Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006
USU Repository ©2006
7
2.2.3 Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur
Suatu senyawa bahan alam hasil isolasi akan diidentifikasi berdasarkan kimia, fisika dan identifikasi dengan spektroskopi. Dari isolasi yang dengan menggunakan metoda standar
tidak semua senyawa akan secara utuh seperti yang terdapat dalam tumbuhan tersebut, karena sebagian senyawa ada yang terlarut dan terpecah selama proses isolasi dan hasil terjadi seperti
putusnya ikatan glikosida membentuk aglikon dan gula dengan adanya air. Identifikasi senyawa metabolit sekunder dan elusidasi struktur senyawa ditemukan
merupakan pekerjaan yang sangat menentukan dalam proses mengenal, mengetahui dan pada akhirnya menetapkan rumus molekul yang aebenarnya dari senyawa tersebut.
Diantara metode identifikasi dan elusidasi struktur yang diperoleh dapat dilakukan dengan metoda standar yang sudah dikenal untuk menentukan senyawa kimia dan termasuk
derivat-derivatnya antara lain : Silverstein, 1991 1. Metoda Spektroskopi
Metoda spektroskopi saat ini sudah merupakan metoda standar dalam penentuan struktur senyawa organik pada umumnya dan senyawa metabolit
sekunder pada khususnya. Metoda tersebut terdiri dari beberapa peralatan dan mempunyai hasil pengamatan yang berbeda, yaitu
a. Spektroskopi UV Merupakan metoda yang akan memberikan informasi adanya kromofor dari senyawa
organik dan membedakan senyawa aromatik atau senyawa ikatan rangkap yang berkonjugasi dengan senyawa alifatik rantai jenuh.
b. Spektroskopi IR Metoda yang dapat menentukan serta mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat
dalam senyawa organik, yang mana gugus fungsi dari senyawa organik akan dapat ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom dan merupakan bilangan frekuensi yang
spesifik. c. Nuklir Magnetik Resunansi Proton Metoda ini akau mengetahui posisi atom-atom
karbon yang mempunyai proton atau tanpa proton. Disamping itu akan dikenal atom-atom lainnya yang berkaitan dengan proton
d. Nuklir Magnetik Kesonansi Isotop Karbon 13
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006
USU Repository ©2006
8 Digunakan untuk mengetahui jumlah atom karbon dan menentukan jenis atom karbon
pada senyawa tersebut. e. Spektroskopi massa
mengetahui berat molekul senyawa dan ditunjang dengan adanya fragmentasi ion molekul yang menghasilkan pecahan-pecahan spesifik untuk suatu senyawa
berdasarkan mz dari masing-masing fragmen yang terbentuk. Terbentuknya fragmen-framen dengan terjadinya pemutusan ikatan apabila disusun kembali akan
dapat menentukan kerangka struktur senyawa yang diperiksa. 2. Kromatografi
Penggunaan kromatografi sangat membantu dalam pendeteksian senyawa metabolit sekunder dan dapat dijadikan sebagai patokan untuk proses pengerjaan berikutnya dalam
menentukan struktur senyawa. Berbagai jenis kromatografi yang umum digunakan antara lain Darwis.D,2000
a. Kromatografi Lapisan Tipis KLT Merupakan salah satu metoda identifikasi awal untuk menentukan kemurnian
senyawa yang ditemukan atau dapat menentukaan jumlah senyawa dari ekstrak kasar metabolit
sekunder.. Cara ini sangat sederhana dan merupakan suatu pendeteksian awal dari basil isolasi.
b. Kromatografi Kolom Digunakan untuk pemisahan campuran beberapa senyawa yang diperoleh dari isolasi
tumbuhan. Dengan menggunakan fasa padat dan fasa cair maka fraksi-fraksi senyawa akan menghasilkan kemurnian yang cukup tinggi.
c. Kromatografi Gas Pemisahan campuran senyawa yang cukup stabil pada pemanasan, karena
sampelyangdigunakan akan dirobah menjadi fasa gas dan dengan adanya perbedaan keterikatan senyawa pada fasa padat yang digunakan terhadap senyawa organik sehingga
terjadi pemisahan musing-musing senyawa dari campurannya. d. Kromatografi Cair
Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006
USU Repository ©2006
9 Lebih dikenal dengan HPLC High Pressure Liquid Chromatography dan lebih dari 75
dari pemakaiaan HPLC menggunakan fasa padat ODS Oktadesil Sifane atau C-18 sedangkan fasa cair sebagai pefarut pembawa senyawa dapat diganti kepolarannya pada
saat digunakan dan kondisi seperti itu dikenal sebagai fasa gradien. Pada kondisi gradien, senyawa non polar akan diadsorpsi lebih lemah oleh fasa padat dan akan dielusi dengan
pelarut non polar dan sebaliknya senyawa polar akan diadsorpsi lebih kuat dan membutuhkan pelarut polar. Jika sampel mempunyai polaritas yang luas, pemisahan
harus dilakukan dengan merubah kepolaran pelarut yang digunakan. efisiensi penggunaan HPLC ditentukan dengan pengaturan dan penggunaan peralatan sebagai pembantu dalam
pemakaian HPLC.
2.3. Uji Bioaktifitas Senyawa Metabolit Sekunder