METODOLOGI PENELITIAN

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Penelitian ini menggunakan metode eksperimental dalam laboratorium. Isolasi senyawa serbuk buah gambas dilakukan dengan metode ekstraksi maserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol yang didapatkan dilakukan pengujian aktivitas antibakteri. Ekstrak metanol diekstraksi bertahap berturut- turut menggunakan pelarut yang tingkat kepolarannya meningkat, yaitu heksana, kloroform, etil asetat dan butanol. Ekstrak hasil ekstraksi bertahap kemudian dilakukan pengujian aktivitas antibakteri. Terhadap ekstrak antibakteri kemudian dilakukan penapisan fitokimia dan ekstrak antibakteri tertinggi dilakukan uji penegasan golongan senyawa dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan penentuan KHM ekstrak serta nilai banding ekstrak terhadap ampisilin.

B. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Organik dan Biokimia, Pusat penelitian Kimia LIPI, Bandung, Sub Lab Biologi Laboratorium Pusat Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sebelas Maret, Surakarta dari bulan Januari 2008-Januari 2009.

C. Alat dan Bahan 1.Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven (Memmert Modell 500), mesin penggiling, neraca timbang (Denver TL603D dan Scout Pro/ohaus), statif dan klem, pelubang dengan diameter 6 mm, penguap vakum putar (Bibby RE 200B), corong pisah, bejana KLT, hotplate-stirer (RCT Basic Labortechnik), pendeteksi UV (PUV/BDH), penangas air, autoklaf (Presoclave 75 P-Selecta), botol semprot, handmixer (Vortec mixer VM 300), pembakar spirtus, mikropipet 10-100 μ L,100-1000 μ L (Micropipette), jarum ose, cawan petri, Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven (Memmert Modell 500), mesin penggiling, neraca timbang (Denver TL603D dan Scout Pro/ohaus), statif dan klem, pelubang dengan diameter 6 mm, penguap vakum putar (Bibby RE 200B), corong pisah, bejana KLT, hotplate-stirer (RCT Basic Labortechnik), pendeteksi UV (PUV/BDH), penangas air, autoklaf (Presoclave 75 P-Selecta), botol semprot, handmixer (Vortec mixer VM 300), pembakar spirtus, mikropipet 10-100 μ L,100-1000 μ L (Micropipette), jarum ose, cawan petri,

2.Bahan

a. Bahan yang Diteliti Bahan yang diteliti adalah buah gambas yang dibeli dari pasar Legi, Solo.

b. Bahan yang Digunakan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain metanol (Bratachem), heksana (Bratachem), etil asetat (Bratachem), butanol (E. Merck), kloroform (E. Merck), aseton (Bratachem) dan aquadest. Dimetil Sulfoksida (DMSO), alkohol 70%, etanol absolut (Pro-Analisis) serbuk vanillin (pro-Analisis), Nutrient Agar (NA) (E. Merck), ampisilin (yang diperoleh dari Universitas Setia Budi, Solo), serbuk NaCl dan plat KLT silika gel 60 GF 254 (E. Merck),

HCl pekat, serbuk FeCl 3 ,H 2 SO 4 pekat, serbuk KI, serbuk AlCl 3 , serbuk NaCl, serbuk SbCl 3 , iodine dan gelatin.

c. Bakteri Uji Bakteri uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah E. coli FNCC 0091, B. subtilis FNCC 0059, S. aureus FNCC 0047, P. aeruginosa FNCC 0063 dan S. thypi FNCC 0050 yang diperoleh dari PAU-UGM, Yogyakarta dan bakteri

E. aerogenes dan S. dysentriae dari LIPI, Bandung.

D. Bagan Alir Penelitian

(bagan alir penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.).

E. Prosedur Penelitian

a. Determinasi dan Preparasi Sampel

Buah gambas diideterminasi di Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Buah gambas dikupas, dicuci, diiris tipis-tipis, diangin- anginkan selama 12 jam dan dikeringkan dalam oven selama 3 hari dengan suhu oven 55°C. Bahan kering (simplisia) disimpan dalam wadah tertutup.

b. Maserasi Simplisia.

