BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat – Alat
1. Gelas ukur 50 ml100 ml
Pyrex 2. Gelas Beaker
250 ml1000 ml Pyrex
3. Gelas Erlenmeyer 250 ml
Pyrex 4. Corong kaca
5. Corong pisah 500 ml
Pyrex 6. Bejana Maserasi
10 l Schott Duran
7. Kolom kromatografi Pyrex
8. Tabung reaksi Pyrex
9. Plat tetes 10. Rotari evaporator
Büchi R-114 11. Statif dan klem
12. Lampu UV 254 nm 356 nm
UVGL 58 13. Batang pengaduk
14. Alat Pengukur Titik Lebur Fisher
15. Neraca analitis Mettler AE 200
16. Pipet tetes 17. Penangas air
Büchi B-480 18. Botol vial
19. Bejana Kromatografi Lapis Tipis 20. Spektrofotometer FT-IR
Shimadzu 21. Spektrometer
1
22. Spektrofotometer UV-Visible H-NMR
DELTA2-NMR
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.2 Bahan-Bahan
1. Kulit batang tumbuhan petai cina L. glauca L.
2. Metanol Me-OH Teknis
3. N-heksana Teknis
4. Etil asetat EtOAc Teknis
5. Aquadest 6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM
E.Merck. KGaA 7. FeCl
3
8. NaOH 10 5
9. Mg-HCl 10. H
2
SO 11. Silika gel 60 F
4p 254
12. Kapas untuk plat
E.Merck.Art 554
13. Aluminiun Foil 7,6m x 300 mm
Total Wrap
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit batang tumbuhan petai cina yang diperoleh dari daerah
Sabulan, Kecamatan Sitio – tio, Kabupaten Samosir, Sumareta Utara. Kulit batang tumbuhan
petai cina dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk kulit batang
tumbuhan petai cina sebanyak 3000 g.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Kulit Batang Tumbuhan Petai Cina
Serbuk kulit batang tumbuhan petai cina diidentifikasi dengan menggunakan cara:
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
- Skrining fitokimia
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit batang tumbuhan petai cina, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
Prosedur :
- Dimasukkan ± 10 gram serbuk kulit batang petai cina L. glauca L. yang telah
dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer - Ditambahkan metanol ± 100 ml
- Didiamkan - Disaring
- Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl
3
b. Tabung II : dengan H
5 menghasilkan larutan berwarna hitam
2
SO
4p
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda menghasilkan larutan orange kekuningan
d. Tabung IV : dengan NaOH 10 menghasilkan larutan berwarna biru violet
3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Kulit Batang Tumbuhan Petai Cina L. glauca L.
Serbuk kulit batang tumbuhan petai cina ditimbang sebanyak 3000 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10L sampai semua sampel terendam dan
dibiarkan selama ± 3 hari. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan
hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian
dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana.
Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 6,55 g.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis KLT
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang
digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ;
60:40 vv.
Prosedur:
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat 90:10vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada
plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi
dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan
yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20vv; 70:30vv; dan 60:40vv.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam kulit batang tumbuhan petai cina terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada
fase gerak n-heksana : etil asetat 60:40vv LAMPIRAN C.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan 90:10 vv, 80 : 20 vv, 70:30vv, dan 60:40 vv.
Prosedur :
Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk hingga homogen lalu
dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n- heksan 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 6,55 g ekstrak
metanol kulit batang petai cina ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat 90:10vv secara
perlahan-lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan
menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan 80:20vv, 70:30vv, dan 60:40vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 12
ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk kristal.
3.3.6 Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom harus dimurnikan.
Prosedur :
Kristal yang diperoleh dilarutkan kembali dengan etil asetat, diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan–lahan
hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari kristal hingga diperoleh
kristal yang benar – benar bebas dari pelarut.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat 60:40 vv.
Prosedur :
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT.
Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari
bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa
flavonoida.
3.3.8 Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat pengukur titik lebur, diatur suhu. Lalu diamati suhu sampai kristal melebur.
3.3.9 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 3.3.9.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan metanol sebagai pelarut.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.3.9.2. Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H- NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan aseton sebagai pelarut.
3.3.9.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
Kategori