
gentamisin 0.1%. Sel dipanen dari flask
setelah 90% terjadi kepadatan pertumbuhan,
dengan trypsin-EDTA dan diinkubasi pada
suhu 37oC dengan atmosfer 5% CO2.
Persiapan Sampel
Sampel yang diperoleh berasal dari stok
daun sukun yang diekstraksi bertingkat
menggunakan
pelarut
yang
berbeda
kepolarannya dari nonpolar sampai polar.
Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi daun
sukun adalah etanol, heksana, etil asetat, dan
butanol. Proses ekstraksi dan purifikasi
tersebut menghasilkan fraksi-fraksi sehingga
diperoleh senyawa turunan flavonoid jenis
dihidrokhalkon dan prenilflavon, salah
satunya adalah senyawa AC-5-1, senyawa
AC-3-1, dan senyawa siklokomunol. Isolasi
dan identifikasi senyawa tersebut pada
Lampiran 2, 3, dan 4.
Kemampuan
daun
sukun
dalam
menghambat sel T47D diujikan pada semua
hasil ekstraksi dan senyawa yang telah
diperoleh, dikarenakan belum ditemukannya
nilai IC50 yang berpotensi. Sampel-sampel
yang diperoleh dari stok memiliki konsentrasi
berbeda sehingga perlu diencerkan dengan
DMSO terlebih dahulu sebelum perlakuan.
Konsentrasi stok awal ekstrak etanol, ekstrak
heksana, ekstrak etil asetat, dan ekstrak
butanol daun sukun berturut-turut sama yaitu
100 mg/mL dan senyawa AC-5-1, senyawa
AC-3-1,
serta
senyawa
siklokomunol
mempunyai konsentrasi stok awal 50 mM.
Konsentrasi akhir yang diperlukan untuk uji
sel hidup dalam menentukan nilai IC50 dibuat
lima konsentrasi berseri, yaitu 500 µg/mL,
250 µg/mL, 125 µg/mL, 62.5 µg/mL, dan
31.25 µg/mL pada ekstrak daun sukun.
Begitupun, untuk senyawa dibuat lima
konsentrasi berseri, yaitu 500 µM, 250 µM,
125 µM, 62.5 µM, dan 31.25 µM.
Senyawa pembanding atau kontrol positif
menggunakan doxorubicin, dibuat dengan
konsentrasi berseri pula, yaitu 1 µM, 0.5 µM,
0.25 µM, 0.125 µM, dan 0.0625 µM.
Konsentrasi yang diperlukan untuk uji induksi
apoptosis dengan flow cytomtery adalah 100
µg/mL perlakuan ekstrak dan 100 µM
perlakuan senyawa flavonoid daun sukun,

8

serta doxorubicin 1 µM. Penentuan nilai
konsentrasi pada flow cytometry berdasarkan
daya penghambatan yang dimungkinkan pada
uji sel hidup dan rataan tengah dari range
konsentrasi perlakuan.
Uji Sitotoksik
Pengujian sitotoksik pada umunya
menggunakan uji MTT untuk menentukan
efektivitas suatu sampel pada sel T47D
dengan parameter nilai IC50. Kultur sel T47D
yang telah tumbuh dan berkembang sangat
banyak dipanen dan sel dipindahan dengan
konsentrasi 5x104 sel/sumur ke dalam wadah
96-sumur (Nunclon). Kultur sel diinkubasi
selama 24 jam untuk adaptasi. Tiap sumuran
kultur sel ditambahkan DMSO, media, dan
sampel sebanyak 1 μL dengan konsentrasi
berbeda, lalu inkubasi kembali selama 24 jam.
Media kultur yang mengandung sampel
dibuang dan dicuci dengan larutan PBS,
kemudian dalam kondisi gelap ditambahkan
100 μL media kultur yang mengandung MTT
[3(4,5-dimetiltiazol
-2-il)-2,5
difeniltetrazolium
bromida].
Wadah
diinkubasi kembali selama 2-4 jam pada suhu
37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan
MTT membentuk kristal formazan berwarna
ungu. Setelah 2-4 jam, media yang
mengandung MTT dibuang (diambil secara
hati-hati menggunakan mikropipet) kemudian
ditambahkan 100 μL DMSO untuk
melarutkan kristal formazan. Wadah digoyang
di atas shaker selama 10 menit kemudian
dibaca absorbannya dengan spektrofotometri
pada panjang gelombang 515 nm. Data yang
ditunjukkan dalam absorban dan dihitung
persen sel hidup (%), kemudian dianalisis
dengan menghitung konsentrasi media
hambatan dari 50% proliferasi sel (IC50)
dengan Microsot Excel (Arung et al. 2009).
Analisis Siklus Sel dengan Flow Cytometry
Kultur sel dimasukkan pada wadah 24sumur dengan konsentrasi 25x104 sel/sumur
dan inkubasi selama 24 jam. Media kultur
dalam wadah 24-sumur dibuang dan diganti
dengan media kultur baru serta sampel 5 uL,
DMSO atau hanya media saja, Sel hasil
perlakuan ditampung dalam tabung flow
cytometer
dan
disentrifugasi
dengan
kecepatan 1500 rpm selama 5 menit,
kemudian supernatannya dibuang. Sel
difiksasi dengan 500 µL etanol 70% dingin,
disimpan dalam suhu 4oC selama 15 menit
dan disentrifugasi kembali selama 5 menit,
kemudian supernatannya dibuang kembali.
Pelet sel disuspensikan dengan 900 µL PBS