Simplisia yang telah kering digiling dengan penggiling manual. Serbuk yang didapatkan diekstraksi dengan metode maserasi (perendaman bahan) menggunakan metanol selama 1 x 24 jam dan 3 x 30 jam dengan perincian metanol yang digunakan 2,5 L, 850 mL, 990 mL dan 600 mL. Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan secara vakum menggunakan penguap vakum putar dengan suhu 40°C sehingga dihasilkan ekstrak metanol pekat.

c. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol Ekstrak metanol dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan Metode difusi lubang dengan tahap kerja sebagai berikut :

a. Steril Alat yang Digunakan untuk Pengujian Antibakteri Semua alat seperti cawan petri, pelubang, spatula logam, jarum ose, tempat sampel dan peralatan gelas yang lainya yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.

b. Pembuatan Media Media yang digunakkan adalah Nutrient Agar (NA) (E. Merck) dengan kandungan bahan per Liter adalah pepton 5 g, ekstrak daging 3 g dan agar

12 g. NA ditimbang sebanyak 20 g kemudian dilarutan dalam 1 L aquadest, dipanaskan di atas hotplate-stirer sampai mendidih dan terbentuk larutan agar yang berwarna bening. Larutan agar tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 mL untuk agar miring dan ke dalam botol kaca tertutup sebanyak 15 mL untuk pengujian antibakteri. Tabung dan botol yang berisi agar disterilkan memakai autoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit.

c. Penyediaan Bakteri Uji Bakteri uji ditanam pada agar miring dan diinkubasi pada suhu 37°C selama

20 jam, lalu disuspensikan ke dalam 3 mL aquadest steril.

d. Perhitungan Bakteri Uji Perhitungan bakteri uji dilakukan dengan metode total plate count (TPC) yaitu dengan mengencerkan 1 mL suspensi yang telah dibuat diencerkan ke dalam

9 mL aquadest steril, sehingga didapatkan suspensi 10 mL dan didapatkan perbandingan hasil pengenceran 1:10. Suspensi 10 mL diambil 1 mL kemudian diencerkan lagi ke dalam 9 ml aquadest steril dengan perbandingan pengenceran 1:100. Perlakuan diulang sampai suspensi tidak begitu keruh. Seri suspensi yang didapat masing-masing diambil 100 μ L kemudian dimasukkan ke permukaan agar pada masing-masing cawan petri dan diratakan. Cawan petri di inkubasi selama 20 jam. Kemudian dilakukan perhitungan dengan total plate count (TPC) dan jumlah yang boleh digunakan adalah yang masuk ke dalam range : 30-300 koloni bakteri (Tortora et al., 2007).

e. Pengujian Aktivitas Antibakteri Suspensi bakteri sebanyak 100 μ L dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan 15 mL NA steril dalam keadaan hangat, digoyang supaya bakteri dan agar tercampur secara homogen kemudian didiamkan sampai agar memadat. Agar padat tersebut dibuat lubang-lubang menggunakan pelubang dengan diameter 6 mm dengan jarak antar lubang yang sama, lalu dimasukkan larutan ekstrak dengan konsentrasi tertentu (b/v) dan larutan kontrol negatif (DMSO) ke dalam tiap-tiap lubang sebanyak 20 μ L dengan menggunakan mikropipet. Cawan kemudian diinkubasi di dalam inkubator bersuhu 37°C selama 20 jam, setelah lewat masa inkubasi dengan menggunakan jangka sorong diukur diameter hambat yang terbentuk berupa daerah bening sekeliling lubang sebagai parameter untuk menentukan besarnya aktivitas antibakteri dari ekstrak yang diuji.

f. Penyediaan Standart Pembanding Ampisilin Sebanyak 100 mg ampisilin dilarutkan dalam 10 mL DMSO. Larutan ini merupakan larutan ampisilin 0,01 mg/μ L. Larutan tersebut diambil menggunakan mikropipet dan dengan metode pengenceran dibuat berbagai variasi konsentrasi standart ampisilin yang diinginkan.

4. Ekstraksi Bertahap Ekstrak Metanol

Ekstrak metanol sebanyak 152,55 g ditambah 200 mL pelarut metanol- air dengan perbandingan 4:1 yaitu dengan melarutkan ekstrak ke dalam 150 mL metanol dan 50 mL aquadest, kemudian larutan diekstraksi dengan 300 mL heksana dalam corong pisah, lapisan atas (heksana) dipekatkan dengan penguap vakum putar dengan suhu 40°C sehingga dihasilkan ekstrak heksana. Lapisan bawah kemudian diekstraksi dengan kloroform sebanyak 300 mL, lapisan bawah (kloroform) diuapkan dengan penguap vakum putar dengan suhu 40°C sehingga diperoleh ekstrak kloroform. Lapisan atas diekstraksi dengan etil asetat sebanyak 300 mL, lapisan atas (etil asetat) diuapkan dan diperoleh ekstrak etil asetat. Lapisan bawah diekstraksi kembali dengan butanol sebanyak 150 mL, lapisan atas (butanol) diuapkan sehingga dihasilkan ekstrak butanol, sedangkan lapisan bawah (air) dipekatkan dan didapatkan ekstrak air. Setiap ekstraksi dibagi menjadi beberapa corong pisah dengan volume total 100 mL untuk setiap corong pisah.

5. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Hasil Ekstraksi Bertahap Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak hasil ekstraksi bertahap sama seperti pengujian yang dilakukan pada ekstrak metanol.

6. Pengujian Golongan Senyawa yang Bersifat Antibakteri Pengujian kualitatif golongan senyawa dilakukan dengan penapisan fitokimia dan uji penegasan golongan senyawa dengan KLT. Penapisan fitokimia dilakukan untuk ekstrak antibakteri yaitu pengujian terhadap golongan senyawa alkaloid, saponin, tanin dan polifenol, flavonoid, terpenoid dan fenolat. Uji penegasan golongan senyawa dilakukan terhadap ekstrak antibakteri tertinggi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Metode penapisan fitokimia yang digunakan berdasarkan Pedrosa et al. (1978); Farnsworth (1966); Harborne. (1996).

A. Pembuatan reagen

1. FeCl

3 1% : FeCl 3 sebanyak 1 g dilarutkan dalam 100 ml aquadest.

2. Larutan gelatin : Gelatin sebanyak 1 g dilarutkan ke dalam 100 ml aquadest panas sambil diaduk.

3. NaCl 10% : NaCl sebanyak 10 g dilarutkan ke dalam 100 ml aquadest.

4. AlCl 3 1% : AlCl 3 sebanyak 0,1 g dilarutkan ke dalam 10 ml etanol absolut.

5. Penyemprot Vanillin–H 2 SO 4 : (i) 5% H 2 SO 4 dalam etanol, (ii) 1% vanilin dalam etanol. Plat disemprot larutan (i) kemudian larutan (ii).

6. Pereaksi Wagner : KI sebanyak 2 g dan iodine sebanyak 1,27 g dilarutkan ke dalam aquadest sampai volumenya 100 ml, kemudian disimpan dalam botol gelap.

7. SbCl 3 20% dalam kloroform : 2 g serbuk SbCl 3 dilarutkan dalam 10 mL

kloroform.

8. HCl 2 M : 16,5 ml HCl pekat dilarutkan ke dalam aquadest sampai volume 100 mL

B. Pengujian golongan senyawa

1. Pengujian alkaloid Ekstrak diambil sedikit, ditambah dengan HCl 2M dan dipanaskan diatas tangas air sambil diaduk, kemudian didinginkan hingga suhu ruang. NaCl serbuk ditambahkan, diaduk dan disaring, kemudian filtrat ditambah HCl 2M hingga volume tertentu. Filtrat dibagi ke dalam 2 tabung reaksi, tabung 1 ditambah dengan reagen Wagner dan tabung 2 sebagai blangko. Tabung 1 diamati terbentuknya endapan dan dibandingkan dengan larutan blangko pada tabung 2. Jika tidak terbentuk endapan, bahan tidak mengandung alkaloid dan jika terbentuk endapan, bahan mengandung alkaloid (Pedrosa et al., 1978).

2. Pengujian saponin Diambil 1 mg ekstrak dan dimasukan dalam tabung reaksi. Ekstrak ditambah aquadest dengan perbandingan 1 mg ekstrak : 1 μ L aquadest, kemudian dikocok dan didiamkan. Jika terbentuk buih yang tidak 2. Pengujian saponin Diambil 1 mg ekstrak dan dimasukan dalam tabung reaksi. Ekstrak ditambah aquadest dengan perbandingan 1 mg ekstrak : 1 μ L aquadest, kemudian dikocok dan didiamkan. Jika terbentuk buih yang tidak

3. Pengujian flavonoid Ekstrak ditambah heksana dan diaduk, kemudian fase heksana dihilangkan. Perlakuan diulang sampai larutan heksana tidak berwarna. Residu dilarutkan dengan etanol absolut dibagi menjadi 2 tabung, tabung 1 sebagai blangko dan tabung 2 untuk uji. Tabung 2 ditambah dengan 2 tetes HCl pekat, diamati warna yang terjadi dan dibandingkan dengan blangko. Tabung 2 dihangatkan di atas penangas air selama 15 menit, kemudian diamati perubahan warna yang terjadi. Terbentuknya warna merah kuat atau violet, menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Pedrosa et al., 1978).

