Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur

Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006 USU Repository ©2006 7

2.2.3 Identifikasi Senyawa dan Penentuan Struktur

Suatu senyawa bahan alam hasil isolasi akan diidentifikasi berdasarkan kimia, fisika dan identifikasi dengan spektroskopi. Dari isolasi yang dengan menggunakan metoda standar tidak semua senyawa akan secara utuh seperti yang terdapat dalam tumbuhan tersebut, karena sebagian senyawa ada yang terlarut dan terpecah selama proses isolasi dan hasil terjadi seperti putusnya ikatan glikosida membentuk aglikon dan gula dengan adanya air. Identifikasi senyawa metabolit sekunder dan elusidasi struktur senyawa ditemukan merupakan pekerjaan yang sangat menentukan dalam proses mengenal, mengetahui dan pada akhirnya menetapkan rumus molekul yang aebenarnya dari senyawa tersebut. Diantara metode identifikasi dan elusidasi struktur yang diperoleh dapat dilakukan dengan metoda standar yang sudah dikenal untuk menentukan senyawa kimia dan termasuk derivat-derivatnya antara lain : Silverstein, 1991 1. Metoda Spektroskopi Metoda spektroskopi saat ini sudah merupakan metoda standar dalam penentuan struktur senyawa organik pada umumnya dan senyawa metabolit sekunder pada khususnya. Metoda tersebut terdiri dari beberapa peralatan dan mempunyai hasil pengamatan yang berbeda, yaitu a. Spektroskopi UV Merupakan metoda yang akan memberikan informasi adanya kromofor dari senyawa organik dan membedakan senyawa aromatik atau senyawa ikatan rangkap yang berkonjugasi dengan senyawa alifatik rantai jenuh. b. Spektroskopi IR Metoda yang dapat menentukan serta mengidentifikasi gugus fungsi yang terdapat dalam senyawa organik, yang mana gugus fungsi dari senyawa organik akan dapat ditentukan berdasarkan ikatan dari tiap atom dan merupakan bilangan frekuensi yang spesifik. c. Nuklir Magnetik Resunansi Proton Metoda ini akau mengetahui posisi atom-atom karbon yang mempunyai proton atau tanpa proton. Disamping itu akan dikenal atom-atom lainnya yang berkaitan dengan proton d. Nuklir Magnetik Kesonansi Isotop Karbon 13 Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006 USU Repository ©2006 8 Digunakan untuk mengetahui jumlah atom karbon dan menentukan jenis atom karbon pada senyawa tersebut. e. Spektroskopi massa mengetahui berat molekul senyawa dan ditunjang dengan adanya fragmentasi ion molekul yang menghasilkan pecahan-pecahan spesifik untuk suatu senyawa berdasarkan mz dari masing-masing fragmen yang terbentuk. Terbentuknya fragmen-framen dengan terjadinya pemutusan ikatan apabila disusun kembali akan dapat menentukan kerangka struktur senyawa yang diperiksa. 2. Kromatografi Penggunaan kromatografi sangat membantu dalam pendeteksian senyawa metabolit sekunder dan dapat dijadikan sebagai patokan untuk proses pengerjaan berikutnya dalam menentukan struktur senyawa. Berbagai jenis kromatografi yang umum digunakan antara lain Darwis.D,2000 a. Kromatografi Lapisan Tipis KLT Merupakan salah satu metoda identifikasi awal untuk menentukan kemurnian senyawa yang ditemukan atau dapat menentukaan jumlah senyawa dari ekstrak kasar metabolit sekunder.. Cara ini sangat sederhana dan merupakan suatu pendeteksian awal dari basil isolasi. b. Kromatografi Kolom Digunakan untuk pemisahan campuran beberapa senyawa yang diperoleh dari isolasi tumbuhan. Dengan menggunakan fasa padat dan fasa cair maka fraksi-fraksi senyawa akan menghasilkan kemurnian yang cukup tinggi. c. Kromatografi Gas Pemisahan campuran senyawa yang cukup stabil pada pemanasan, karena sampelyangdigunakan akan dirobah menjadi fasa gas dan dengan adanya perbedaan keterikatan senyawa pada fasa padat yang digunakan terhadap senyawa organik sehingga terjadi pemisahan musing-musing senyawa dari campurannya. d. Kromatografi Cair Sofia Lenny: Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah dengan Metoda Uji Brine Shrimp, 2006 USU Repository ©2006 9 Lebih dikenal dengan HPLC High Pressure Liquid Chromatography dan lebih dari 75 dari pemakaiaan HPLC menggunakan fasa padat ODS Oktadesil Sifane atau C-18 sedangkan fasa cair sebagai pefarut pembawa senyawa dapat diganti kepolarannya pada saat digunakan dan kondisi seperti itu dikenal sebagai fasa gradien. Pada kondisi gradien, senyawa non polar akan diadsorpsi lebih lemah oleh fasa padat dan akan dielusi dengan pelarut non polar dan sebaliknya senyawa polar akan diadsorpsi lebih kuat dan membutuhkan pelarut polar. Jika sampel mempunyai polaritas yang luas, pemisahan harus dilakukan dengan merubah kepolaran pelarut yang digunakan. efisiensi penggunaan HPLC ditentukan dengan pengaturan dan penggunaan peralatan sebagai pembantu dalam pemakaian HPLC.

2.3. Uji Bioaktifitas Senyawa Metabolit Sekunder