dan 100 µl Propidium Iodida (Sigma P3566),
pewarna analisis kandungan DNA, lalu
dihomogenkan. Sel yang telah tersuspensi
diinkubasi dalam gelap selama 30 menit dan
dianalisis siklus sel dengan flow cytometry
(Arung et al. 2009).
Analisis Statistik
Data yang diperoleh berupa absorban
masing-masing sumur dikonversi ke dalam
persen sel hidup menggunakan rumus:
absorban sampel – absorban media
=
x 100%
absorban normal – absorban media
Nilai IC50 dilihat dari uji sel hidup dengan
metode
MTT
dan
dikalkulasikan
menggunakan analisis regresi linear pada
Microsoft Excel. Analisis statistik untuk
perbandingan antara sel yang diberi perlakuan
dan tidak diberi perlakuan dilakukan uji
statistiknya menggunakan uji T. Analisis data
untuk uji T dilakukan menggunakan
Microsoft Excel. Jika rataan normal lebih
besar dari rataan sampel dengan p 0,05 maka
terjadi perbedaan yang dianggap statistik
signifikan (Walpole 1993).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Sitotoksik
Hasil uji sitotoksik dengan metode MTT
secara visual dapat dilihat pada Gambar 9. Sel
kanker normal tanpa perlakuan pada gambar
ditunjukkan dengan warna ungu pekat dan
kontrol positif (doxorubicin) berwarna ungu
yang sangat pudar. Hal tersebut menunjukkan
bahwa dalam sel normal telah terjadi reduksi
garam tetrazolium menjadi kristal formazan
ungu, sedangkan pemberian doxorubicin tidak
memperlihatkan
hal
tersebut
yang
menunjukkan sel telah mati.
Perlakuan dengan sampel daun sukun,
baik ekstrak dan senyawa memperlihatkan
warna yang bervariasi. Sampel yang memiliki
potensi penghambatan sel T47D oleh ekstrak
daun sukun adalah ekstrak heksana, terlihat
dengan warna ungu yang sangat pudar hampir
bening. Ekstrak etanol, ekstrak etil asetat, dan
ekstrak butanol secara visual tidak
menunjukkan efek sitotoksiknya dan pada
Gambar 9 memperlihatkan warna ungu yang
bervariasi pula pada tiap konsentrasi dan tiap
pengulangan. Hasil sitotoksik senyawa
flavonoid daun sukun yang berpotensi
menghambat sel T47D adalah AC-3-1 dengan
perubahan warna larutan ungu pudar
(Lampiran 5). Wadah kultur sel senyawa,
warna ungu yang terlihat pada sampel

9

Sampel Ekstrak
Etanol

Heksan

EtAC

Butanol
Konsentrasi
(dari atas ke
bawah) dari
tinggi ke
rendaah

Doxorubicin
Konsentrasi
(dari kiri ke
kanan) dari
tinggi ke
rendah

Normal
DMSO
Blanko

Gambar 9 Hasil uji sitotoksik dengan metode MTT-assay secara kualitatif.
senyawa tersebar rata pada semua konsentrasi
kecuali pada senyawa AC-3-1.
Penentuan utama hasil uji sitotoksik
adalah untuk menghitung nilai IC50 dari
penggunaan metode MTT-assay. Sebelum
perhitungan nilai IC50, penggunaan DMSO
dalam melarutkan sampel harus dilihat
pengaruhnya terhadap perlakuan normal
dengan menggunakan analisis statistik (uji T).
Hasil uji T dari perbandingan nilai absorban
normal dan DMSO menunjukkan bahwa
DMSO yang memiliki sifat semipolar tidak
berpengaruh signifikan terhadap perlakuan
normal dengan nilai p=0.24, jika p 0.05
terdapat beda yang signifikan pada pelarut dan

dapat mempengaruhi kerja dari sampel secara
utuh (Walpole 1993).
Nilai absorban perlakuan sampel daun
sukun dari tiga kali ulangan dengan
konsentrasi yang berseri dirata-ratakan,
kemudian dihitung persen sel hidupnya. Tabel
1 menunjukkan persen sel hidup ekstrak daun
sukun dan yang berpotensi terbaik untuk
sitotoksisitas adalah ekstrak heksana. Pada
konsentrasi 62.5 µg/mL ekstrak heksana
mampu mendekati 50% penghambatan sel
T47D sebesar 43.91% atau persen sel hidup
sebesar 56.09%. Ekstrak lainnya, seperti
ekstrak etanol, ekstrak etil asetat, dan ekstrak
butanol belum mampu memperlihatkan