4. Pengujian Tanin dan Polifenol Ekstrak ditambah aquadest panas, kemudian diaduk dan didinginkan. Setelah itu lima tetes NaCl 10% ditambahkan kemudian diisaring. Filtrat dibagi 3 bagian, bagian A, B dan C. Filtrat A digunakan sebagai

blangko, ke dalam filtrat B ditambahkan 3 tetes pereaksi FeCl 3 dan ke dalam filtrat C ditambah larutan gelatin, kemudian diamati perubahan yang terjadi. Jika terbentuk endapan pada filtrat C maka terdapat tanin. Jika terbentuk warna hijau kehitaman pada fitrat B menunjukkan adanya tanin terhidrolisa, jika terbentuk warna hijau kecoklatan pada fitrat B menunjukkan adanya senyawa tanin terkondensasi dan terbentuk warna selain warna di atas menunjukkan adanya senyawa polifenol (Pedrosa et al. , 1978).

5. Terpenoid Ekstrak ditambah dengan vanilin dan H 2 SO 4 pekat. Terpenoid positif jika terjadi perubahan warna ungu (Farnsworth, 1966 dalam Yuliani, 2001).

6. Fenolat Ekstrak ditambah dengan larutan besi (III) klorida 1%. Fenolat positif jika terjadi perubahan warna hijau, merah ungu, biru/hitam (Harborne, 1996).

Ekstrak antibakteri tertinggi dilakukan uji penegasan dengan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Plat yang digunakan adalah silika gel 60 GF 254 dengan ukuran plat 7,5 х 1,25 cm dengan jarak tepi bawah dan tepi atas 1 cm. Ekstrak ditotolkan pada plat dan dielusi dengan pengembang campuran kloroform : etil asetat dengan perbandingan masing-masing 3:7, 1:1 dan 7:3. Hasil pemisahan dideteksi bercaknya dengan sinar tampak, sinar UV 365 nm dan 254 nm dan dicari pengembang yang dapat memisahkan dengan baik. Setelah mendapatkan pengembang dengan pemisahan yang baik, selanjutnya dilakukan uji kualitatif golongan senyawa dengan penyemprotkan reagen spesifik dan pengamatan bercak pada sinar tampak, UV 254 nm dan 365 nm. Reagen

penyemprot yang dipakai adalah AlCl 3 untuk senyawa flavonoid, SbCl 3 20% dalam klorofrom untuk senyawa saponin, Vanilin-H 2 SO 4 untuk senyawa terpenoid dan FeCl 3 untuk senyawa tanin dan fenolat.

7. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Terhadap Ekstrak

Antibakteri Tertinggi

Penetapan KHM ekstrak mempunyai tujuan untuk mengetahui kadar minimum ekstrak yang masih menimbulkan hambatan terhadap pertumbuhan bakteri. Metode yang digunakan sama seperti metode yang dipakai dalam pengujian aktivitas antibakteri ekstrak metanol yang membedakan adalah dalam uji KHM menggunakan berbagai konsentrasi sampel dengan variasi konsentrasi mulai dari 0 mg/μ L.

8. Penentuan KHM ampisilin dan Penentuan Nilai Banding Ekstrak Antibakteri

Tertinggi dengan Standart Ampisilin

Penentuan KHM dan uji banding ampisilin dilakukan dengan

membandingkan standart ampisilin konsentrasi 1,5 10 -6 mg/μ L, 7,6.10 mg/μ L,

3,8.10 -7 mg/μ L, 1,9.10 mg/μ L, 10 mg/μ L, 5.10 mg/μ L, 2,5.10 mg/μ L, 1,25.10 -7 mg/μ L dan 0 mg/μ L dengan ekstrak antibakteri tertinggi dengan

konsentrasi tertinggi pada penentuan KHM ekstrak dan pengujian dilakukan bersamaan. Metode pengujian yang digunakan sama seperti metode yang dipakai konsentrasi tertinggi pada penentuan KHM ekstrak dan pengujian dilakukan bersamaan. Metode pengujian yang digunakan sama seperti metode yang dipakai

F. Tehnik Pengumpulan dan Analisa Data

Penelitian ini menghasilkan berbagai data. Uji aktivitas antibakteri pada ekstrak dan ampisilin didapatkan data diameter hambat pada konsentrasi tertentu. Penapisan fitokimia didapatkan data golongan senyawa yang terdapat pada ekstrak. Analisa senyawa dengan metode KLT didapatkan penampakan sejumlah noda, harga Rf dan data golongan senyawa yang terdapat pada ekstrak. Uji penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) didapatkan data KHM. Uji banding aktivitas terhadap ampisilin didapatkan data nilai banding. Pengaruh variasi bakteri, variasi konsentrasi dan atau pengaruh variasi ekstrak dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji dianalisa dengan One-Way ANOVA dan uji lanjut dengan LSD dengan nilai p > 0,05 dianggap signifikan.