Tabel 1 Hasil uji sitotoksik ekstrak daun sukun (Artocarpus altilis) terhadap sel T47D
Sampel
Konsentrasi
Rata-rata Persen Sel hidup IC50 (µg/mL)
(µg/mL)
(%)
Ekstrak Etanol
500
79.707
250
108.184
125
112.675
575.74 ± 44.559
62.5
146.673
31.25
137.558
Ekstrak Heksana
500
9.248
250
10.246
61.02 ± 31.82
125
20.160
62.5
56.088
31.25
65.735
Ekstrak Etil Asetat
500
69.494
250
64.371
264.67 ± 86.38
125
92.482
62.5
103.826
31.25
115.835
Ekstrak Butanol
500
70.825
250
100.865
482.55 ± 77.95
125
121.723
62.5
163.606
31.25
118.130

10

penghambatan 50% proliferasi sel. Pada
konsentrasi 500 µg/mL. ekstrak etanol hanya
mampu menghambat 20.30%. ekstrak etil
asetat 30.51%. dan ekstrak butanol 29.18%.
Ekstrak etanol merupakan tahapan awal
proses ekstraksi dan purifikasi sampel
(Lampiran 3) sehingga sampel masih ekstrak
kasar dan belum menunjukkan spesifikasi
dalam membantu penghambatan sel T47D.
Persentase sel hidup pada masing-masing
konsentrasi dikonversikan dalam persamaan
linear untuk mendapatkan nilai IC50. Nilai
IC50 yang tertera pada Tabel 1 menunjukkan
bahwa ekstrak heksana dengan kemampuan
penghambatan mendekati 50% proliferasi sel
memperoleh konsentrasi penghambatan 61.01
± 31.82 µg/mL. Ekstrak etanol dan ekstrak
butanol terlihat memiliki nilai IC50 yang tinggi
dan berada di luar rentang konsentrasi
perlakuan (31.25 µg/mL-500 µg/mL) yang
menunjukkan ekstrak tersebut tidak toksik.
Kemampuan ekstrak etil asetat dibandingkan
dengan ekstrak etanol dan ekstrak butanol
diduga masih memiliki kemampuan sebagai
sitotoksik dilihat dari daya hambat proliferasi
selnya mendekati 50%. walaupun konsentrasi
yang diperoleh 264.67 ± 86.38 µg/mL.
Sehingga pada penelitian ini. ekstrak heksana
pada sampel ekstrak daun sukun memiliki
potensi tinggi dalam menghambat sel T47D.
Identifikasi tanaman sukun telah dilakukan
sampai pada pemurnian senyawa. Penelitian
yang dilakukan Syah (2005). pada bagian

daun sukun diidentifikasi terdapat sekitar
tujuh senyawa. Salah satunya terdapat
senyawa AC-5-1. senyawa AC-3-1. dan
senyawa siklokomunol. Senyawa daun sukun
tersebut berasal dari hasil isolasi ekstrak etil
asetat yang mempunyai turunan flavonoid
tergeranilasi jenis dihidrokhalkon dan
prenilflavon (Syah 2005. Indraswati 2009. &
Mulyati 2009). Ketiga senyawa ini dipilih
dalam penelitian karena memiliki aktivitas
biologis sebagai antitumor/antikanker. Selain
itu. senyawa siklokomunol telah diidentifikasi
memiliki efek sitotoksik pada sel leukimia
(Syah 2005).
Persen sel hidup pada Tabel 2
menunjukkan bahwa senyawa AC-5-1
memiliki kemampuan penghambatan pada
konsentrasi 500 µM dengan persen sel hidup
sebesar
46.51%
atau
penghambatan
proliferasi sel sebesar 53.49%. Senyawa AC3-1 memperoleh persen penghambatan
proliferasi sel 74.39% dengan persen sel hidup
sebesar 25.61% pada konsentrasi perlakuan
125 µM. Sedangkan. senyawa si

Dokumen yang terkait

Sitotoksisitas Ekstrak dan Senyawa Flavonoid Daun Sukun (Artocarpus altilis) Terhadap Sel T47D Melalui Induksi Apoptosis